食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验
MMFSCNJ出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法
MM_FS_CNJ_0344出口食品单核细胞增生李斯特氏菌斜射光镜MM_FS_CNJ_0344出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法1.适用范围本方法适用于牛乳、乳制品、水产品、肉及肉制品食品。
其他食品可参照采用。
2.原理概要单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患疾病的致病菌。
在胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA－YE）、选择性培养基（MMA）等平板上用45°角斜射光照射可观察到蓝色菌落；水解七叶苷并与柠檬酸铁铵反应产生黑色菌落。
3.主要试剂和仪器.主要试剂（包括培养基）胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB－YE）（见B1）；胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA－YE）（见B2）；增菌培养液（EB）（见B3）；选择性培养基（MMA）（见B4）；牛津琼脂（见B5）；改良缓冲蛋白胨水（MBP）（见B6）；7％羊血琼脂（见B7）；糖发酵培养基（见B8）；半固体琼脂；尿素琼脂；硝酸盐培养基；MR－VP培养基；三糖铁琼脂（TSI）。
胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨）；盐酸吖啶黄素；萘啶酮酸；复达新；甘氨酸酐；氯化锂；苯乙醇；放线菌酮；多粘菌素E；头孢双硫唑甲氧；磷霉素；柠檬酸铁铵；七叶苷；酚红；D－葡萄糖；D－甘露醇；哥伦比亚琼脂；酵母浸膏；牛肉浸膏。
.仪器微生物学实验室常用设备；解剖镜；斜射灯；平面镜。
4.过程简述.样品如为冷冻食品，应于2～5℃解冻，且不超过18h，若不能及时检验，应置于－15℃保存。
非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在24h之内检验。
.前增菌和增菌前增菌：巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品，冻肉及其它加工食品均应进行前增菌。
无菌操作称取25g样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水（MBP）的均质杯内，高速均质1～2min，制成1∶10样品匀液，转入500mL广口瓶内；液体食品可用吸管吸取25mL样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水（MBP）的广口内，充分振摇制成1∶10样品匀液，于30℃培养24、48h。
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定引言单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，可引起严重的食物中毒和感染疾病。
为了及时诊断和控制该菌的传播，对其进行准确的生化鉴定非常重要。
本文将介绍单核细胞增生李斯特氏菌的生化鉴定方法及相关实验步骤。
实验材料与方法实验材料•单核细胞增生李斯特氏菌培养基•Listeria Enrichment Broth（LEB）•Listeria Agar Base（LAB）•乳清素蛋白水解物培养基（Trypticase Soy Broth，TSB）•乳清素蛋白水解物琼脂培养基（Trypticase Soy Agar，TSA）•碱性亮绿液实验方法1.取一份食物样品，如肉类、奶制品等，加入适量LEB中，并在37℃孵育24小时。
2.取0.1ml培养液，在TSB中进行预培养，37℃孵育24小时。
3.从TSB中取出适量菌液，用胶体金法进行菌落计数，并将菌液稀释至10-4倍。
4.取适量的稀释液分别接种于LAB和TSA琼脂培养基上，并在37℃孵育24小时。
5.观察菌落形态、颜色等特征，并记录下来。
生化鉴定实验单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定步骤如下：1.琼脂凝胶双扩散试验：将单核细胞增生李斯特氏菌抗原与相应的抗血清共同扩散于琼脂凝胶板上，观察是否发生免疫反应。
若有明显的线条或沉淀形成，则说明存在抗原-抗体反应，可以初步判断为单核细胞增生李斯特氏菌。
2.碱性亮绿液试验：将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌与碱性亮绿液接触，观察是否产生绿色荧光。
若产生绿色荧光，则说明菌株具有单核细胞增生李斯特氏菌的特性。
3.单核细胞增生李斯特氏菌脂多糖（LPS）鉴定：采用酚-硫酸法或酚-硝基苯法，将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌进行LPS提取，然后进行比色反应。
若出现红色或紫色沉淀，则说明存在LPS，可以进一步确认为单核细胞增生李斯特氏菌。
结果与讨论通过上述实验方法，我们可以对食物样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行生化鉴定。
(十)-单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序
DBS22 DBS22/019—2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1。
1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》的要求编写.本标准分为两种检测方法：第一法:单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。
本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心.本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的定量检验方法.本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2。
1 冰箱：2℃～5℃和—18℃.2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃.2.3 均质器。
2.4 显微镜:10×～100×.2。
5 电子天平:感量0。
1 g。
2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。
2。
7 无菌吸管:1 mL（具0。
01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.8 无菌平皿:直径90 mm。
2。
9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2。
10 离心管:30 mm×100 mm.2。
11 无菌注射器:1 mL。
2。
12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。
2。
14 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3。
1 含0。
6％酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中A。
1.3。
2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。
食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测分析
食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测分析作者：***来源：《食品安全导刊》2022年第03期摘要：目的：分析食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测结果，以及时发现食品安全隐患，为食品安全监管提供参考依据。
方法：严格按照《全国食源性致病菌监测工作手册》中的单核细胞增生李斯特氏菌检验标准，对某市2021年1—12月定期采样的10类常用食品进行单核细胞增生李斯特氏菌检测，分析其阳性检出率。
结果：897份10类常用食品中，检出单核细胞增生李斯特氏菌36份，阳性检出率为4.01%，结论：食品中存在单核细胞增生李斯特氏菌污染的风险，其中以凉拌菜及冷藏食品的污染风险最高，应加强该方面的防控，确保食品安全。
关键词：单核细胞增生李斯特氏菌;食品安全;检测Detection and Analysis of Listeria Monocytogenes in FoodSHI Hongxia（Ulanqab Center for Disease Control and Prevention Inner Mongolia， Ulanqab 012000，China）Abstract： Objective： To analyze the detection results of Listeria monocytogenes in food，find the hidden dangers of food safety in time， and provide reference basis for food safety supervision. Methods： The detection of Listeria monocytogenes in the national manual for the monitoring of foodborne pathogens shall be strictly followed. According to the test standard， 10 kinds of common foods regularly sampled in a city from January to December 2021 were tested for Listeria monocytogenes， and the positive detection rate was analyzed. Conclusion： There is a risk of Listeria monocytogenes contamination in foods， among which cold dishes and refrigerated foods have the highest risk of contamination. Prevention and control in this regard should be strengthened to ensure food safety.Keywords： listeria monocytogenes; food safety; testing单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于土壤、蔬菜、粪便及多数食品中，该病菌对低温环境具有较好的耐受性，在5 ℃时可大量繁殖，当该病菌进入生物表层后会形成生物膜，并能提高对理化因素的抵抗力，是食源性疾病的主要致病菌之一，可通过粪便或食物进行传播。
食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证结果分析
食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证结果分析作者：彭怡许红玉黄厚强张曲来源：《中国食品》2024年第02期单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM），简称为单增李斯特氏菌，是一种需氧兼性厌氧的食源性病原菌、革兰氏阳性短杆菌，广泛存在于自然界中。
其中，奶制品、肉制品、水产品、海产品、禽类食品、蔬菜等容易受到该菌污染，误食用含有该菌的新生儿、老年人等免疫力低者易患脑膜炎、败血症，孕妇则易发生早产或流产，致死率高达20%-30%，给食品安全造成严重威胁。
近年来，国内外关于单增李斯特氏菌的主要检测方法包括国标法、免疫学检测法、生物传感器检测法等，这些方法各有优缺点。
能力验证通过对实验室间的检验能力进行比对，评价参加者的能力，是证明实验室检验能力的重要方式之一。
资阳市食品药品检验检测中心生物检验科参加了由四川省食品检验研究院组织的“食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证”，采用国标法《GB 4789.30-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》第一法对样品进行定性检验。
一、材料与方法1.样品。
由四川省食品检验研究院提供3份单核细胞增生李斯特氏菌样品，每份样品包括一瓶白色球状西林瓶装和一袋质量约为25g的奶粉，样品编号分别为LM-029、LM-177和LM-307。
2.菌种。
单增李斯特氏菌ATCC 19115、斯氏李斯特氏菌ATCC 35967、伊氏李斯特氏菌ATCC 19119、英诺克李斯特氏菌ATCC 33090，均由广东环凯生物科技有限公司提供。
3.主要试剂。
脑心浸出液肉汤（BHI）、李氏菌增菌肉汤（LB1，LB2）基础、PALCAM 琼脂、李斯特氏菌显色培养基、SIM生化管、HBI单增李斯特氏菌生化鉴定条（GB），购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；李斯特氏菌显色培养基、PALCAM琼脂、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、血平板、革兰氏染色液试剂盒、3%过氧化氢、单增李斯特氏菌干制生化鉴定试剂盒，购自北京陆桥技术股份有限公司。
单核细胞李斯特氏菌检验原始记录第二法平板计数法
1.1—计算系数；
d一稀释因子（第一稀释度）。
结果报告（根据公式计算结果,报告每g（m1）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU∕g（m1）表示；如T值为0,则以小于I乘以最低稀释倍数报告。）
报告人报告日期复核人复核日期
培养基及试剂：
缓冲葡萄糖蛋白陈水：m1配制日期：
李氏增菌肉汤1B：m1配制日期：
李斯特氏菌显色培养基：m1配制日期：
实验过程：
1.样品稀释：
根据样品状态，无菌操作，称取25g∕吸取25m1样品，加入到装有225m1缓冲葡萄糖蛋白陈水或无添加剂的1B肉汤的无菌均质袋中均质，制成1:10样品匀液。
用Im1无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液Im1,沿管壁缓慢注于盛有9m1缓冲葡萄糖蛋白陈水或无添加剂的1B肉汤的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支In1I无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
3.培养
在通常情况下，涂布后，将平板静置10min,如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36C±IC培养Ih;等样品匀液吸收后翻转平板，倒置后于36℃±IC培养24-48hJ_/__/时〜_/_/时）
典型菌落计数和确认：注：“一”表示在选择性平板中无可疑菌落生长。
样品编号
菌落特征以产品说明为准
第一稀释度：
d）所有稀释度的平板菌落数大于150CFU且有」
e）所有稀释度的平板菌落数均不在15CFU~150CF时，应计数最接近15CFU或150CFU的稀释度平标
收，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在15CFU~150CFU
）CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析单核细胞（monocytes）是一类存在于人体血液和组织中的白细胞（leukocytes）。
它们作为免疫系统中的重要成分，具有很强的吞噬能力和免疫调节功能。
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，它能够引起严重的人类食物中毒，尤其是婴儿和免疫缺陷患者。
乳粉作为婴幼儿的主要食物，其安全性尤为重要。
为了对乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌的能力进行验证，可以进行以下步骤：1.材料准备:-乳粉样品- 特定培养基（如Listeria Enrichment Broth）-李斯特氏菌（已知培养物）-离心管-培养皿2.试验步骤:a.预处理乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入适量的特定培养基-将混合物在摇床上以适当速度摇匀-使用离心机将样品离心，以除去悬浮的杂质b.培养李斯特氏菌:-取一定量的已知培养物，加入特定培养基中-在适当的温度和湿度下，培养李斯特氏菌至适宜的生长期c.接种乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入特定培养基中-添加已培养的李斯特氏菌（适量）到乳粉样品中-使混合物充分混合d.孵化和观察:-将接种混合物接种到适当的培养皿中-将培养皿置于适当的环境中（温度、湿度等）-在一定时间内观察培养皿中是否有李斯特氏菌的生长3.结果与分析:通过观察培养皿中的生长情况，可以得出以下结论和分析：-如果培养皿中出现了李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。
-如果培养皿中未观察到李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中不存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。
-结果应与对照组进行比较，以确定是否存在显著差异。
需要注意的是，这是仅仅通过培养方法进行初步验证，不能判断乳粉样品的感染风险和食用安全性。
为了更准确地评估乳粉中李斯特氏菌的存在和潜在传播风险，还需要进一步的实验和分析方法，如PCR检测、测定菌群数量等。
同时还应结合临床和流行病学调查数据，做出综合评估和判断。
单核细胞增生李斯特菌检验
血清学分型:
Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清 学分型.虽然Lm有16种血清型,1/2a、1/2b 、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、 4d、4e、5、6a、6b和7,但只有3种血清型 <1/2a、1/2b、4b>可引起疾病.从食品和患 者中分离的菌株95％以上是1/2a,1/2b,1/2c 和4b等血清型,而3a、3b、3c、4a、4c、4e 、4d和7等血清型在食品中非常少见,也没 有引起李斯特菌病的报道.
溶血反应 ＋ － ＋ － ＋ －
协同溶血
葡萄糖
麦芽糖
MR-VP
甘露醇
鼠李糖
木糖
七叶苷
＋
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V
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动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM培 养基中,于30℃培养24h-48h,李斯特菌有动力, 呈伞状生长.
PCR检测方法：〔1取1ml被检样李斯特氏 菌增菌肉汤用于提取DNA的,模板DNA的 制备, 根据试剂盒说明书进行；〔2PCR反 应体系：20μl .
H2O<二馏灭菌水>12.8μl,
10×buffer2.0μl,
Mg2+<25mol/l> 2.0μl,4×dNTP<10mmol/ml> 1.6μl,Primer<30pmol/μl>各0.25μl,
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食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验
1原理与范围
本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。
本标准适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。
2、培养基、试剂和血清
2.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤；
2.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂；
2.3李氏增菌肉汤LB(LB1，LB2)；
2.4 1%盐酸吖啶黄溶液；
2.5 1%萘啶酮酸钠盐溶液；
2.6 PALCAM 琼脂；
2.7 革兰氏染液；
2.8 SIM动力培养基；
2.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水【甲基红（MR）和V-P试验用】；2.10 5%～8%羊血琼脂；
2.11 糖发酵管；
2.12 过氧化氢酶试验；
2.13 李斯特氏菌显色培养基；
2.14 李斯特氏菌生化鉴定试剂盒；
3 、仪器设备
除微生物室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 高压蒸汽消毒灭菌器；
3.2 冰箱；
3.3 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃；
3.4 生物显微镜；
3.5 电子天平：感量0.1g；
3.6 均质器；
3.7 吸管：1mL，10mL；
3.8 培养皿（直径90mm）；
3.9 培养瓶或三角瓶：容量500mL,250mL；
3.10 试管（，16 mm×160mm）；
3.11 离心管：30 mm×100 mm；
3.12 全自动微生物生化鉴定系统。
4 、检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图1.
图1 单核细胞增生李斯特氏菌检验程序
5 操作步骤 5.1 增菌
以无菌操作取样品25g(mL)加入到含有225mL LB1 增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min —2min ；或放入盛有225mL LB1 增菌液的均质杯中，8000 r/min---10000 r/min 均质1min —2min 。
于30℃±1℃培养24h ，移取0.1mL ，转种于10mL LB2 增菌液内，于30℃±1℃培养18h--24h 。
5.2 分离：
取LB2 二次增菌液划线接种于PALCAM 琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上，于36℃±
1℃培养24h--48h ，观察各个平板上生长的菌落。
典型菌落在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；典型菌落在李斯特氏菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。
5.3 初筛
自选择性琼脂平板上分别挑取 5 个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于 36 ℃±1 ℃培养 24 h ；同时在 TSA-YE 平板上划线纯化，于 30 ℃±1 ℃培养 24 h ～48 h 。
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
5.4 鉴定
5.4.1 染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4 μm ～0.5 μm ）×（0.5 μm ～2.0 μm ）； 用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
5.4.2 动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。
5.4.3 生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和 MR-VP 试验。
单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表 1。
5.4.4 溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20 个～25 个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。
5.4.5 协同溶血试验(cAMP)：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1 ℃培养24 h～48 h。
单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。
5.5 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等对5.3中3个～5个纯培养的可疑菌落进行鉴定。
5.6小鼠毒力试验（可选择）
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE 中，于30 ℃±1 ℃培养24 h，4 000 r/min 离心5 min，弃上清液，用无菌生理盐水制备成浓度为1010 CFU/mL 的
菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3 只～5 只，每只0.5 mL，观察小鼠死亡情况。
致病株于2 d～5 d 内死亡。
试验时可用已知菌作对照。
单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。
6 结果与报告
综合以上生化试验和溶血试验结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。