食品中单增李斯特菌检验方法的应用分析
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析樊惠华，侯磊磊，方 莹，柴梅梅（榆林市食品检验检测中心，陕西榆林 719000）摘 要：为了提升食品检验检测机构对食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力，提高微生物实验室外部质量控制水平。
本实验室参加中国检验检疫科学研究院测试评估中心组织的ACAS-PT1108（2021）乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证，参考参试指导书、《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）、海博单增李斯特氏菌成套生化鉴定管和MicroScan WalkAway 40 Plus全自动微生物生化鉴定仪。
结果表明，参试样品编号21-T031为单核细胞增生李斯特氏菌，样品编号21-U887未检出单核细胞增生李斯特氏菌，经鉴定为伊氏李斯特氏菌，最终能力验证结果评价为满意，可见本实验室具有成熟的单核细胞增生李斯特氏菌检验能力。
关键词：乳粉；单核细胞增生李斯特氏菌；能力验证Results and Analysis of the Proficiency Testing of ListeriaMonocytogenes in Milk PowderFAN Huihua, HOU Leilei, FANG Ying, CHAI Meimei(Yulin Food Inspection and Testing Center, Yulin 719000, China)Abstract: In order to improve the ability of food inspection and testing institutions to detect Listeria monocytogenes in food and to improve the external quality control level of microbiology laboratory. The laboratory participated in the proficiency testing of Listeria monocytogenes in ACAS-PT1108 (2021) milk powder organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Sciences. Reference was made to the test guidelines, the GB 4789.30—2016, the complete biochemical identification tubes of Listeria monocytogenes in Haibo and the MicroScan WalkAway 40 Plus automatic microbial biochemical identification instrument. The results showed that the sample number 21-T031 was detected as Listeria monocytogenes, and the sample number 21-U887 was not detected as Listeria monocytogenes, which was identified as Listeria.ivanovii. The final proficiency test results were satisfactory. It can be seen that the laboratory has a mature ability to test Listeria monocytogenes.Keywords: milk powder; Listeria monocytogenes; proficiency test李斯特菌属目前包括17种公认的短杆状革兰氏阳性菌，其中单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌被认为是病原体[1]。
单增李斯特氏菌能力验证结果与分析
I FOOD INDUSTRY I 75单增李斯特氏菌能力验证结果与分析得出现“假阳性”的结果。
一旦实验室出现“假阳性”“假阴性”“与参考值范围不符”等情况时，实验室的负责人员应该针对整个实验室进行溯源。
从人员、环境、设备、培养基和试剂等各个方面进行详细地追溯和分析，从而纠正不利因素，确保检验结果的科学性和准确性。
我院于2020年5月底参加了由中国食品药品检定研究院组织的“NIFDC-PT-248 食品中单增李斯特氏菌检出能力验证”试验，按照后期返回的结果来看，检验结果为“满意”，现将具体试验情况汇报如下。
1.材料与方法1.1样品实验室共收到2份单增李斯特氏菌样品，样品为白色球状、真空包装于西林瓶，样品编号分别为FC02220011、FC02220030；2袋奶粉样品，每袋重量为25g ，编码与菌球编码对应。
1.2仪器与材料A C 2-6S 1型E S C O 生物安全柜（新加坡艺思高公司）；GR-85致微高压灭菌器（厦门致微公司）；MJ-250-Ⅲ型霉菌培养箱（上海跃进）；HH.B11.600BY 型恒温培养箱（上海跃进）；VITEK2 Compact 30型全自动微生物鉴定及药敏分析系统（法国梅里引言单核细胞增生李斯特氏菌是普遍存在于自然环境中的革兰氏阳性、嗜冷、兼性厌氧细菌。
同时，也是一种食源性的人畜共患病的病原菌，欧美国家曾多次暴发由于食用了受单增李斯特氏菌污染的肉制品、奶制品、蔬菜及水果等而引发的严重的食物中毒事件。
在《GB 29921-2021 食品安全国家标准 食品中致病菌限量》中，对乳制品、肉制品（包括熟肉制品和即食生肉制品）、水产制品、即食果蔬制品、冷冻饮品均有五份样品中均不得检出单增李斯特氏菌（n=5，c=0，m=0）的规定；同样，在2022年3月7日实施的《GB 31607-2021 食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》中“部分或未经热处理散装即食食品”：单核细胞增生李斯特氏菌限量为0/25g （mL ）。
食品中单增李斯特菌的存在现状及检测方法研究进展
单核细胞增生性李斯特菌属于李斯特菌属 ， 是革兰 氏阴性 短杆菌 ， 无芽孢 ， 生长环 境是需 氧和兼性厌 氧 ，
可在极 端 的环 境 中生 长和存活 ， 如生长温度为 一 ．℃～ １ ５ ５ ，Ｈ ４３ ９６ 耐高盐环境 ， ０ｃ ｐ 为 ． ．， 【 ＝ ～ 能忍受 冷冻和干燥 ｐ 】 ，
１２ １２ １２ ３ 、 ｂ、 ｃ、 ａ ４ ｂ、 ｂ、 ｃ ４ ４ｃ ５、 ａ ／ａ、 ， ｂ、 ，ｃ、 ａ ３ ３ ４ 、 ａ ４ ４ 、 ｄ、 、 ６ 、
６ 、。对人致病 的血清型主要有 １ ａ ｌ ｂ ４ 。 ｂ７ ， 、／ 、ｂ ２ ２
（．ｈｎ ｓｕＩｓ ｔ ｅ ｆ ｅｈ ｏ ｇ， ｈ ｎｓｕ２５ ０ ，ｉ ｇｕＣ ｉ ； ．０ ｅ ｆ ｏｄＳ ｉ ｃ，ｉ ｅｈ ０ ｇ ｎ ｉ ｅ， １ ａｇｈ ｔｕ ｃｎ ｌ ） Ｃ ａ ｇｈ １５ ０ Ｊ ｎｓ，ｈ ａ ２Ｃ ｌ ｇ０Ｆ ０ ｃ ｎｅ ０ ｃｎｌ ｙ ｇ ｅｒ Ｃ ｎ ｉｔｏＴ ｏｒ ａ ｎ ｌ ｅ Ｂ ｔ ０ Ｅ ｎ Ｚ ｅ ａｇ ０ｇｈ ｎ ｎＶｒｔ， ａ ｇｈ ｕ ０ ５Ｚ ｅ ａｇＣ ｉａ ｈｊ ｎ ｎ ｓａ ｇ ｉ ｓｙ Ｈ ｎｚ０ １ ３ ， ｈｊ ｎ， ｈｎ） ｉ Ｇ Ｕ ｅｉ ３０ ｉ Ａ ｓｒｃ： ｉｅ ａ ｍ ｎｃｔ ｅｅ Ｌ ｉ ａｃｍ ｎｆ ｄｐｔｏｅ Ｉ ｉ ｗｄ１ ｄｓ ｉ ｔ ａｙｆ ｄ ｂｔａｔ Ｌｓ ｒ ０ ｏｙ０ ｎ ｓ （Ｍ） ｓ ｏ ｍ０ ０ ａ ｇｎ． ｉｅ ｉｒ ｕｅ ｉ ｍ ｎ ０ ｔｉ ｇ ０ ｈ ｔｓ ｙ ｔｂ ｄ ｎ ｏ
Ｋｅ ｒ ｓ ｉｔｒａｍ０ ０ ｙｏ ｅ ｅ ０ ｃ ｒｅ ｃ ｙｗ０ ｄ ：Ｌ ｓｅ ｉ ｎ ｃ ｔｇ ｎ ｓ； ｃ ｕ ｒ ｎ ｅ；ｄ ｔｍ ｉ ｔ ｎ ｅｅ ｎａｉ ０
食品中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果及分析
现代食品XIANDAISHIPIN 219/分析检测Analysis and Testing doi:10.16736/41-1434/ts.2021.06.062食品中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果及分析Validation Results and Analysis of Listeria monocytogenes in food◎ 杨丰旭，曹欢欢，李 爽，孟凡信（朝阳市检验检测认证中心，辽宁 朝阳 122000）YANG Fengxu, CAO Huanhuan, LI Shuang, MENG Fanxin (Chaoyang Inspection, Testing and Certification Center, Chaoyang 122000, China)摘 要：为了提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力，增强实验室竞争力，本实验室参加了大连海关技术中心组织的能力验证，结果表明编号为075和102的样品均检出单核细胞增生李斯特氏菌。
本次能力验证结果评价为满意。
关键词：食品；单核细胞增生李斯特氏菌；能力验证Abstract：In order to improve the detection ability of Listeria monocytogenes in food and enhance the competitiveness of the laboratory, our laboratory participated in the proficiency test organized by the Dalian Customs Technology Center. The results showed that Listeria monocytogenes were detected both in samples numbered 075 and 102.The results of theproficiency test were evaluated as satisfactory.Keywords：food; Listeria monocytogenes ; proficiency testing中图分类号：R155.5单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ）在自然界分布广泛，是一种细胞内寄生的革兰氏阳性杆菌，可通过污染食品而引起人、畜单核细胞增多，从而导致脑膜炎、败血症、流产等疾病[1]。
冷冻食品中单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定
单核细胞 增 多性李斯特 菌 （ｉ－ 型血清购 白日本力生研株式会 社。 Ｌ ｓ 颜色变化 。 ｔｒ ａ ｍ ｎ ｃ ｔ ｇ ｎ ｓ Ｌ ） ， 称 单 １ ２ 方 法 ｅ ｉ ｏ ｏ ｙ ｏ ｅ ｅ ，ｍ 简 ． １２ ７ Ａ ＩＬ ｓｅ ｉ ． ． Ｐ ｉ ｔｒ ａ鉴定试 验 用 增 李斯 特 菌 ， 泛 存在 于土 壤 、 物 １２ １ 增 菌 在 无 菌 操 作 台 上 ， 取 纯 培 养 的菌 落 做 Ａ Ｉ Ｌ ｓ ｅ ｉ 实 广 动 ．． 称 Ｐ ｉ ｔｒ ａ 和 水产 品中，主要通过 乳及乳制 品 、 ２ 克 样 品， ５ 剪碎 ， 灭菌 的镊子 将其 验 ，按照 Ａ Ｉ Ｌ ｓｅ ｉ 用 Ｐ ｉｔ ｒ ａ的操 作说 明 蔬菜 、 水产 品、 肉制 品等食物 传播 。因 装 入含有 ２ ５ Ｌ的 Ｆ １增菌液 中 ， ２ｍ Ｂ 放 书进行操作 。 其 具有独特 的生理特性 ， 能引起 人类 入 ３ ℃ ±１ ０ ℃的恒温培养 箱中 ，培养 １ ２ ８ 血清 学鉴 定 参照 单增李 斯 ．． 脑膜 炎 、 血症 等疾 患 ， 以妊 娠 期 ２ ｈ ｌ ， 取 ｌＬ 加 入 １ ｍ Ｆ ２增 特 菌 诊断血 清使 用说 明书进 行 ， 败 尤 ５± 吸 ｈ ｍ， ０ ＬＢ ０抗 妇 女、 新生儿 以及 免疫功 能低下 的病 菌液 中放 ３ ±１ ０ ℃二次增菌 ２ ±ｌ 。 原采用 玻片 凝集 法 ， 原采用 试 管 ５ ｈ Ｈ抗 人更易感染 ， 致死率 达 ３ ％ 以上 。一 １２ ２ 分 离 培 养 用 接 种 环 沾 取 凝 集法 。 ０ ．． 直 以来 ， 品安 全法规规 定单增李 斯 Ｆ ２培养液 ，在科 玛嘉李斯特 显色培 ２ 结 果 食 Ｂ 特菌在 食 品 中不 得检 出 ［ 可是 食 品 养基上划线接种 。 ３ ￣恒温培 养箱 ２ １ ］ ， 置 ７Ｃ 一 培 养情 况及 菌落特 征 Ｆ ｌＦ ２ Ｂ 、Ｂ 加工 环境 中的单 增 李斯特 菌 却 很难 培养 ２ ±２ 。 ４ ｈ 增 菌 液变 浑 浊 ，颜色 由原来 的黄 色 根除 ， 以 国际食 品微 生物标 准委员 １ ２３ 染色镜 检 挑 取单个 菌落 的 变成 黑色 ； 科玛嘉 李斯特菌显色 培 所 ．． 在 会 （Ｃ Ｓ ） ＩＭ Ｆ 规定 非易感 人群 的每克食 半进 行革兰 氏染色 ， 光学显微 镜 养 基平 板 上形 成 兰色 带 有 白色晕 环 在 物 中单 增 李 斯 特 菌 的 含 量 不 超 过 下观 察细菌的形态及染色特 点。 的 圆形菌 落 ， 小为 ２ Ｉｌ在血 平 大 ～３Ｉ ｒ； Ｉ Ｉ ＩＯ Ｆ ￣ 近几年 来， ＯＣＵｌ 。 因食品污染单增 １２ ４ 纯培养 挑取科 玛嘉李 斯特 板上可见狭窄 、 明的 Ｂ溶血环 。 ．． 透 李斯特 菌 而导 致 的食 物 中毒 事件 日 显色培 养 基上 可 疑 菌落 在血 平 板上 ２ ２ 形态特 征 革兰 氏阴性短杆菌 ， ． 渐 增 多 ， 已引起 不少 国家 的广泛 关 划线培 养， 观察生长情况 。 大 小 为 （． Ｏ ４～０ ５ｕｍ × （ ． ． ） ０ ５～ 注 。该菌 已被列为 二十世纪 ９ ０年代 １２ ５ 运 动性镜 检 运动 性镜 检挑 ２０ｉ ） 两端钝 圆， ．． ． ｍ ， ｔ 多单在 ， 的呈 Ｖ 有 四大 食品致病菌 之一 ， 为许 多国家 取 血平 板上 典 型 的菌 落于 洁 净载 玻 字型排列 。 成 食 品卫生的必检项 目。在我 国 ， 虽然 片上 ，用 ０８ ％ ．５ 灭菌生理盐水制 成悬 ２３ 典型运动 镜检 油镜观 察可见 ． 由单 增 李斯特 菌 引起 的食 物 中毒事 浮 液 ， 上 盖玻 片 ， 显微 镜 下用 油 明显的旋转翻滚运动 。 压 于 件较少 ，但 是应提 高对 该菌 的重视 ， 镜观察 。 ２ ４ 生 化 试 验 过 氧 化 氢 实 验 阳 ． 加强对单增 李斯特菌 的监测管理 。 本 １ ２ ６ 生 化 试 验 ．． 性、 动力试验 阳性、 化酶试验 阴性 。 氧 文作者对市 售速冻饺 子 、 肉排类 冷冻 １２ ６ １ 过 氧 化 氢 酶 试 验 挑 取 ２ ５ Ａ Ｉ Ｌ ｓｅ ｉ 鉴 定 试 验 ．．． ． Ｐ ｉ ｔｒ ａ 食 品进行 Ｌ Ｍ的检 验 ，现将 结 果报告 血平 板上 纯培 养 的 菌落 于 洁净 玻 片 １￣２ ８ ４小时后 ，反应 结果为 Ｄ 一木糖 如下 。 上 ， 加 １滴 ３ 的过氧 化氢 （２ ） 滴 ％ Ｈ 。溶 （Ｙ ） 、 糖 （Ｉ） 、 磷酸 葡 萄 ０ ＸＬ 管 核 ＲＢ 管 卜 １ 材 料 和 方 法 液 ， 察 结果 。于半分 钟 内有 大量气 糖 （Ｉ ） 、一塔 格 糖 （Ａ ） 为 阴 观 ＧＰ 管 Ｄ ＴＧ 管 １１ 材 料 ． 泡产 生 的， 明该试验 为 阳性 。反之 性 ； 叶苷 （Ｓ ） 、 一甘 露糖 苷 酶 证 七 ＥＣ 管 Ｑ １ １ １ 样 品来 源 随机 从锦 州 市 ３ 亦 然 。 ． ． （ Ａ ） Ｄ 阿 拉伯醇 （Ａ Ｌ 管 、 Ｑ Ｎ 管、 ～ Ｍ ＤＲ） 鼠 个 区的超 市 中采 集 不 同品牌 的速 冻 １ ２ ６ ２ 动力 试验 挑取血 平板 上 李糖 （｝ ） ．．． Ｒ Ａ 管、 Ｌ Ｑ一甲基 一 一葡萄糖苷 Ｄ 饺子 １ 份 ， 肉串 ２ ８ 羊 ４份 ， 肉 串 １ 纯培 养 的菌 落 穿刺 Ｓ Ｍ半 固体 培 养 Ｍ Ｇ为 阳 性 ： 在 Ｄ Ｍ试 管 中 加 一 滴 牛 ２ Ｉ Ｄ Ｉ 份 ， 肉片 ５份 ， 肉片 ３ ， 计 ６ 基 ， 羊 牛 份 共 ２ 于温室 （０ ５ 培养 ４ 。观 ＺＭ ２ ～２ ｏ Ｃ） ８ｈ Ｙ Ｂ试 剂 ， ３分 钟后 ，Ｉ Ｄ Ｍ管为 阴性 。 份。 察其生 长情况 。在 半 固体 管 内， 穿 每 ３ 沿 个测定分 为一组 ， 每个按顺序 ｌ 、 １ １２ 主 要 培 养 基 Ｆ ． ． Ｂ增 菌 液 刺 线呈云雾 状 ， 并可 见典型伞 状或 月 ２ ４ 明。 和 标 在每 组中， 阳性反应 以相 （Ｂ 、Ｂ ） ＳＭ动力 培养基 、科 玛嘉 牙形 生长的为阳性 。 Ｆ １Ｆ ２ 、Ｉ 无任何变化者 为 应 的数 字 相加 ，得 到 一个 ４位 编 码 李 斯特 显色 培 养基 购 自北京 陆桥 微 阴性 。 为 ６ １， ５０ 查阅编 码本与之对应 的细菌 生 物 试 剂 有 限 公 司 ；Ａ Ｉ Ｌ ｓ ｅ ｉ １２ ６ ３ 氧 化酶试 验 取 白色 洁净 条 目， Ｐ ｉｔｒ ａ ． ．． 得到结果为单增 李斯特 菌。 试 剂条及 配 套试 剂购 自生物 梅 里 埃 滤纸 条 ，沾取血 平板上 的菌落 少许 ， ２ ６ 血清 学鉴 定 分离 的 ７株单增 ． 公 司； 血平板 自制 。 加氧 化酶试剂 一滴 ， 阳性者立 即呈粉 李斯特 菌 ， 其血清 学分型 分别是 ３ 株 １ １３ 标准 血清 单增 李斯特 菌 分 红色 ，～ ｌ ｓ内呈深紫色 ；阴性者无 为 １２ ， 株 为 １２ ， 株 为 １ ２ 。 ．． ５ Ｏ ／ｂ２ ／ａ２ ／ ｃ
FAPAS_乳粉中单核细胞增生李斯特菌能力验证结果分析与讨论
分析检测FAPAS乳粉中单核细胞增生李斯特菌能力验证结果分析与讨论刘 霓（辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳 110000）摘 要：为了提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力，本实验室参加了FAPAS分析实验室能力验证机构组织的实验室能力验证，分别运用国标方法、分子生物学方法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对样品进行检测鉴定。
结果表明，M224d02-A样品检出单核细胞增生李斯特氏菌，M224d02-B样品检出英诺克李斯特菌，属于李斯特氏菌属。
2个样品检验结果均取得满意结果。
关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；FAPAS考核；李斯特菌Analysis and Discussion About the Verification Resultsof Listeria monocytogenes in Milk Powder from FAPASLaboratoryLIU Ni(Liaoning Inspection Examination and Certification Center, Shenyang 110000, China) Abstract: To strengthen the detection power of Listeria monocytogenes in food, our laboratory participated in proficiency testing on Listeria monocytogenes detection in foods which was organized by Food Analysis Performance Assessment Scheme (FAPAS). We used 3 methods for the test, respectively national standard method, molecular biology method and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) method. Listeria monocytogenes were detected in M228d02-A. Listeria innocua belonged to Listeria sp. were detected in M228d02-B. The test results of 2 samples were outstanding grade.Keywords:Listeria monocytogenes; FAPAS proficiency testing; Listeria sp.李斯特菌属（Listeria sp.）是一种革兰氏阳性菌，在自然环境中广泛存在，一般认为它包括单核细胞增生李斯特菌（L.monocytogenes，以下简称单增李斯特菌）、英诺克李斯特菌（L.innocua）等多种。
单核增生李斯特氏菌检测概述
单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。
该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。
李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。
检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。
1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。
培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。
在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。
培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。
2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。
这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。
通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。
3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。
这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。
这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。
需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。
常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。
对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。
食品中单核细胞增生性李斯特氏菌1
食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法摘要：通过扩增hly 基因建立检测单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)的PCR 方法。
该方法具有较强的特异性，35株经传统方法鉴定的菌株PCR 结果均为阳性，而其他三种同属异种菌，包括英诺克李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和威尔斯李斯特氏菌及非李斯特氏菌均未扩增出特异性的片段。
PCR 方法对Lm 纯培养物的最低检测限为7.3CFU/μl，对模拟污染的生猪肉和蔬菜的检测低限为4CFU/g，牛奶为4CFU/ml。
应用该方法对285 份食品样品检测，17 份样品Lm 呈阳性，结果与常规的分离培养方法完全一致。
该种方法具有敏感、特异、快速及准的优点，可用于食品中L m 的快速检测。
关键词：食品；单核细胞增生性李斯特氏菌；聚合酶链式反应Abstract ：A polymerase chain reaction (PCR) assay targeting the hly gene was developed to detect Listeria monocytogenes.The PCR product was detected in 35 L monocytogenes strains and not in other Listeria spp, including innocua, ivanovii andwelshimer and also not in non-Listeria species, indicating that this method was highly specific for L. monocytogenes. The detectionlimit of the PCR assay was 7.3 CFU/μl o f pure cell culture. The PCR assay could detect4 CFU of L. monocytogenes in thecontaminated pork and vegetable (1g) and milk (1ml). From 285 samples, 17 samples were proved positivefor L. monocytogenesby the PCR method, and the results were quite consisted with those detected by conventional biochemical testing. The PCRassay is highly sensitive, specific, rapid and accurate and can be used for rapid detection of L. monocytogenes in food.Key words：food；Listeria monocytogenes；PCR；detection1引言1.1李斯特氏菌-概况李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
食品中单增李斯特菌检验方法的应用分析
发表时间：2019-10-30T11:36:20.520Z 来源：《健康世界》2019年13期作者：杨瑞娟
[导读] 结论：实时荧光PCR检测和MPN计数法相结合，避免样品细菌培养法检测出阳性结果，定量检测时重新取样而导致的结果差异，减短检验周期和工作量，使工作效率得到提升。
云南省丽江市疾病预防控制中心 674100
摘要：目的：单增李斯特菌定性检测结合实时荧光PCR和MPN计数法，在食品源性致病菌检测中快速进行定性和定量检测。
方法：将单增李斯特菌的菌悬液样品依据不同浓度用细菌培养法和实时荧光PCR法进行比较；分别对当日、冷冻2小时和6小时的增菌液进行MPN计数法定量检测，对三种情况下MPN计数结果进行比较。
结果：细菌培养法和实时荧光PCR法检测两者结果一致；MPN计数法定量检测，（1）和（2）结果吻合，与（3）结果有差异。
结论：实时荧光PCR检测和MPN计数法相结合，避免样品细菌培养法检测出阳性结果，定量检测时重新取样而导致的结果差异，减短检验周期和工作量，使工作效率得到提升。
关键词：食品；单增李斯特菌；检验方法
连年来，因食品污染单增李斯特菌导致食品中毒的事件逐渐增多，引起社会各界的广泛关注。
单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌[1]，多存在于土壤、水产品和动物中，食物中涉及较多的是急冻食品、生菜食物和熟食店食物等。
易感人群为新生儿、孕妇和40岁以上的成年人，临床症状表现为发热、化脓性结膜炎和败血症等，死亡率高达30%以上。
本文将从实时荧光定量PCR法和MPN计数法相结合，对单增李斯特菌定量检测进行研究，有关情况如下。
1.材料与方法
1.1仪器和试剂
标准菌株采用我市提供的50000株单增李斯特菌，使用实时荧光定量PCR仪和离心机，选取实时荧光定量PCR试剂、全自动微生物鉴定仪和革兰氏阳性细菌鉴定卡，培养基选自李氏增菌肉汤等，均在有效期内使用培养基和试剂。
用脑心浸液培养基将80℃标准菌株过夜培养温度控制在30℃，科玛嘉单李斯特显色琼脂平板培养24小时，温度设置为36℃至37℃。
菌落的挑选规格为天蓝色、大小适中和周围有白色晕环，将菌落接种于脑心浸液琼脂平板分纯24小时30℃，菌液的浓度利用生理盐水控制在0.5至0.6麦氏单位，将调整好的菌液作为原液，1ml菌液和9ml无菌生理盐水放在试管中，把试管的液体进行均匀搅拌，制作成10-1菌液，重复上面的步骤，菌液制作成10位系列菌液。
每进行稀释一次菌液，都要换用1次1ml的无菌吸管[2]，依次稀释到10-9，将2ml菌悬液分别加入2个无菌平皿，将单增李斯特显色培养基放满平皿，培养24小时，温度控制在36℃，计数平皿中天蓝色、大小适中，周围有白色晕环的菌落数，作好空白对照。
1.2制备样品和检验样品
制备样品：从市场采集10份熟食制品，检验阴性结果使用细菌培养法，得出检验结果为阴性结果后，按照每份50g分为5份，分别加入每个标准菌液混合拍打，再取出样品25g，加入225ml混合搅匀。
将剩余的25ml保存在冰箱中。
检验样品：将LB1增菌液取出40ml保存在冰箱，剩余的LB1按照单增李斯特的检验方法用MPN计数法进行定量检测和细菌培养法检测。
将LB1和LB2分别进行荧光定量RCR检测。
按照2d至6d后，将样品进行MPN计数法定量检测。
1.3统计学分析
利用统计学软件SPSS20.0对数据进行统计并加强分析，用（x±s）表示计量资料，组间差异用t进行检验，用（%）表示计数资料，组间比较用X2检验，P＜0.05具有统计学意义。
2.结果
2.1比较两种方法检测结果
在研究中，样品增菌LB1经过24小时培养和LB2经过18小时培养后，分别进行实时荧光定量PCR法检测。
在10-7细菌培养法和PCR法LB1增菌培养比较时，10-7具有统计学意义（P<0.05）。
细菌培养法和PCR法LB2增菌培养后进行比较，差异不具有统计学意义
（P>0.05），具有可比性。
2.2不同时间MPN计数法检验结果比较
经检测，加标识的样品定量检测同时进行MPN计数法定量检测，2d后用冷藏的LB1增菌液定量检测结果和MPN定量检测结果一致，6d 后冷冻加标样品和冷冻6d后重新取样定量检测的结果有差别，差异具有统计学意义（P<0.05）。
表1比较两种方法检测结果（x±s）
3.讨论
利用实时荧光定量PCR法检测单增李斯特具有准确性和快捷性。
国标中单增李斯特菌常用的三种检验方法为单核细胞增生李斯特氏菌定性检验、单核细胞增生李斯特菌MPN计数法和单核细胞增生李斯特菌平板计数法[3]，主要通过制备培养基、处理样品增菌和生化试验等，用时较长，分离培养受到多种因素的影响。
实时荧光定量PCR法是利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过标准的曲线对未知模板进行定量分析，有效解决PCR污染问题，使结果更加直观明确。
在本次检测中，实时荧光定量PCR法优于细菌分离培养法。
样品增菌LB124小时和LB218小时培养后，分别进行实时荧光定量PCR法
检测。
细菌培养法和PCR法LB1增菌培养比较时，10-7具有统计学意义（P<0.05）。
PCR法LB2增菌培养不具有统计学意义（P>0.05）。
将不同时间MPN计数法检验结果进行比较，2d后用冷藏的LB1增菌液定量检测结果和MPN定量检测结果一致，6d后冷冻加标样品和冷冻6d 后重新取样定量检测的结果有差别，差异具有统计学意义（P<0.05）。
应用实时荧光定量PCR法检测，提高了检测效率和加快样品的筛选，加强食源性致病菌监测工作效率，减低费用。
综上所述，实时荧光PCR检测和MPN计数法相结合，避免样品细菌培养法检测出阳性结果，提高监测的灵敏性，使工作效率得到提升。
参考文献：
[1]董庆利，陆冉冉，汪雯，et al.案板材质对单增李斯特菌在生熟食品间交叉污染的影响[J].农业机械学报，2016，47（3）：207-213.
[2]齐颖颖，吴萌，王怡雯，et al.单增李斯特菌单克隆抗体的研制及特性分析[J].食品与生物技术学报，2016，35（2）：151-155.
[3]张俊彦，梅玲玲，徐昌平，et al.EMA实时荧光PCR技术检测食品中单核增生李斯特活菌方法研究[J].中国人兽共患病学报，2017，33（11）：1007-1012.
作者简介：杨瑞娟（1984年1月~）价格：云南丽江民族：纳西族职称：主管检验技师学历：大学本科（2007年7月毕业于佳木斯大学医学检验专业，2007年10月考入丽江市疾病预防控制中心就职从事微生物检验工作至今）主要从事：微生物检验。