肠道病原菌的分离与鉴定二
肠道致病菌的分离与鉴定
肠道致病菌的分离与鉴定一、实验目的(1)掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤(2)掌握平板划线分离法(3)掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义二、实验材料(1)实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、(2)实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基(EMB、克氏双糖铁培养基(KIA)、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基三、实验流程(1)肠道致病菌的分离①待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中，混匀。
②细菌的分离接种：用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMBt养基。
将培养基置于37C培养18~24小时。
(2)肠道致病菌的纯化①单菌落接种：从已培养待测细菌的EMB培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37 C培养18~24小时。
②待测细菌的初步判断：取出已纯化培养待测细菌的KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。
（3）肠道致病菌的鉴定①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内的小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培养的KIA 培养基上的培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37 C培养18~24小时。
取出并观察记录现象。
（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）②动力检查：用已灭菌的接种针取KIA培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37 C 培养18~24小时。
取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。
（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取KIA培养基上的培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。
肠道菌的分离与鉴定
肠道菌的分离与鉴定一、背景介绍肠道菌是指生活在人类肠道内的微生物群落，其中包括细菌、真菌、病毒等多种微生物。
这些微生物与人体之间存在着密切的相互作用关系，对于人体的健康和疾病发展都有重要影响。
二、肠道菌的分离方法1. 粪便样品采集：粪便是肠道菌分离的主要来源，采集前应注意卫生和消毒。
2. 菌落计数：将粪便样品经过稀释后接种在含有富营养成分的琼脂平板上，培养一段时间后进行菌落计数。
3. 纯化：从培养出来的单个菌落中挑选纯化出目标细菌。
4. 鉴定：通过形态学特征、生理生化特性和分子生物学方法等手段对目标细菌进行鉴定。
三、肠道菌的鉴定方法1. 形态学特征鉴定：通过观察目标细菌在琼脂平板上形成的形态和颜色等特征来进行初步鉴定。
2. 生理生化特性鉴定：通过对目标细菌的代谢特征、生长条件和对不同物质的反应等进行测试来进一步鉴定。
3. 分子生物学方法鉴定：通过PCR扩增目标细菌的特异性基因序列，或者进行全基因组测序等方法来进行高精度的鉴定。
四、肠道菌分离与鉴定的意义1. 研究肠道微生物群落结构和功能，探究其与人体健康和疾病发展之间的关系。
2. 为临床诊断提供参考依据，如对于某些疾病的诊断和治疗方案制定等。
3. 为微生物资源库建设提供重要数据，有助于保护和利用微生物资源。
4. 对于工业发展也有一定作用，如利用某些肠道菌进行发酵制品生产等。
五、肠道菌分离与鉴定存在的问题1. 样品来源不确定：粪便样品来源受到个体差异、食品摄入和环境污染等多种因素影响，可能导致结果不稳定。
2. 培养条件不确定：培养条件也会影响菌落的形成和生理生化特性表现，可能导致鉴定结果有误。
3. 鉴定方法存在局限性：不同的鉴定方法对于不同细菌有不同的适用范围，可能会漏检或误判。
六、肠道菌分离与鉴定的发展趋势1. 高通量测序技术的应用：利用高通量测序技术可以对肠道微生物群落进行全面深入地研究，揭示其更多的结构和功能信息。
2. 人工智能技术的应用：通过人工智能技术可以对大量数据进行处理和分析，提高分离和鉴定效率和准确性。
肠道病原菌的分离与鉴定
原理
该培养基中只加少量的葡萄糖与较多量的乳糖。细菌分解 糖类产酸可使培养基局部指示剂改变颜色。当分解葡萄糖 的细菌在斜面上生长时,产生的酸少,又在有O2的情况下氧 化,生成CO2和H2O,失去改变局部酸碱度的作用,所以培养 基斜面部分不变色。但当细菌分解乳糖时产生酸量较多, 故培养基斜面部分可变色。细菌在高层中生长时,因处于 无O2状态,产生的酸不分解,故使高层部分培养基指示剂变 色。硫酸亚铁可与产生的H2S作用,生成FeS使培养基变黑。 硫代硫酸钠是一种还原剂,防止培养基中氧化物与H2S作用 而影响FeS的生成。
血清学鉴定
(1)沙门氏菌属 取一载玻片与沙门氏菌属、群、型血清做玻片凝
集试验。 ①取可疑培养物,先与A--E群沙门氏菌多价O血清
做凝集试验,阳性者认为该菌属于沙门氏菌属。 ②用沙门氏菌属各群特有的单价O因子血清做凝
集反应,可判定其属于沙门氏菌属何群。 ③用该群内各菌所特有的H因子血清作玻片凝集
反应,可最后判定为何种菌。
肠道病原菌的分离与鉴 定
肠道病原菌的分离鉴定(3) 细菌的药敏实验结果观察 厌氧菌培养法及厌氧菌生长状态 小白鼠感染肺炎球菌实验结果观察 细菌致病性试验
双糖铁培养基的制备
成分:脲 胨、乳 糖、蛋白胨、葡萄糖、硫酸亚 铁、氯化钠、硫代硫酸钠、琼脂、蒸馏水、酚红 水溶液
制法:加热溶解校正pH为7.2,然后加入0.4％酚红 水溶液,分装试管,高压灭菌,使成为底层较深的斜 面。
生化反应结果观察
菌名
阿
葡 萄 糖
乳 糖
麦 芽 糖
甘 露 醇
蔗 糖
靛 基 质尿 素Βιβλιοθήκη 硫 化 氢拉 伯 胶
粪便标本中肠道病原菌的分离与初步鉴定
H2S
然后观察下层
发酵葡萄糖（产酸产气） 动力
注意事项
1.作分离培养时宜取脓血便接种于鉴别培 养基或选择培养基上。
2. 挑取可疑菌落时，每份标本可选取2~3个 菌落，每个菌落接种一支双糖管。 3. 玻片凝集确定后，如果需要，可保存 菌种，以便进一步鉴定和研究用。
双糖铁发酵实验
检测细菌对乳糖和葡萄糖利用能力的不 同，及H2S形成能力，以对细菌进行区别 和鉴定。 生化反应和血清学实验：肠道细菌鉴定 的主要依据。
三、实验方法与步骤
粪便标本肠道致病菌分离鉴别流程
标本
选择鉴别培养基
IMViC、 双糖管等
37℃
24h
生化反应
已知Ab检 测未知Ag (玻片凝集 试验)
血清学实验
三、实验方法与步骤
I. 标本采集 II. 分段划线接种肠道鉴别选择培养基
三、实验方法与步骤
III. 挑取2~3个可疑菌落进行初步鉴定 IV. IMViC实验 V. 双糖铁发酵实验 VI. 血清学实验
克氏双糖培养基
乳糖 硫酸亚铁 固体 葡萄糖 半固体 指示剂:酚红
接种方法
如何观察
上层含乳糖部分
四、实验结果
IMViC实验结果
I
大肠杆菌 +
沙门菌
-
志贺菌
+/-
M
V-P
C
+
-
-
+
-
+/-
+
-
-
四、实验结果
双糖铁发酵实验结果
乳糖 葡萄糖 动力
大肠杆菌 黄色
+
痢疾杆菌 红色 +
肠道病原菌的分离与鉴定
高压蒸汽灭菌器
(二)普通琼脂培养基
材料:肉水、蛋白胨、氯化钠、琼脂、无菌平皿、 灭菌试管、三角烧瓶等。
方法
1．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂 放到三角烧瓶中,加热溶化。
2．用纸测酸碱度,用10％碳酸氢钠校正pH 为7.2左右。
3．15磅高压蒸气灭菌20～30min。
4．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内,每个平 皿倒入约15ml,凝固后即成普通琼脂平板培养基; 如趁热将培养基倒入灭菌试管内,再将试管斜放试 验台上,凝固后即成普通琼脂斜面培养基。
(三)血液琼脂培养基
有些细菌其营养要求较高,在普通琼脂培养基上生长 不良,可用血液琼脂培养基进行培养。 材料
① 普通琼脂培养基
② 血液(脱纤维羊血或兔血) 方法
1．加热溶化普通琼脂培养基。 2．待冷至50℃左右时,加入无菌的脱纤维血液,混匀(注 意勿使产生泡沫)。 3．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养 基。
方法
本实验四人一组,每人取6只小试管,排成一列,计四列为一 完整试验。分别标明每列管号和诊断菌液如“O”、 “OH”、“PA”、“PB”。按下表先向每管加生理盐水 0.5ml,再加10倍稀释病人血清0.5ml于第l管,做顺序的等 倍稀释,最后加入等量的诊断菌液,充分混匀,置37℃ 2~4h, 再放室温24小时后观察结果。
肠道病原菌的分离与鉴 定
培养基的制备及常用培养基 细菌的培养法
EMB培养基的制备 肠道病原菌的分离与鉴定(一) 血清学检测-肥达氏反应
培养基的制备
(一)肉汤培养基 材料:鲜牛肉、蛋白胨、氯化钠、pH试纸、10％碳酸氢钠、试
管、三角烧瓶、蒸馏水等。 方法
1．将新鲜牛肉500g切碎或搅碎,加水1000ml,放4℃冰箱或冷处 浸泡过夜,然后煮沸30min,放凉,使残余的脂肪凝固,再用绒布或 滤纸过滤,将滤液补足为原量。 2．1000ml肉水中加入蛋白胨 10g、氯化钠5g,加热溶解。 3．用精密pH试纸测酸碱度,用10％碳酸氢钠校正pH为7.2左右。 过碱时,可用10％醋酸校正之。 4．分装于试管中或三角烧瓶中,15磅(121℃)高压蒸气灭菌20～ 30min。
微生物实验 肠道病原菌的分离与鉴定
【目的要求】
1.熟悉粪便中肠道杆菌的分离与鉴定程序。 2.了解肠道杆菌生化反应、免疫学检测原理、结果和意义。 3.掌握肠道杆菌的生物学性状。
粪便标本中致病性肠道杆菌的分离与鉴定程序
粪便标本
涂片，染色，镜检 （意义不大）
双糖铁培养基
SS培养基
生化反应： IMViC
药敏试 验
伤寒沙门菌
三、肠道杆菌的生物学性状--志贺菌
志贺菌
【实验报告】
记录粪便标本病原菌的分离与鉴定的步骤及结果。
大肠埃希菌
Rod-Shaped Bacterium, E. coli (division) (SEM x22,245) E. coli (0157:H7) a rod prokaryote. Hemorrhagic type
E. coli with fimbriae
三、肠道杆菌的生物学性状--伤寒沙门菌
血清学 试验
PCR试 验
一、上节课实验结果
1.SS琼脂平板结果及初步推断
结果： 平板上有几种菌？
ห้องสมุดไป่ตู้
二、本节课实验内容
1.双糖铁培养基结果观察 细菌动力，对葡萄糖和乳糖发酵的情况，是否产生硫化氢？
原始管
反应管
双糖铁培养基结果
菌名 大肠埃希菌
葡萄糖 （底层）
⊕
痢疾杆菌
+
伤寒沙门菌
+
肖氏沙门菌
⊕
乳糖 （斜面）
氨苄西林
氨苄西林
敏感 中介 耐药 10ug >=17 13--16 <=14
复方新诺明
>=16 9--15 <=10
复方新诺明
常见肠道致病菌的分离与鉴定
6.副溶血弧菌
将粪便标本接种于弧菌增菌液中，6~8小时接种 TCBS平板，同时接种TCBS平板，35°C培养18~24 小时，检查有无呈绿色或蓝色中心，圆形，直径 2~3mm的菌落，挑取可疑菌落接种克氏双糖铁和尿 素动力靛基质培养基进行初步生化鉴定，最后采用 商品化鉴定系统鉴定至种。
7.艰难梭菌
二、培养与鉴定
医院中引起的腹泻一般不会是感染了食源性病原 菌引起，故对于住院超过3天的患者的粪便标本不 进行常规培养，除非是为了分离艰难梭菌和测定毒 素以诊断抗生素相关性腹泻。
1．沙门、志贺菌属菌培养
黏液、脓血便接种于SS琼脂平板或XLD琼脂平板和麦 康凯（MAC）琼脂平板（或中国蓝琼脂平板）以及血平板， 35℃孵育18～24小时，挑取不发酵乳糖菌落，至三糖铁琼 脂初步观察生化反应并进行血清学凝集试验。可根据生化反 应结果初步判断细菌菌属，再根据血清学鉴定结果鉴定至种
不染色标本
1．霍乱弧菌感染 标本呈米泔样或洗肉水样，镜检发现逗点状或弯曲 状的弧菌，呈流星样穿梭，运动活泼。加入O1群或O139群霍乱弧菌 多价诊断血清，大于80%的细菌停止运动或运动明显减弱 2．弯曲菌感染 呈S形、螺旋形并快速、拧塞样或投镖样运动的细菌 3．酵母样真菌感染 高倍镜发现光亮的卵圆形孢子或假菌丝
标本的运送
1．标本采集后应尽快送检 室温保存≤2小时 2．特殊细菌 艰难梭菌培养标本在4℃环境≤ 24小
时；弯曲菌与弧菌的标本需加入CaCl2(100mg/L) 3．置于运送培养基中的直肠拭子保存时间室温≤
24小时
标本验收
检查申请单信息填写是否完整、正确，包括标 本采集时间、采集方式、抗生素使用情况、标本 量是否足够、标本容器有无渗漏等
标本拒收
1．粪便标本放置时间超过2小时 2．成形粪便或粪便标本混有尿液 3．粪便标本量过少、干涸或保存不当 4．直肠拭子未置于运送培养基中应及时与临床医师联系， 说明原因，要求重新留取标本送检
肠道病原菌分离与鉴定课件
样品保存：低温保存，防 止微生物生长
样品处理：稀释、离心、 过滤等
样品检测：使用微生物培 养基进行培养，观察菌落 形态和颜色，进行鉴定。
培养基的选择与制备
培养基类型：选择适合肠道病原菌生长的培养基，如 LB培养基、MH培养基等
培养基成分：根据肠道病原菌的生长需求，选择合适 的营养成分，如蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖等
培养基制备：按照一定的比例和顺序，将培养基成分 混合，并加入适量的水，搅拌均匀
灭菌处理：将制备好的培养基进行灭菌处理，如高压 蒸汽灭菌、紫外灯照射等，确保培养基无菌
培养条件的控制
02
03
04
气体环境：提供适当的气体 环境，如厌氧、微需氧等， 以满足不同细菌的需求
培养基：选择合适的培养基， 如LB培养基、MRS培养基 等
5
基因测序：通过基因测 序技术，确定细菌的基 因序列和特性
生化鉴定
生化反应：通过 酶促反应、氧化
还原反应等生化 1
反应进行鉴定
核酸分析：通过 4
核酸序列分析、 基因芯片等方法
进行鉴定
代谢产物：通过 分析代谢产物的
2 种类和含量进行
鉴定
3 蛋白质分析：通
过蛋白质电泳、 质谱分析等方法 进行鉴定
血清学鉴定
01
原理：利用抗原抗体反应进行鉴定
02
方法：ELISA、免疫荧光法、免疫沉淀法等
03
优点：快速、准确、灵敏度高
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局限性：需要制备特异性抗体，成本较高
4
临床诊断
肠道病原菌的分离与鉴 定在临床诊断中的应用
肠道病原菌的分离与鉴 定在疾病诊断中的作用
肠道病原菌的分离与鉴 定在疾病治疗中的作用
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3．固定小白鼠：用右手轻拖鼠尾，使其爬行于金属网盖上，再 突然用左手拇食两指抓紧小白鼠颈项部及两耳，将鼠体搜入手 掌中，再用左手无名指和手掌夹住小白鼠尾根，以无名指和小 指夹住其左腿。
a
4
原理：将干燥的浸有一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接 种一定量某种细菌的琼脂平板上。经培养后，可在纸片周围 出现无细菌生长区，称抑菌环。测量抑菌环的大小，即可判 定该细菌对某种药物的敏感程度。目的是使学生学会此实验 方法并了解其在临床治疗上的意义。
材料
①ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ普通琼脂平板培养基
② 金黄色葡萄球菌分离培养物
大小 大菌落(直径在5mm以上) 中等大菌落(直径在3mm左右) 小菌落(直径在1mm左右)
形状：点状、圆形、卵圆形、叶状等。 边缘：整齐、锯齿状、毛发状等。 表面：光滑、皱纹、湿润、干燥等。 隆起度：凸起、扁平、中心凹陷等。 结构：均质性、颗粒状等。 色调：无色、白色、黄色、褐色等。 透明度：透明、半透明、不透明等。
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真正的伤寒病人O凝集素出现常较H凝集素为早，存在于血清内时间 较短；H凝集素产生较慢但效价较高，存在时间较长，可达数年。
过去曾接种过伤寒菌苗或患过伤寒病，近期又感染流感或布鲁氏菌 病时，可产生高效价的H凝集素及较低的O凝集素，此种反应称为非特 异回忆反应，其他如结核病、败血症、斑疹伤寒、肝炎等也可出现类 似反应。
a
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观察纸片周围有无抑菌环，并测其直径大小。最 终判断细菌对每种抗菌药物的敏感程度，记录和报 告结果。
判定标准：实验条件不同判定标准可有所不同 。一般抑菌环直径在15mm以上者为高度敏感，10 ～15mm为中度敏感，10mm以下为低度敏感，无 抑菌环者为耐药。
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实验动物的接种
1．首先将两种菌悬液做涂片，革兰色染色和镜检，以便与后述 死亡动物尸体的细菌学检查结果对比。
确诊为伤寒的患者中，约有10％肥达氏反应始终为阴性，故阴性结 果不能完全排除伤寒的诊断。
采血时间不同，肥达氏反应的阳性率也不同，发病第一周50％，第 二周80％，第四周90％以上。恢复期凝集价最高，以后逐渐下降。一 般以双份血清(急性期和恢复期)对比，凝集价有明显上升者作为新近 感染的指征。
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3
肠道病原菌的分离鉴定（2）
肥达氏反应结果观察
细菌的生长状态及菌落观察
细菌的药敏试验
实验动物感染试验
a
1
试验管自第1管看起，如有凝集(阳性反应)时则于管底呈圆片状、边缘 不整齐的凝集物，轻轻摇动，可见凝块或颗粒浮起，上清透明或有不同 程度的混浊。其凝集的强弱可用“+~++++”号表示如下： “++++” 细菌全部凝集，液体澄清，有大片状，边缘不整齐的凝集块 。
③ 大肠杆菌分离培养物
④ 药物纸片
⑤ 酒精
⑥ 镊子
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方法
1．按无菌操作法用接种环从分离培养平板上已选好的菌 落沾取细菌，反复交叉密涂于平板培养基上，以便生长出 均匀的菌苔(注意不要划破培养基)。 2．用沾酒精点燃灭菌的小镊子取药物纸片按下图贴于平 板培养基上，并轻轻按压贴紧。
3．做好标记，放37℃温箱培养过夜(不超过17h)。
“+++” 细菌绝大部分凝集，液体有轻度混浊，凝集块较小些。 “++” 细菌部分沉淀于管底，液体半澄清，凝集块呈颗粒状。 “+” 细菌仅少量凝集，液体混浊。
“-” 不凝集，液体混浊与对照管相似。 记录结果并判定凝集效价。通常以能产生明显凝集(++)的血清最大稀
释倍数做为该血清的凝集效价。
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首先应了解当地正常人效价，一般凝集价超过正常凝集价才有诊断 意义。
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4．以无菌镊子取碘酒棉球，消毒小白鼠左下腹部，用镊子 取下注射器针头上的棉花纸包，放入消毒罐中。左手倾 斜，使小白鼠头部向下，然后将注射器针头自小白鼠左 侧腹股沟部刺入皮下，使针头在皮下组织内前进约l cm左 右，再直立注射器，轻轻向F刺入腹腔内，注入菌液0． 2ml后再将针头拔出。将小白鼠用染料涂抹做好标记，放 入动物罐中。