食品微生物检验——单增李斯特菌

食品中单增李斯特检测技术
李斯特氏菌属包括七个种：
单核细胞增生李斯特氏菌
绵羊李斯特氏菌
英诺克李斯特氏菌
威尔斯李斯特氏菌
西尔李斯特氏菌
格氏李斯特氏菌
默氏李斯特氏菌
其中单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定的致病性，其余李斯特氏菌无致病性。

单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。

它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх 1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状。

兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性。

该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。

该菌营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2－5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。

该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8－4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。

在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。

在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。

在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45度角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。

该菌触酶阳性，氧化酶阴性。

发酵多种糖类，产酸不产气。

如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。

不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。

不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解。

吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。

VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。

该菌对理化因素抵抗力较强。

在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活。

对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。

该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

李斯特氏菌(Listeria)是条件致病菌，大多为散发病例，也可因污染食品而爆发。

本菌能产生一种溶血素性质的外毒素。

能引起人和牛、绵羊等动物的脑膜炎，可使家兔豚鼠等实验动物感染引起血中单核细胞增高。

可引起婴儿及新生儿的化脓性脑膜炎或脑膜脑炎，死亡率可达70%。

子宫内感染的新生儿可导致新生儿李斯特氏菌病、流产、死胎或习惯性流产。

SN 0184-93 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法
样品：冷冻样品，2－5℃解冻，不超过18h
若不能及时检验，应置于－15 ℃保存。

非冷冻易腐样品应尽可能及时检验。

若不能及时检验，应置于4 ℃冰箱保存，在24h之内检验。

两次增菌：
巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品、冻肉及其它加工食品应该前增菌。

25g＋225ml改良缓冲蛋白胨水，均质。

30 ℃培养18－24h，移取1ml接种于100ml增菌培养液（EB)中，30 ℃培养24、48h，分别进行分离。

直接增菌：
生乳、鲜肉以及未经加工处理过的样品。

25g＋225ml 增菌培养液，30 ℃培养24和48h，分别进行分离。

分离：
划线接种于MMA或者OXA平板，35 ℃培养24－48h。

斜射光镜检。

MMA平板：
蓝色或者兰灰色,扁平圆润，稍有凸起,边缘整齐
菌落较小，约为0.5mm左右
OXA平板：
菌落呈黑色，直径1mm，
在其周围形成一个黑色环。

从MMA或OXA上挑取5个可疑菌落，接种TSA-YE平板，进行纯培养。

纯化菌落再转接到TSB-YE肉汤，35℃培养24h。

进行生化试验。

典型运动镜检：
从TSA-YE平板挑取生长良好的菌落于洁净载玻片上。

用0.85%灭菌生理盐水制成悬浮液。

在显微镜下用油镜观察。

短棒状杆菌，显微镜下可见轻微旋转和翻滚。

过氧化氢酶：
过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧。

菌落－平板－1滴3％的过氧化氢。

阳性。

过氧化氢酶实验也可以在试管中进行
革兰氏染色镜检：革兰氏阳性
溶血试验：
7％羊血琼脂平板，划分小格，刺种菌落。

做阳性对照和阴性对照（英诺克李斯特氏菌）。

35 ℃培养24－48h，于明亮处观察。

单核细胞增生李斯特氏菌在刺种点产生窄小的透明β溶血环
尿素酶（Urease）试验：
有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。

穿刺接种尿素酶琼脂斜面，35℃培养5天，逐日观察，阴性。

硝酸盐还原试验：
某些细菌能够把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐。

亚硝酸盐与乙酸反应生成亚硝酸。

硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸。

偶氮苯磺酸与α萘氨结合，形成红色的N－α苯氨偶氮苯磺酸
接种硝酸盐肉汤，35℃培养5天，
加入0.2ml试剂A，再加入 0.2ml试剂B，轻摇混合。

红色：阳性
没有颜色变化：加入少量锌粉
－变红－阴性（硝酸盐未被还原）
－不变－阳性（亚硝酸盐已经分解成氨和氮）
甲基红（Methyl Red）试验：
某些细菌在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。

有些细菌产酸量少，培养基的pH保持在6.2以上，指示剂呈现黄色
V-P试验：
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。

操作：
接种MR-VP肉汤，35℃培养48h。

移取1ml于洁净试管，加入5％α－萘酚溶液6ml，
再加入10％氢氧化钾溶液0.2ml，轻摇1min，静置20min
VP-阳性反应：红色
剩余培养液继续培养2d，
加入甲基红指示剂5滴。

MR-阳性反应：红色
三糖铁（TSI）琼脂试验：
本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。

葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧
化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底
部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

三糖铁试验：
接种三糖铁琼脂，35℃培养5天。

斜面和底层产酸，不产生硫化氢。

(发酵葡萄糖和蔗糖）
糖酵解试验
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。

可用指示剂及发酵管检验。

接种0.5%糖类发酵管。

35℃培养24－48h，阴性继续培养到5天。

李斯特氏菌不产气。

葡萄糖：阳性
麦芽糖：阳性
七叶苷：阳性
甘露醇：阴性
鼠李糖：阳性
木糖：阴性
动力观察：
穿刺接种半固体动力培养基，
室温（20－25℃）培养2－5天，逐日观察。

有动力。

自穿刺线向四周蔓延生长，
呈典型伞状生长，底部为弯月牙状
协同凝血试验：企业可不做。

血清学检验：企业可不做。

小鼠毒力试验：企业可不做。

结果报告：
阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌
阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特氏菌
这是李斯特的协同溶血实验。

(cAMP)
两条竖线，左面是马红球菌，右面是金葡。

三条横线，上面是单增，中间是一种非溶血李斯特，下面是绵羊李斯特。

结果：单增在靠近金葡处溶血增强。

绵羊在靠近马红处溶血增强。

溶血实验：
从左向右依次是：
单增，窄小的贝塔溶血环。

绵羊，大的透明贝塔溶血环。

无溶血环的李斯特。

溶血实验局部放大照片。

从左向右依次是：
单增，窄小的贝塔溶血环。

绵羊，大的透明贝塔溶血环。

无溶血环的李斯特。