g-10葡聚糖凝胶色谱柱使用
SephadexG10凝胶色谱柱
Sephadex G10 凝胶色谱柱在药物质量控制中的应用（大连依利特公司应用实验室）1.前言目前国内外分离分析β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的主要方法是色谱法，应用的色谱分离模式包括反相、离子交换和凝集色谱等。
由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（如均为过敏性杂质），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。
因此根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法具有明显的优势。
在深入研究药物与葡聚糖凝胶相互作用及流动相对该作用影响的基础上，人们开发了葡聚糖凝胶Sephadex G-10为固定相的凝胶色谱模式，可以方便地用于各类β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的分离分析。
中华人民共和国药典2000版规定了采用Sephadex G-10色谱柱测定头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟和头孢曲松四种药物中高分子杂质的含量。
但是采用传统的玻璃低压凝胶色谱柱柱效非常低，很难达到药典规定的色谱柱的指标，同时该类色谱柱还由操作不方便、分离时间长、分离度差等不足。
针对上述问题，大连依利特公司在药典规定的基础上于2000年开发成功高效Sephadex G-10凝胶色谱柱，能够满足药典规定的四种药物中高分子杂质质量控制的需要。
2年来用户使用得到很好的效果。
2．药典规定用Sephades G-10色谱柱的分析方法描述中国药典2000版采用Sephadex G-10色谱柱分离表1所示的四种头孢化合物中的聚合物，定量方法均为自身对照外标法，药物对照品的分析采用相同的流动相条件（0.01％十二烷基硫酸钠溶液），但是样品的分析用流动相组成和盐的浓度不完全相同。
评价色谱柱柱效和拖尾因子均采用蓝色葡聚糖2000。
以下分别在上述条件下评价了依利特Sephadex G-10色谱柱的性能指标及其在药物分析中的应用谱图。
3．Sephadex G-10色谱柱的性能评价表2 在药典规定条件下蓝色葡聚糖2000评价色谱柱性能Sephadex G-10凝胶色谱柱能够分离分子量小于700的肽、蛋白及葡聚糖等高分子化合物。
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。
其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。
虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。
此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。
因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
5 Sephadex LH-20的步骤。
(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。
葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡
葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡
（1）柱材处理
称取一定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，
直到凝胶液中没有气泡出现为止。
（2）装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。
层析柱上端
进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。
（3）平衡
在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。
其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。
在本实验中，用0.002M Tris-HCL 缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝胶。
2．上样：将粗酶液上柱。
3．洗脱：用0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。
葡聚糖凝胶色谱柱
葡聚糖凝胶色谱柱概述葡聚糖凝胶色谱柱（dextran gel filtration column）是一种分离生物大分子的常见方法之一。
它是利用生物大分子在不同孔径的凝胶中的分布系数不同，实现分离的原理。
具体来说，大分子无法进入凝胶孔隙，因此在表面上滞留更长时间，而小分子能够进入凝胶孔隙，因此在表面上滞留时间更短，从而实现分离。
实验过程使用葡聚糖凝胶色谱柱进行分离实验的步骤如下： 1. 制备样品：将所需的大分子混合液或生物组织样品制备好。
2. 将样品滴到色谱柱顶部，并保持柱顶刚好覆盖样品。
3. 添加移液管中的洗脱液，并在细流下加缓冲液。
4. 在必要的时候，可以连续添加洗脱液、缓冲液和样品，直到滤出大分子为止。
5. 收集样品，并进行下一步实验。
应用领域葡聚糖凝胶色谱柱广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
常见的应用包括：1. 分离蛋白质：通过分离分子量不同的蛋白质来研究其结构和功能。
2. 分离核酸：通过分离不同长度的DNA片段和转录产物来研究基因的组成和调控机制。
3. 分离糖类：例如分离化合物，如淀粉和糖原，以研究其结构和功能。
4. 生物大分子纯化：通过纯化生物大分子（如酶和抗体）来研究其特性和应用。
常见问题解答葡聚糖凝胶色谱柱可以重复使用吗？可以。
只要正确使用和保持清洁，色谱柱可以反复使用多次，提供不断稳定的分离能力。
色谱柱如何保养？在每次使用后，应使用清洁试剂对色谱柱进行冲洗，以防止残留的生物大分子或洗脱液。
还应防止色谱柱干燥，避免损坏凝胶。
如何选择正确的分离柱？对于不同种类的分析样品，应选择不同孔径的凝胶柱。
一般来说，较小的分子要使用较小的孔径凝胶柱，而较大的分子要使用较大的孔径凝胶柱。
此外，应选择适当的缓冲液，以保证生物大分子的稳定性和稳定性。
总结葡聚糖凝胶色谱柱是一种有效的生物分离方法，具有广泛的应用领域，特别是在研究蛋白质、核酸和糖类方面。
正确选择和使用凝胶柱，以及正确维护和保养，可以确保稳定的分离效果。
凝胶色谱柱操作
凝胶色谱柱操作1、溶胀商品凝胶是干燥的颗粒，通常以40~63um 的使用最多。
凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天，如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2 小时。
凝胶的溶涨一定要完全，否则会导致色谱柱的不均匀。
热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。
2、装柱由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。
凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。
最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。
将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4 的高度。
柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。
最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。
3、柱均匀性检查凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。
由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。
也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。
4、上样凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。
凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。
为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。
样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。
凝胶色谱柱的使用
凝胶色谱柱的使用一、凝胶色谱柱的使用原理凝胶色谱柱的分离基于分子在柱中的扩散速率差异。
凝胶柱独特的孔隙结构可以使得较小的分子扩散速度更快，从而在柱中落后于分子较大的组分。
分离效果主要依赖于分子与凝胶孔隙的相互作用力，如尺寸排阻作用、电荷作用或亲疏水作用。
根据分子的大小、形状和性质，可以选择不同类型的凝胶色谱柱。
二、凝胶色谱柱的类型1. 托尔伯特柱（Tskgel）：是一种常见的高效凝胶色谱柱，适用于生物大分子的分离和纯化。
根据分子的大小选择不同的托尔伯特柱，包括S、M和G三个系列，具有不同的孔径和分离范围。
2. 超滤柱（Sephacryl）：适用于分子量小于2×10^7道尔顿的生物大分子的分离和纯化。
超滤柱具有较大的孔径，可以快速分离高分子量的物质。
3. 离子交换柱（DEAE Sepharose、CM Sepharose）：用于根据分子电荷选择或分离带有不同电荷的生物大分子。
正离子交换柱（DEAE Sepharose）适用于弱酸的分子，而负离子交换柱（CM Sepharose）适用于弱碱的分子。
4. 亲和层析柱（Protein A、G、L Sepharose）：利用生物大分子与固定在凝胶上的特定结合剂之间的亲和作用进行分离。
常用的亲和层析柱包括Protein A、G和L Sepharose，用于分离抗体或蛋白质。
三、凝胶色谱柱的优缺点1.分离效果好：凝胶柱的孔隙结构可以有效分离不同大小和性质的分子，保证高分离效率和纯度。
2.操作简便：凝胶柱操作相对简单，无需复杂的设备和耗时的准备工作。
3.适用广泛：凝胶柱适用于各种生物大分子的分离和纯化，如蛋白质、抗体、核酸等。
1.分离速度较慢：由于分子在凝胶柱中的扩散速率较慢，分离过程相对缓慢，需要较长的操作时间。
2.不能分离具有相似大小和性质的分子：如果要分离具有相似大小和性质的分子，凝胶柱的分离效果会较差。
四、凝胶色谱柱的实验操作步骤1.准备工作：如准备所需样品、试剂和凝胶柱。
葡聚糖凝胶G系列使用说明手册
葡聚糖凝胶使用说明Sephadex Gel Manuals1化学和物理性质葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。
G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。
葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。
葡聚糖凝胶有不同的粒度。
超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。
粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。
另外，粗级也可用于批量工艺。
1.1化学稳定性葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。
它在水、盐溶液、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。
长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。
1.2物理稳定性葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌。
干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。
葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。
2产品说明名称分离范围（球蛋白）应用葡聚糖凝胶G-10<700缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子葡聚糖凝胶G-15<1500缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子葡聚糖凝胶G-251000-5000工业上脱盐及交换缓冲液葡聚糖凝胶G-501000-30000多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定葡聚糖凝胶G-752000-70000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶G-1002000-120000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶G-1505000-300000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶G-2005000-600000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定3使用方法3.1乙醇浸泡在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干。
3.2无盐水浸泡室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀。
凝胶色谱柱的使用
凝胶色谱柱的使用凝胶色谱柱（Gel chromatography column），又称为凝胶过滤色谱柱，是一种常用于蛋白质和多肽分离纯化的柱层析技术。
它是根据溶质在凝胶颗粒孔隙和凝胶颗粒表面之间的扩散速率不同来实现分离的。
凝胶色谱柱由内核和包覆层构成。
内核是由纤维素、琼脂糖、琼脂和聚丙烯酰胺等材料制成的颗粒，颗粒大小一般在10-300微米之间。
内核是柱层析的主要分离介质，具有一定的孔隙结构，可以根据溶质的分子量来选择孔径大小。
包覆层是一层较细的凝胶层，在内核表面涂覆各种高分子材料，通过改变包覆层的化学性质，可以调控分离过程中的选择性和分离效果。
1.样品制备：准备待分离的样品溶液，通常需要用缓冲液进行稀释和调整pH值。
如果样品中含有高浓度的盐类或有机溶剂等，需要进行脱盐或柱外固相萃取处理。
2.样品加载：将样品溶液加载到凝胶色谱柱上，可以通过重力流动或使用泵进行加样。
3.柱洗脱：用缓冲液进行柱洗脱，一般要满足样品的最佳分离条件。
可以使用单一缓冲液或梯度洗脱，根据需要选择合适的洗脱方式。
4.收集分离物：根据需要，收集分离物进行后续分析或纯化。
1.蛋白质纯化：凝胶色谱柱可以根据蛋白质的分子量进行分离，常用于蛋白质的粗提和富集。
2.多肽纯化：凝胶色谱柱可以根据多肽的大小和亲水性进行分离，常用于多肽的富集和纯化。
3.药物研发：凝胶色谱柱可以用于药物分子的纯化和分析，有助于药物研发过程中的药物筛选和性质表征。
4.生物分析：凝胶色谱柱可以用于生物样品中复杂成分的富集和纯化，有助于生物样品的分析和研究。
1.分离效果好：凝胶色谱柱可以通过调控柱层析介质的孔隙大小和分离效果，达到较好的分离效果。
2.操作简单：凝胶色谱柱的操作相对简单，不需要复杂的设备和操作流程。
3.适用范围广：凝胶色谱柱适用于不同分子量和化学性质的样品，可以满足不同的纯化需求。
1.分离速度慢：由于样品分子需要通过凝胶层的扩散来实现分离，凝胶色谱柱的分离速度较慢。
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g-10葡聚糖凝胶色谱柱使用
G-10葡聚糖凝胶色谱柱是一种常用的分离和纯化生物大分子
的柱子，特别适用于分离寡聚糖和多糖混合物。
该柱子采用葡聚糖作为固定相，具有一定的孔隙大小和分子筛效果。
G-10葡聚糖凝胶色谱柱通常用于分离多糖、寡糖和其他大分
子化合物。
在使用之前，需要将柱子进行激活和平衡，具体步骤如下：
1. 将G-10葡聚糖凝胶色谱柱放入柱子支撑架上，并连接到色
谱系统上。
2. 将适当的缓冲液（如适应于样品的缓冲液）通过柱子进行激活，以去除可能存在的杂质和污染物。
3. 进行柱子平衡：将适当的缓冲液通过柱子流经，直到柱子和系统达到平衡状态。
4. 加载样品：将待分离的样品按照柱子载样方法加载到柱子上。
5. 进行色谱分离：根据需要，控制缓冲液的流速和浓度梯度，使待分离的目标化合物在柱子上进行分离。
6. 收集分离物：根据其他方法（如按时间段收集、检测波长等）进行分离物收集和检测。
值得注意的是，G-10葡聚糖凝胶色谱柱通常用于相对较小的
生物大分子分离，如寡聚糖和多糖，对于更大分子的分离可能需要使用其他类型的色谱柱。
此外，在操作过程中需要根据具体样品的特性和需要进行柱子条件的调整。