ISO标准(参考译文)单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法
单核细胞增生李斯特氏菌检验技术
•小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷
10mLLB2
TSA-YE
鼠李糖
TSA-YE
阳性
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定
革兰氏染色
单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强
革兰氏阳性短杆菌
动力试验
MR试验
一、单核增生李斯特氏菌概况
生物学特性
该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；对青霉素、氨苄青霉素、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。
食品中单核增生李斯特氏菌检验
食品微生物检验技术
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个 种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊（伊氏）李斯特氏菌、 英诺克（无害）李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌在李斯特氏菌属只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。
一、单核增生李斯特氏菌概况
李斯特氏菌属
革兰氏阳性,老龄培养物多转为革兰阴性;兼性厌氧,无芽孢、无荚膜;生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长）,pH范围pH4.4-pH9.6;LM的幼龄菌（16~24h的培养物），为革兰阳性小杆菌，常呈V字形，成对排列。在22~25℃环境中形成4根鞭毛，故在25℃肉汤培养液中出现轻微旋转或翻滚样的运动。而在32℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定引言单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，可引起严重的食物中毒和感染疾病。
为了及时诊断和控制该菌的传播，对其进行准确的生化鉴定非常重要。
本文将介绍单核细胞增生李斯特氏菌的生化鉴定方法及相关实验步骤。
实验材料与方法实验材料•单核细胞增生李斯特氏菌培养基•Listeria Enrichment Broth（LEB）•Listeria Agar Base（LAB）•乳清素蛋白水解物培养基（Trypticase Soy Broth，TSB）•乳清素蛋白水解物琼脂培养基（Trypticase Soy Agar，TSA）•碱性亮绿液实验方法1.取一份食物样品，如肉类、奶制品等，加入适量LEB中，并在37℃孵育24小时。
2.取0.1ml培养液，在TSB中进行预培养，37℃孵育24小时。
3.从TSB中取出适量菌液，用胶体金法进行菌落计数，并将菌液稀释至10-4倍。
4.取适量的稀释液分别接种于LAB和TSA琼脂培养基上，并在37℃孵育24小时。
5.观察菌落形态、颜色等特征，并记录下来。
生化鉴定实验单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定步骤如下：1.琼脂凝胶双扩散试验：将单核细胞增生李斯特氏菌抗原与相应的抗血清共同扩散于琼脂凝胶板上，观察是否发生免疫反应。
若有明显的线条或沉淀形成，则说明存在抗原-抗体反应，可以初步判断为单核细胞增生李斯特氏菌。
2.碱性亮绿液试验：将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌与碱性亮绿液接触，观察是否产生绿色荧光。
若产生绿色荧光，则说明菌株具有单核细胞增生李斯特氏菌的特性。
3.单核细胞增生李斯特氏菌脂多糖（LPS）鉴定：采用酚-硫酸法或酚-硝基苯法，将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌进行LPS提取，然后进行比色反应。
若出现红色或紫色沉淀，则说明存在LPS，可以进一步确认为单核细胞增生李斯特氏菌。
结果与讨论通过上述实验方法，我们可以对食物样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行生化鉴定。
单增李斯特氏菌及其检测方法
单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。
李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。
其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。
它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。
LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。
在血琼脂平板上有β溶血环。
在显色培养基上呈蓝绿色。
2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。
⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。
3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。
单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法
二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法
※初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、
鼠李糖发酵管，于36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，同时在TSA-YE平板上划线，于 36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续 进行鉴定。
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一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性
※生化特征 ※单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）37 ℃、24 h培养,可以 分解葡萄糖、果糖、海藻糖、水杨苷、鼠李糖，产酸不产气；不分解棉 子糖、肌醇、菊淀粉、卫茅醇、侧金盏花醇、木糖和甘露醇。MR和VP 试验阳性，不产生靛基质，硫化氢阴性。
※ 确认实验-鉴定 ：染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试 验cAMP(可选项目)
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三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法
※典型菌落计数以及对应的计算公式的应用 ※计数范围要求：选择有典型菌落的平板，菌落数合计在15 CFU~150 CFU之间的平板，计数典型菌落数。 ※计算公式1计算公式2.
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三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法
※样品的接种 ※根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀 液(液体样品可包括原液)，每个稀释度的样品匀液分别吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板，用 无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。
※小鼠毒力试验(可选项目)
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二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析单核细胞（monocytes）是一类存在于人体血液和组织中的白细胞（leukocytes）。
它们作为免疫系统中的重要成分，具有很强的吞噬能力和免疫调节功能。
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，它能够引起严重的人类食物中毒，尤其是婴儿和免疫缺陷患者。
乳粉作为婴幼儿的主要食物，其安全性尤为重要。
为了对乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌的能力进行验证，可以进行以下步骤：1.材料准备:-乳粉样品- 特定培养基（如Listeria Enrichment Broth）-李斯特氏菌（已知培养物）-离心管-培养皿2.试验步骤:a.预处理乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入适量的特定培养基-将混合物在摇床上以适当速度摇匀-使用离心机将样品离心，以除去悬浮的杂质b.培养李斯特氏菌:-取一定量的已知培养物，加入特定培养基中-在适当的温度和湿度下，培养李斯特氏菌至适宜的生长期c.接种乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入特定培养基中-添加已培养的李斯特氏菌（适量）到乳粉样品中-使混合物充分混合d.孵化和观察:-将接种混合物接种到适当的培养皿中-将培养皿置于适当的环境中（温度、湿度等）-在一定时间内观察培养皿中是否有李斯特氏菌的生长3.结果与分析:通过观察培养皿中的生长情况，可以得出以下结论和分析：-如果培养皿中出现了李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。
-如果培养皿中未观察到李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中不存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。
-结果应与对照组进行比较，以确定是否存在显著差异。
需要注意的是，这是仅仅通过培养方法进行初步验证，不能判断乳粉样品的感染风险和食用安全性。
为了更准确地评估乳粉中李斯特氏菌的存在和潜在传播风险，还需要进一步的实验和分析方法，如PCR检测、测定菌群数量等。
同时还应结合临床和流行病学调查数据，做出综合评估和判断。
单增李斯特氏菌检测详解
鉴定
血清学检验 菌悬液于80℃水域中加热1h，离心弃上清， 剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清 学玻片凝集试验。
单核细胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B， 1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C， 4D，4E，7
质量控制
每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株 进行质量控制。 样品制备的同时，在空白对照FB1增菌液中 加入新鲜配制的每毫升含有10个～100个单 核细胞增生李斯特氏菌的稀释液1mL和阴性 培养物，按检验程序进行同步检验。
鉴定
溶血试验
刺种7％羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核
细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性
对照菌（英诺克李斯特氏菌），30℃培养24h～ 48h。
单核细胞增生李斯特氏菌 窄小的β溶血环
西尔李斯特氏菌
窄小的β溶血环
绵羊李斯特氏菌
大的β溶血环
其他
不溶血
鉴定
动力试验 穿刺SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）
显色培养基
CHROMagarTM Listeria上单细胞增生李斯特 氏菌菌落特征
225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取 1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二 次增菌25h±1h。
VIDAS快速筛选（可选）
FB2增菌液进行VIDAS快速筛选。 筛选为阴性的结果可直接报告未检出。 筛选为阳性的结果继续分离培养和鉴定。
分离培养
取增菌液一环，划线分离于选择性培养基 OXA、PALCAM上，35℃±1℃培养24h～48h。
报告结果
协同溶血试验、血清学试验可根据需要进 行，常规检验可不进行这些试验。
报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特 氏菌。
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，是一种常见的细菌性食物中毒病原体。
单核细胞增生组织均为生化鉴定的一种常见方法。
以下是李斯特氏菌生化鉴定的一些特征：
1. 嗜冷性：李斯特氏菌生长适宜温度为2-45℃，菌株能够在4℃下生长，并在冷藏食品中繁殖。
2. β-溶血素产生：李斯特氏菌能够产生β-溶血素，可以通过血琼脂（Blood agar）培养基上的溶血环进行观察。
3. 乳酸发酵：李斯特氏菌是一种革兰氏阳性乳酸菌，能够进行乳酸发酵。
可以使用乳糖发酵基质（Lactose fermentation medium）进行鉴定，如果产生乳酸则为阳性。
4. 半胱氨酸脱羧：李斯特氏菌具有半胱氨酸脱羧酶活性，可以将半胱氨酸转化为硫代氨基酸。
可使用兰氏差异培养基（LDC medium）进行鉴定。
5. 半乳糖酶活性：李斯特氏菌具有半乳糖酶活性，可以将乳糖转化为半乳糖。
可使用半乳糖发酵基质（Rhamnose fermentation medium）进行鉴定。
此外，李斯特氏菌还可以进行PCR扩增目标基因进行鉴定，
如16S rRNA基因、Internal Transcribed Spacer（ITS）区域等。
需要指出的是，单纯进行生化鉴定可能存在一定的误判率，结合其他检测方法可以提高鉴定的准确性。
此外，由于李斯特氏菌在环境中广泛存在，饮食中也常常带菌，所以对于临床病例的确诊还需要结合患者的临床表现、流行病学调查等综合分析。
单核增生李斯特氏菌检测概述
单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。
该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。
李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。
检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。
1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。
培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。
在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。
培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。
2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。
这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。
通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。
3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。
这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。
这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。
需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。
常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。
对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。
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5.1常规原则
对于目前实验室操作，见ISO7218
注意2：因为培养基和试剂的数量较多，其经过了更可取的考虑。出于文章简洁的目的，在附录B中给出其组分和制备。
5.2 初级选择性富集培养基含降低浓度选择性试剂的Fraser培养液（半Fraser培养液）
见条款B.1
5.3含全浓度选择性试剂的选择性次级富集培养液（Fraser培养液）
见条款B.2
5.4选择性固体接种培养基
5.4.1第一个培养基：Oxford琼脂
见条款B.3
5.4.2第二个培养基：PALCAM琼脂
见条款B.4
5.5固体培养基：胰蛋白胨大豆酵母提取物琼脂（TSYEA）
见条款B.5
5.6液体培养基：胰蛋白胨大豆酵母提取物增菌液（TSYEB）
见条款B.6
5.7绵羊血琼脂
4.1应用含降低浓度选择性试剂的选择性富集培养液（半Fraser培养液）进行初级富集
对选择性初级富集培养液（包含1体积氯化锂和半体积吖啶黄以及萘啶酸—半Fraser培养液，也用作检验过程的稀释液）恒温培养，30℃24h；
4.2应用含全浓度选择性试剂的选择性富集培养液（Fraser培养液）进行次级富集
3.2单核增生李斯特氏菌的检验依据本部分ISO11290实施检验，在给定产品的质量和体积的条件下，检验这些微生物的存在或不存在。
4.原理
在本部分ISO11290范围内，单核增生李斯特氏菌检验需要四个连续的阶段（见附录A检验流程图）
注意1：李斯特氏菌可能存在量少并与大量的其它种类细菌混杂，因此需要选择性富集。同时也必须检测受破坏的李斯特氏菌，初级选择性富集培养基，含有降低的抑制剂浓度，可以至少部分达到此目的。
8. 检样制备
制备检样应根据相关产品适当的特定取样国际标准，如果没有特定国际标准，推荐有关各方就此应达成协议。
9．检验步骤
9.1检样份和初始悬浮液
见ISO6887以及所有产品相关的特定国际标准1。
制备初始悬浮液，用5.2中详细说明的选择性初级富集培养基作为稀释液。
通常情况下，制备初始悬浮液是将x g/ml所取检样加入到9x g选择性初级富集培养基（5.2）中，使二者比例1/10（质量：体积或体积：体积）。
国际标准ISO11290-1
第一版1996-12-15
食品和动物饲料微生物学---单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法
第一部分
检测方法
内容页次
1范围1
2参考标准1
3定义1
4原理2
5培养基和试剂2
6设备和玻璃仪器3
7取样3
8取样前处理3
9步骤3
10结果表述7
11检验报告7
附录
A检验步骤图8
B培养基和试剂的组成和配制9
常用微生物试验设备（见ISO7218）以及，尤其是下列：
6.1 干热灭菌设备（烤箱）或湿热灭菌设备（灭菌锅）
见ISO7218
6.2 干燥箱或培养箱，能够维持恒温于25℃±1℃以及50℃±1℃；
6.3 数个培养箱，能够使所培养的培养基、平板以及试管恒温于下列范围：
a) 25℃±1℃
b) 30℃±1℃
c) 35℃±1℃或37℃±1℃
从4.1得到的培养物用高选择性次级富集培养液培养，35℃或37℃48h；
4.3从从4.1及4.2得到的培养物接种到两种选择性平板上
a）Oxford琼脂
b）PALCAM琼脂
保温于30℃、35℃或37℃24h后检查，如有必要，可保温48h后检查可疑的单核增生李斯特氏菌特征性菌落的存在。
4.4确认
再次培养可疑的单核增生李斯特氏菌特征性菌落，如4.3所述接种培养并用适当的形态、生理生化方法检测确认。
ISO6887：1983，微生物学---微生物检验中稀释液制备的一般导则
ISO7281：1996，食品及动物饲料微生物学-O11290适用以下定义：
3.1单核增生李斯特氏菌依据本部分ISO11290实施检验，在固体选择性培养基上形成典型菌落并呈现固有形态、生理生化特征的微生物。
1范围
本ISO11290详细说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数的水平方法。
限于简介中讨论的条件，本ISO11290适用于给人消费和作为动物饲料的产品。
2参考标准
以下标准包含的条件；通过参照这些内容，组成了这部分ISO11290的条件。出版时，引用的这些版本是有效的。所有标准都需要修订，而各机构对本部分基于ISO11290的批准应鼓励调查和应用以下引用标准的最近版本。IEC和ISO成员保留目前有效的国际标准的注册。
见条款B.7
5.8糖发酵增菌液（鼠李糖和木糖）
见条款B.8
5.9动力试验琼脂（可选做）
见条款B.9
5.10 CAMP（Christle，Atkins，Munch-Petersen）协同凝集试验及试验菌株
见条款B.10
5.11过氧化氢溶液
见条款B.11
5.12磷酸盐缓冲液（PBS）
见条款B.12
6．设备和玻璃仪器
6.13 Henry 证明试验设备（选用0
见附录C
6.14 显微镜，最好是相差显微镜，载玻片和盖玻片。
7.取样
重要的是实验室收到的样品必须真正具有代表性，并且样品在运输和储存过程中未受损坏和改变。
取样方法在本部分ISO11290中不会详细介绍，如果没有针对产品的特定取样标准，推荐有关各方就此应达成协议。
C亨氏证明试验16
食品和动物饲料微生物—单核增生李斯特氏菌检测和计数的水平方法
第一部分
检测方法
警告：为了保障实验室人员的安全，强烈推荐执行单核增生李斯特氏菌检验应在具备相应设备条件的实验室进行，在有经验的微生物专家控制下，保温后的一切丢弃物应小心处理。特别是，强烈推荐孕妇不能操作单核增生李斯特氏菌的培养。
6.4 水浴锅，能维持恒温于47℃±2℃
6.5 接种环 铂/铱或镍/铬制成，直径大约3mm，以及同样材料制成的金属丝，或曲棍球杆形状的玻璃L-棒或单用接种环。
6.6 pH计，能读数接近0.01pH单位（25℃），保证测量准确至±0.1pH单位。
6.7试管或烧瓶，适宜容量，用以对培养基进行灭菌和储存和温育液体培养基。
6.8 量筒，容量50ml至1000ml，用以制备稀释液和培养基。
6.9 全打出刻度吸管，标注容量10ml和1ml，刻度分别是0.5ml和0.1ml分度。
6.10 培养皿 直径90至100mm。
6.11适宜于微需氧培养的罐（选用）
6.12混合气体 （选用） 特用于微需氧培养。
5%-12% CO2，5%-15% O2，75% N2