十单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序
单增李斯特菌PFGE快速分子分型实验室标准操作程序
单增李斯特菌PFGE分型实验室标准操作程序生物安全警示：目前李斯特菌感染剂量尚不确定，取决于宿主的易感性。
高风险感染群体为孕妇、婴儿、免疫力低下病人和老人。
所以，接触李斯特菌的实验人员必须意识到潜在的风险并且注意相关的建议。
Day 0受试培养物单菌落划线于脑心浸液平板，于37℃培养14-18 h。
建议利用螺口管保存菌种一支，并且用同一接种环划线平板。
确保需要时可以对同一培养物进行试验。
Day 11.开启水浴摇床（54-55℃）、水浴箱（55-60℃）和分光光度计。
2.准备TE buffer（10 mM Tris:1 mM EDTA，pH 8.0），配方如下：10 ml 1 M Tris，pH 8.0，2 mL 0.5 M EDTA，pH 8.0，稀释于1000 mL无菌超纯水（临床实验室试剂用水）。
注意：TE buffer用于SeaKem 琼脂糖胶栓制备、悬浮细胞和洗涤裂解的PFGE胶栓。
3.准备溶菌酶（sigma L7651）母液（20 mg/mL），配方如下：a.称量100 mg溶菌酶（器皿放置于冰上保持低温）b.加入5 mL TE buffer，涡旋混合。
c.分装（250 μL）于eppendorf管中，冷冻备用。
4.TE buffer (10 mM Tris:1 mM EDTA，pH 8.0)制备1% SeaKem 金琼脂糖+1%SDS，配方如下：a.20% SDS储液置于55-60℃水浴箱预热；b.称取0.25 g SeaKem 金琼脂糖，加入25 ml TE buffer，温和混匀，微波加热至完全溶解；c.加入2.5 ml 10% SDS，混匀，置于55-60℃水浴箱中备用。
5.将培养物编号标记于Falcon2054管，吸取2 mL TE buffer于管中，用灭菌棉签或接种环刮去培养物，轻轻转动接种环（棉签）将培养物悬浮于TE buffer 中，尽量避免产生气泡。
注意：细胞悬浮液体积大小取决于细胞浊度测定仪的使用体积。
单核细胞增生李斯特氏菌检验操作规程
单核细胞增生李斯特氏菌测定1 提示1.1 注意无菌操作。
2目的用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的测定3检测依据《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌测定（GB 4789.30-2016）》。
4适用范围本法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的测定。
5试验材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1冰箱。
5.2 恒温培养箱。
5.3 均质器。
5.4 显微镜。
5.5 电子天平。
5.6 锥形瓶。
5.7 无菌吸管、微量移液器及吸头。
5.8 无菌平皿。
5.9 无菌试管。
5.10 离心管。
5.11 无菌注射器。
5.12 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111或CMCC54004,或其他等效标准菌株。
5.13 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090,或其他等效标准菌株。
5.14 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119,或其他等效标准菌株。
5.15 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967,或其他等效标准菌株。
5.16 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他产β-溶血环金5.17 马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621,或其他等效标准菌株。
5.18 小白鼠:ICR体重18g～22g。
5.19 全自动微生物生化鉴定系统。
6.培养基和试剂6.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):。
6.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):。
6.3 李氏增菌肉汤LB(LB1,LB2):。
6.4 1%盐酸吖啶黄(acriflavineHCl)溶液:。
6.5 1%萘啶酮酸钠盐(naladixicacid)溶液:。
单核细胞增生李斯特氏菌检验技术
•小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷
10mLLB2
TSA-YE
鼠李糖
TSA-YE
阳性
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定
革兰氏染色
单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强
革兰氏阳性短杆菌
动力试验
MR试验
一、单核增生李斯特氏菌概况
生物学特性
该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；对青霉素、氨苄青霉素、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。
食品中单核增生李斯特氏菌检验
食品微生物检验技术
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个 种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊（伊氏）李斯特氏菌、 英诺克（无害）李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌在李斯特氏菌属只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。
一、单核增生李斯特氏菌概况
李斯特氏菌属
革兰氏阳性,老龄培养物多转为革兰阴性;兼性厌氧,无芽孢、无荚膜;生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长）,pH范围pH4.4-pH9.6;LM的幼龄菌（16~24h的培养物），为革兰阳性小杆菌，常呈V字形，成对排列。在22~25℃环境中形成4根鞭毛，故在25℃肉汤培养液中出现轻微旋转或翻滚样的运动。而在32℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验
乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验YLNB 4.6 1. 仪器及器材1.1 恒温培养箱：30±1℃、24±1℃1.2 恒温水浴锅：46±1℃。
1.3 显微镜：10×～100×1.4 离心机：4000 r/min1.5 均质器或灭菌乳钵。
1.6 灭菌平皿：直径90mm。
1.7 灭菌试管： 16mm×160mm1.8 灭菌吸管：1mL（具有0.01mL刻度）、10mL（具有0.1mL 刻度）。
1.9 冰箱：0－4℃1.10 锥形瓶：100mL、500mL。
1.11 架盘药物天平：0g～500g,精确至0.5g。
1.12 离心管：30mm×300mm。
1.13 灭菌注射器：11.14 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。
1.15 马红球菌。
1.16 小白鼠：16g～18g。
2. 培养基和试剂2.1含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤(TSB－YE)：见附录A1。
2.2含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂(TSA－YE)：见附录A2。
2.3 EB增菌液：见附录A3。
2.4 LB增菌液(LB1，LB2)：见附录A4。
2.5 三糖铁(TSI)琼脂：GB/T4789.28中4.26，4.27。
2.6 SIM动力培养基：见附录A5。
2.7 血琼脂：GB/T4789.28中4.6。
2.8 改良的Mc Bride(MMA)琼脂：见附录A5。
2.9 硝酸盐培养基：GB/T 4789.28中3.17。
2.10 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)：GB/T4789.28中3.4。
2.11 糖发酵培养基：GB/T4789.28中3.2。
2.12 过氧化氢酶试验：GB/T4789.28中4.38。
2.13 盐酸吖啶黄(AcriflavineHCl)(Sigma)。
2.14 萘啶酮酸钠盐(Naladixicacid)(Sigma)。
3. 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下：检样25g(ml)EB增菌液225ml LB1增菌液225ml30℃,48h 30℃,24h30℃,24h30℃,24～48h25℃ 2d ～5d(伞状)30℃,24h30℃,24hLB2增菌液225ml选择性培养基(MMA)SIM 动力培养基 TSI 琼脂TSA-YE 培养基显微镜下观察运动硝酸盐还原实验 过氧化氢酶实验 甘露醇 木醇 鼠李糖 七叶苷 溶血实验协同溶血实验 小鼠致病力实验 革兰氏染色 MR-VP 实验4. 方法4.1 样品的收集及处理无菌取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。
(十)-单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序
DBS22 DBS22/019—2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1。
1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》的要求编写.本标准分为两种检测方法：第一法:单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。
本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心.本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的定量检验方法.本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2。
1 冰箱：2℃～5℃和—18℃.2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃.2.3 均质器。
2.4 显微镜:10×～100×.2。
5 电子天平:感量0。
1 g。
2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。
2。
7 无菌吸管:1 mL（具0。
01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.8 无菌平皿:直径90 mm。
2。
9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2。
10 离心管:30 mm×100 mm.2。
11 无菌注射器:1 mL。
2。
12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。
2。
14 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3。
1 含0。
6％酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中A。
1.3。
2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。
ISO标准(参考译文)单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法
5.1常规原则
对于目前实验室操作，见ISO7218
注意2：因为培养基和试剂的数量较多，其经过了更可取的考虑。出于文章简洁的目的，在附录B中给出其组分和制备。
5.2 初级选择性富集培养基含降低浓度选择性试剂的Fraser培养液（半Fraser培养液）
见条款B.1
5.3含全浓度选择性试剂的选择性次级富集培养液（Fraser培养液）
见条款B.2
5.4选择性固体接种培养基
5.4.1第一个培养基：Oxford琼脂
见条款B.3
5.4.2第二个培养基：PALCAM琼脂
见条款B.4
5.5固体培养基：胰蛋白胨大豆酵母提取物琼脂（TSYEA）
见条款B.5
5.6液体培养基：胰蛋白胨大豆酵母提取物增菌液（TSYEB）
见条款B.6
5.7绵羊血琼脂
4.1应用含降低浓度选择性试剂的选择性富集培养液（半Fraser培养液）进行初级富集
对选择性初级富集培养液（包含1体积氯化锂和半体积吖啶黄以及萘啶酸—半Fraser培养液，也用作检验过程的稀释液）恒温培养，30℃24h；
4.2应用含全浓度选择性试剂的选择性富集培养液（Fraser培养液）进行次级富集
3.2单核增生李斯特氏菌的检验依据本部分ISO11290实施检验，在给定产品的质量和体积的条件下，检验这些微生物的存在或不存在。
4.原理
在本部分ISO11290范围内，单核增生李斯特氏菌检验需要四个连续的阶段（见附录A检验流程图）
注意1：李斯特氏菌可能存在量少并与大量的其它种类细菌混杂，因此需要选择性富集。同时也必须检测受破坏的李斯特氏菌，初级选择性富集培养基，含有降低的抑制剂浓度，可以至少部分达到此目的。
8. 检样制备
单核细胞增生李斯特氏菌及检验
单核细胞增生李斯特氏菌及检验单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的平安具有危急，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威逼人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必需加以重视。
一、生物学特性1、形态与染色该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在养分丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培育中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。
2、培育特性该菌养分要求不高，在20--25℃培育有动力，穿刺培育25天可见倒立伞状生长，肉汤培育物在显微镜下可见翻跟斗运动。
该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培育温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.84.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。
在固体培育基上，菌落初始很小，透亮，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透亮。
在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培育后可产生窄小的β-溶血环。
在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用450角入射光照耀菌落，通过解剖镜垂直观看，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
3、生化反应该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。
单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法
二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法
※初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、
鼠李糖发酵管，于36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，同时在TSA-YE平板上划线，于 36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续 进行鉴定。
04
一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性
※生化特征 ※单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）37 ℃、24 h培养,可以 分解葡萄糖、果糖、海藻糖、水杨苷、鼠李糖，产酸不产气；不分解棉 子糖、肌醇、菊淀粉、卫茅醇、侧金盏花醇、木糖和甘露醇。MR和VP 试验阳性，不产生靛基质，硫化氢阴性。
※ 确认实验-鉴定 ：染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试 验cAMP(可选项目)
04
三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法
※典型菌落计数以及对应的计算公式的应用 ※计数范围要求：选择有典型菌落的平板，菌落数合计在15 CFU~150 CFU之间的平板，计数典型菌落数。 ※计算公式1计算公式2.
04
三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法
※样品的接种 ※根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀 液(液体样品可包括原液)，每个稀释度的样品匀液分别吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板，用 无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。
※小鼠毒力试验(可选项目)
04
二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法
李斯特实验流程
李斯特实验流程
李斯特实验主要包括以下几个步骤：
1. 增菌培养：取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无
选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h
和44h。
2. 样本处理：可能包括离心、过滤等步骤，以获取纯净的李斯特菌样本。
确保处理过程在无菌条件下进行。
3. 显色培养基涂布：使用无菌的移液器或吸管，在李斯特菌显色培养基表面均匀涂布样本。
确保样本均匀分布在培养基上。
4. 培养条件：将培养基培养皿放入恒温培养箱，通常在35-37摄氏度下培养。
设定观察时间点，通常在培养开始后的24小时和48小时后。
5. 观察：在设定的时间点观察实验结果，如果发现有李斯特菌存在，可以进行进一步的鉴定和计数。
请注意，以上步骤仅为一般流程，具体操作可能因实验需求和样品类型而有所不同。
进行实验时，请遵循相关安全规定和操作规范，以确保实验结果准确可靠。
单增李斯特氏菌检测详解
鉴定
血清学检验 菌悬液于80℃水域中加热1h，离心弃上清， 剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清 学玻片凝集试验。
单核细胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B， 1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C， 4D，4E，7
质量控制
每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株 进行质量控制。 样品制备的同时，在空白对照FB1增菌液中 加入新鲜配制的每毫升含有10个～100个单 核细胞增生李斯特氏菌的稀释液1mL和阴性 培养物，按检验程序进行同步检验。
鉴定
溶血试验
刺种7％羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核
细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性
对照菌（英诺克李斯特氏菌），30℃培养24h～ 48h。
单核细胞增生李斯特氏菌 窄小的β溶血环
西尔李斯特氏菌
窄小的β溶血环
绵羊李斯特氏菌
大的β溶血环
其他
不溶血
鉴定
动力试验 穿刺SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）
显色培养基
CHROMagarTM Listeria上单细胞增生李斯特 氏菌菌落特征
225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取 1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二 次增菌25h±1h。
VIDAS快速筛选（可选）
FB2增菌液进行VIDAS快速筛选。 筛选为阴性的结果可直接报告未检出。 筛选为阳性的结果继续分离培养和鉴定。
分离培养
取增菌液一环，划线分离于选择性培养基 OXA、PALCAM上，35℃±1℃培养24h～48h。
报告结果
协同溶血试验、血清学试验可根据需要进 行，常规检验可不进行这些试验。
报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特 氏菌。
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DBS22 DBS22/019-2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求编写。
本标准分为两种检测方法：第一法：单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。
本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心。
本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的定量检验方法。
本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 冰箱：2℃～5℃和-18℃。
2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃。
2.3 均质器。
2.4 显微镜：10×～100×。
2.5 电子天平：感量0.1 g。
2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。
2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.8 无菌平皿：直径90 mm。
2.9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2.10 离心管：30 mm×100 mm。
2.11 无菌注射器：1 mL。
2.12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。
2.14 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A中A.1。
3.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。
3.3 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。
3.4 1%盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附录A中A.3.2.1。
3.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid）溶液：见附录A中A.3.2.1。
3.6 PALCAM琼脂：见附录A中A.4。
3.7 革兰氏染液：见附录A中A.5。
3.8 SIM动力培养基：见附录A中A.6。
3.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中A.7。
3.10 5%-8%羊血琼脂：见附录A中A.8。
3.11 糖发酵管：见附录A中A.9。
3.12 过氧化氢酶试验：见附录A中A.10。
3.13 李斯特氏菌显色培养基。
3.14 API listeria 10300生化鉴定试剂盒。
第一法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法4 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序见图1。
图1 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序5 操作步骤5.1 样品处理冷冻样品应在45℃以下不超过15 min或在2℃～5℃不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于-15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2℃～5℃冰箱保存，24 h内检验。
5.2 样品制备称取样品25g，放入盛有225mL PBS或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。
若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀，作为1：10的样品匀液。
5.3 样品的稀释吸取上述1：10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品匀液。
据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
5.4 样品接种根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别入三块李斯特显色或PALCAM琼脂培养基，然后用无菌L 棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。
使用前，如李斯特显色或PALCAM琼脂培养基表面有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
5.5 分离、培养在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min。
如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36℃±1℃培养24 h±2 h。
如果菌落不典型,可继续培养至48 h±2 h再观察。
在科玛嘉李斯特氏菌显色培养基上，典型菌落为小的圆形蓝色菌落，周围有白色晕圈（其它品牌李斯特氏菌显培养基上的菌落特征按照产品说明书判定）。
典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。
6 确证实验6.1 初筛自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管于36℃±1℃培养24 h；同时在TSA-YE平板上划线纯化，于30℃±1℃培养24 h～48 h。
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
6.2鉴定6.2.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4 μm～0.5 μm）×（0.5 μm～2.0 μm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
6.2.2动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。
6.2.3生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。
单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。
6.2.4溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃培养24 h～48 h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。
6.2.5协同溶血试验（cAMP）：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1℃培养24 h～48 h。
单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。
6.2.6 可选择API listeria 10300生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等生化鉴定系统。
7 结果计算7.1 典型菌落计数和确认7.1.1 选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在20 CFU～200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。
如果：a）只有一个稀释度的平板菌落数在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）所有稀释度的平板菌落数均小于20 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；c）某一稀释度的平板菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d）若所有稀释度的平板菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；e）若所有稀释度的平板菌落数均不在20 CFU～200 CFU 之间且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU 或大于200CFU 时，应计数最接近20 CFU 或200 CFU的稀释度平板上的典型菌落。
以上按公式（1）计算。
f）若2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU 之间，按公式（2）计算7.1.2从典型菌落中至少挑取5个典型菌落（小于5个全选），划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24 h±2 h。
7.2 结果计数公式（1）：T =CdAB…………………………………………………………… （1） 式中：T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；A ——某一稀释度单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数；B ——鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数；C ——用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； d ——稀释因子。
公式（2）： (2)式中：T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；A1——第一稀释度（低稀释倍数）单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； A2——第二稀释度（高稀释倍数）单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； 1.1——计算系数（如果第二稀释度单核细胞增生李斯特氏菌鉴定结果为0，计算系数采用1）； d ——稀释因子（第一稀释度）。
8 结果与报告8.1 根据李斯特氏菌显色培养基或PALCAM 琼脂平板上单核细胞增生李斯特氏菌的典型菌落数，按7中公式计算，报告每g （mL ）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU/g(mL)表示；如T 值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
第二法 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法9 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序见图2图2 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序.1d1222111C B A C B A T +=9.1 基于“三管”MPN法，取检样25 g（mL）加入装有225 mL LB1增菌液中，均质制成1:10稀释液，用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL LB1增菌液的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液。
9.2 另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸管。
9.3 根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度（液体样品可选择原液），每个稀释度接种3支含有9 mL LB1增菌液的试管，每管接种1 mL（如果接种量超过1 mL，则用双料LB1增菌液）。