单增李斯特菌的检验方法
(十)-单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序
DBS22 DBS22/019—2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1。
1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》的要求编写.本标准分为两种检测方法：第一法:单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。
本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心.本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的定量检验方法.本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2。
1 冰箱：2℃～5℃和—18℃.2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃.2.3 均质器。
2.4 显微镜:10×～100×.2。
5 电子天平:感量0。
1 g。
2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。
2。
7 无菌吸管:1 mL（具0。
01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.8 无菌平皿:直径90 mm。
2。
9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2。
10 离心管:30 mm×100 mm.2。
11 无菌注射器:1 mL。
2。
12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。
2。
14 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3。
1 含0。
6％酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中A。
1.3。
2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。
食品微生物检验——单增李斯特菌
食品中单增李斯特检测技术李斯特氏菌属包括七个种：单核细胞增生李斯特氏菌绵羊李斯特氏菌英诺克李斯特氏菌威尔斯李斯特氏菌西尔李斯特氏菌格氏李斯特氏菌默氏李斯特氏菌其中单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定的致病性，其余李斯特氏菌无致病性。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。
该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх 1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状。
兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性。
该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。
该菌营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2－5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。
该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8－4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。
在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。
在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。
在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45度角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
该菌触酶阳性，氧化酶阴性。
发酵多种糖类，产酸不产气。
如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。
单核细胞增生李斯特菌检测技术是什么
龙源期刊网 单核细胞增生李斯特菌检测技术是什么作者：周林来源：《学习与科普》2019年第31期单核细胞增生李斯特菌包含在食源性致病菌范围当中。
就目前来看，免疫学检测方法和分子学检测方法是很多单增李斯特菌检测方法中使用最频繁的两种方法。
免疫学检测方法具有操作简便、时间短的特点，然而其非常依赖高特异性的抗体，结果容易出现失误，需要对检测结果进行详细判定。
和免疫学检测法相比，分子学检测方法具有灵敏度高、省时省力等特点，然而分子学检测方法在使用过程中需要较多的操作经验，同时不能在大批量检测中应用。
一、单核细胞增生李斯特菌概述（一）生物学特征单核细胞增生李斯特菌是一种革兰阳性短杆菌，其对营养的需求量较少，生长温度通常最低不能低于2摄氏度，最高不能超过42摄氏度，同时可以在弱酸、弱碱和6.5%NaCl肉汤中得到快速成长，并且能够形成β-溶血。
在其生长过程中还可以发酵出很多种糖类物质，按照O抗原以及H抗原能够分解成十三中血清型，其中1/2a与4b这两种类型在致病菌株中的占比最大。
（二）污染源及流行病学单核细胞增生李斯特菌是自然界中常见的一种致病菌，抗冻能力非常强，其主要传播路径是通过粪-口这种方式进行。
健康人粪便中的单核细胞增生李斯特菌携带率通常为0.6%至16.0%，然而奶制品、水产品以及家禽中均携带相应的单核细胞增生李斯特菌。
另外，单核细胞增生李斯特菌通过胎盘、黏膜、性以及产道鞥部位都可以进入到体内，从而导致感染。
单核细胞增生李斯特菌的致病性与其具有的毒作用、宿主的免疫状况以及年龄具有密不可分的关系，宿主的细胞免疫可以有效的解除单核细胞增生李斯特菌中存在的病菌。
各种免疫力弱的人群都属于易感人群，比如新生儿、四十岁以上的成人等。
健康成人感染后会出现和感冒相似的情况，然而其他免疫力功能较低的人可能会出现更加严重的症状，乃至会直接死亡。
二、相关检测技术（一）聚合酶链反应技术就目前来看，聚合酶链反应技术得到了广泛的普及与运用。
单增李斯特菌
市场情况
1999年底，美国发生了历史上因食用带有李斯特菌的食 品而引发的最严重的食物中毒事件，据美国疾病控制和防 治中心资料显示，在美国密歇根州有14人因食用被该菌污 染的“热狗”和熟肉而死亡，在另外22个州97人患此病，6 名妇女流产。1992～1995年法国出产的奶酪及猪肉中发现 李斯特菌。2001—2009年以来，我国质检部门多次从美国、 加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等20多家肉类加工 厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等30多批近千吨猪副产 品中检出单增李斯特菌、沙门氏菌等致病菌。为了解北京 市食品受单核细胞增生性李斯特菌污染状况，2004—2005 年间，崔京辉等从北京市几个市场及宾馆饭店共采集了270 份熟食、生肉制品、水产品等8类食品进行检测LM。
（4） PCR试剂盒
1）北京吉诺思科贸公司：美国伯乐iQ-Check单增李斯特 菌的检测：iQ-Check系统采用了所有的实时荧光PCR方法 的优点为食品中病原微生物提供快速和可靠地检测解决方 案。iQ-Check试剂盒为食品和环境样品中的单增李斯特菌 (Listeria monocytogenes)定性检测试剂盒。 2）陆桥： 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）荧 光定量PCR检测试剂盒 报价：1680 48T 3）索奥： 单增李斯特菌(LM)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 报价：2800 40T
在美国LM被列为7种主要的食源性致死病菌之一,已经被 WHO食品安全工作计划列为重点检测的食源性病原菌之一。
二、单增李斯特菌的检测方法
（1）食品安全国家标准：单核细胞增生李斯特氏菌 检验 （2010年最新）平板培养法
2007年食品中单增李斯特菌国 家标准检验方法实验 室验证及结果分析：用不同浓度的沙门菌菌悬液人 工染菌二类食品各40份，用增菌液两步增菌，两种 分离培养基分离，对比检出率及分离效果。检出率 62．5％，最低检出限为0.5cfu/25g-13cfu/25g。
单核细胞增生李斯特菌检验
血清学分型:
Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清 学分型.虽然Lm有16种血清型,1/2a、1/2b 、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、 4d、4e、5、6a、6b和7,但只有3种血清型 <1/2a、1/2b、4b>可引起疾病.从食品和患 者中分离的菌株95％以上是1/2a,1/2b,1/2c 和4b等血清型,而3a、3b、3c、4a、4c、4e 、4d和7等血清型在食品中非常少见,也没 有引起李斯特菌病的报道.
溶血反应 ＋ － ＋ － ＋ －
协同溶血
葡萄糖
麦芽糖
MR-VP
甘露醇
鼠李糖
木糖
七叶苷
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V
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V
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＋
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM培 养基中,于30℃培养24h-48h,李斯特菌有动力, 呈伞状生长.
PCR检测方法：〔1取1ml被检样李斯特氏 菌增菌肉汤用于提取DNA的,模板DNA的 制备, 根据试剂盒说明书进行；〔2PCR反 应体系：20μl .
H2O<二馏灭菌水>12.8μl,
10×buffer2.0μl,
Mg2+<25mol/l> 2.0μl,4×dNTP<10mmol/ml> 1.6μl,Primer<30pmol/μl>各0.25μl,
食品中单增李斯特菌检测
食品中单增李斯特菌检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测实验目的1）了解单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性。
2）熟悉单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定方法。
基本原理单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。
单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。
李斯特菌是一种细胞内寄生菌，它不仅可能存在于肉类产品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。
此菌广泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。
人也可作为无症状携带者。
据报道，健康人粪便中该菌的携带率为0.6％～16％，4％～8％的水产品、5％～10％的奶及其制品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。
李斯特菌能在1～45℃的温度下生存，能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。
该菌为革兰氏阳性短杆菌，有的菌体略弯曲，两端钝圆，大小约为0.4～0.5μm ′0.5～2.0μm。
多单在，有时是V字型排列。
无芽孢，不产生荚膜。
在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6～20μm 或更长的丝状。
在20～25℃培养时可产生2～4根鞭毛而运动，但在37℃培养时鞭毛发育不良，无运动性。
本菌需氧或兼性厌氧，生长温度为1～45℃，最适温度为30～37℃。
对营养要求不高，可在普通琼脂培养基中生长，但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。
加入0.2％～1％(W/V)的葡萄糖及2％～3％(V/V)的甘油生长更佳。
在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。
在4℃可缓慢增殖，形成菌落约需7d。
在液体培养基中培养18～24h后，肉汤呈轻度均匀混浊，数天后形成粘稠沉淀附着于管底，摇动时沉淀呈螺旋状，继续培养可形成颗粒状沉淀。
不形成菌环、菌膜。
在营养琼脂上，光滑(S)型可形成直径0.5～1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落，斜射光照射时，菌落呈特征性蓝绿光泽。
单增李斯特菌的检验方法
单增李斯特菌的检验方法
一.增菌：
1.EB肉汤
2.LB肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB增菌
效果优于EB）
LB分为LB1和LB2，两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基--杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。
上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液，使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB1增菌液中，30℃培养24h，吸0.1mlLB1增菌液到LB2增菌液中，30℃培养24h。
二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37℃培养24h，观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。
（国标上使用的选择性培养基是MMA，但是其选择性不强，科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。
此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM，25℃培养3---5d，观察伞状生长情况、TSI（三糖铁）斜面30℃培养24h—48h，观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S，不产气的培养物.
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形再挑取TSI上培养物接种其他生化管。
七叶苷鼠李糖木糖甘露醇尿
素
硝
酸
盐
还
原
VP MR H2O2
++----+++。
单增李斯特氏菌能力验证结果与分析
单增李斯特氏菌能力验证结果与分析作者：白雯静王艳炜王海峰来源：《食品界》2022年第10期引言单核细胞增生李斯特氏菌是普遍存在于自然环境中的革兰氏阳性、嗜冷、兼性厌氧细菌。
同时，也是一种食源性的人畜共患病的病原菌，欧美国家曾多次暴发由于食用了受单增李斯特氏菌污染的肉制品、奶制品、蔬菜及水果等而引发的严重的食物中毒事件。
在《GB 29921-2021 食品安全国家标准食品中致病菌限量》中，对乳制品、肉制品（包括熟肉制品和即食生肉制品）、水产制品、即食果蔬制品、冷冻饮品均有五份样品中均不得检出单增李斯特氏菌（n=5，c=0，m=0）的规定;同样，在2022年3月7日实施的《GB 31607-2021 食品安全国家标准散装即食食品中致病菌限量》中“部分或未经热处理散装即食食品”：单核细胞增生李斯特氏菌限量为0/25g（mL）。
由此类标准可见，国家对于食品中“单核细胞增生李斯特氏菌”的管理是十分严格的。
目前，国内单核增生李斯特氏菌的检验方法主要有：分子生物学检测技术（结合等温扩增技术、结合聚合酶链式反应技术）、免疫学检测技术、生物传感器检测技术、光谱学检测技术、其它检测技术（除了基于核酸檢测、特有蛋白检测之外，还可以与色谱、核磁等多项技术技术相结合对单增李斯特氏菌进行检测）。
《GB 4789. 30-2016食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌》与旧版标准相比较，主要增加了“第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法”和“第三法单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法”。
目前，对单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法是比较成熟的。
而且，随着检验检测技术日新月异的发展，使得较短时间内完成精准检测成为可能。
另外，对于实验室而言，质量控制具有十分重要的意义。
质量控制的工作包括很多方面。
比如，实验室内部控制和实验室间控制等等。
实验室内部控制工作可通过多种工作方式来展开。
比如，内部质量监督以及通过购买质控样品开展相关检验检测工作等等。
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单增李斯特菌的检验方法
一.增菌：
1.EB肉汤
2.LB肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB增菌效果优于EB）
LB分为LB1和LB2，两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基--杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。
上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液，使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB1增菌液中，30℃培养24h，吸增菌液到LB2增菌液中，30℃培养24h。
二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37℃培养24h，观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。
（国标上使用的选择性培养基是MMA，但是其选择性不强，科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。
此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）
三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM，25℃培养3---5d，观察伞状生长情况、TSI（三糖铁）斜面30℃培养24h—48h，观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S，不产气的培养物.
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形
再挑取TSI上培养物接种其他生化管。
VP MR H2O2七叶苷鼠李糖木糖甘露醇尿素硝
酸
盐
还
原
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