单核细胞增生李斯特菌检验
FEPAS牛肉单核细胞增生性李斯特菌几种检验方法比较
第３７卷第３期 ２０１２年６月 贵 阳 医 学 院学报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＵＩＹＡＮＧ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ Ｖｏ１．３７ ＮＯ．３ ２０１２．６
ＦＥＰＡＳ牛肉单核细胞增生性李斯特菌几种检验方法
比较水
孔义华 ，焦彦朝ｈ ，刘杰麟 ，高 博 ，罗阿东 ，曹云恒
（１．贵州省出入境检验检疫局技术中心，贵州贵阳５５０００２；２．贵阳医学院医学检验系，贵州贵阳５５ｏｏｏ４）
［摘 要］目的：探讨在食品检验中单核细胞增生性李斯特菌的检验方法。方法：采用常规培养法、全自动酶 联免疫荧光分析仪筛选法、基因探针化学发光检测法、实时荧光定量ＰＣＲ检测法对英国食品检验能力评价体系 （ＦＥＰＡＳ）牛肉单核细胞增生性李斯特菌水平测试提供的二份盲样（Ｍ１６４ｄ０２Ａ和Ｍ１６４ｄＯ２Ｂ）进行检测。结果：４ 种检测方法检测结果一致，样本Ｍ１６４ｄ０２Ａ检出单核细胞增生性李斯特菌、样本Ｍ１６４ｄ０２Ｂ未检出单核细胞增生 性李斯特菌，而实时荧光定量ＰＣＲ检测法灵敏度较高，检测周期较短、特异性较高。结论：实时荧光定量ＰＣＲ 检测法在单核细胞增生性李斯特菌的检测中具有灵敏度高、检测时间短、特异性高等特点。 ［关键词］利斯特菌，单核细胞增生；核酸探针；实时荧光定量ＰＣＲ；检疫 ［中图分类号］Ｒ３７２；Ｒ３７８．９９ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１０００－２７０７（２０１２）０３－０２３８－Ｏ４
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＦＥＰＡＳ
Ｂｅｅｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ
ＫＯＮＧ Ｙｉｈｕａ‘ ，ＪＩＡＯ Ｙａｎｃｈａｏ “，ＬＩＵ Ｊｉｅｌｉｎ。，ＧＡＯ Ｂｏ ，ＬＵＯ Ａｄｏｎｇ。，ＣＡＯ Ｙｕｎｈｅｎｇ。
（，．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｍｐｏｒｔ ａｎｄ Ｅｘｐｏｒｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ＆Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆＧｕｉｚｈｏｕ Ｐｒ￣ｉｎｃｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００２，Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００４，Ｇｕｋｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）
食品中单核细胞增生性李斯特氏菌1
1 食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法
摘 要：通过扩增hly 基因建立检测单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)的PCR
方法。该方法具有较强的特异性，35株经传统方法鉴定的菌株PCR 结果均为阳性，而其他三种同属异种菌，包括英诺克李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和威尔斯李斯特氏菌及非李斯特氏菌均未扩增出特异性的片段。PCR 方法对Lm 纯培养物的最低检测限为7.3CFU/μl，对模拟污染的生猪肉和蔬菜的检测低限为4CFU/g，牛奶为4CFU/ml。应用该方法对285 份食品样品检测，17 份样品Lm 呈阳性，结果与常规的分离培养方法完全一致。该种方法具有敏感、特异、快速及准的优点，可用于食品中L m 的快速检测。
关键词：食品；单核细胞增生性李斯特氏菌；聚合酶链式反应
Abstract ：A polymerase chain reaction (PCR) assay targeting the hly gene was developed to detect
Listeria monocytogenes.The PCR product was detected in 35 L monocytogenes strains and not in other
Listeria spp, including innocua, ivanovii andwelshimer and also not in non-Listeria species, indicating
that this method was highly specific for L. monocytogenes. The detectionlimit of the PCR assay was 7.3
CFU/μl of pure cell culture. The PCR assay could detect4 CFU of L. monocytogenes in thecontaminated
新版单核细胞增生李斯特氏菌的测定1
作业指导书 文 件 编 号： XZJY006-00-2017
版本号/修订状态： 一/第0次修改
单核细胞增生李斯特氏菌的测定 页码/总页数： 1/23
实 施 日 期： 2017.06.23
一、编制目的
为规范本单位单核细胞增李斯特氏菌的检验方法，编制本指导书。
二、适用范围
本指导书规定了食品单核细胞增李斯特氏菌的检验方法。第一法适用于食品中单核细胞增李斯特氏菌的定性检验；第二法适用于单核细胞增李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增李斯特氏菌的计数；第三法适用于单核细胞增李斯特氏菌含量较低（<100CFU/g)而杂菌含量较高的食品中单核细胞增李斯特氏菌的计数，特别是牛奶、水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品。
三、编制依据
GB 4789.30—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》。
四、设备和材料
4.1冰箱:2℃一5℃。
4.2恒温培养箱:30℃±1℃ , 36℃士1℃。
4.3均质器。
4.4显微镜:lOX一100X。
4.5电了天平:感量0.1 g。
4.6锥形瓶:100mL、500mL。
4.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
4.8无菌平皿:直径90mm。
4.9无菌试管:16mm×160mm。
4.10离心管:30mm×100mm。
作业指导书 文 件 编 号： XZJY006-00-2017
1 4.11无菌注射器:1mL。
4.12金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。
4.13马红球菌(Rhodococcus equi)。
4.14小白鼠:16g-18g。
4.15全自动微生物生化鉴定系统。
五、培养基和试剂
5.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)。
5.2含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆琼脂(TSA-YE)。
5.3李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2)。
单核细胞增生李斯特氏菌国家标准检验方法的验证与探讨
Dec. 2018 CHINA FOOD SAFETY 45分析与检测
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是李斯特氏菌属中唯一具有致病性，也是致病力最强的细菌，是一种人畜共患的病原菌。它可以穿过宿主三个屏障，即肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障，然其引起的疾病的发生率不高，但死亡率可达20%~30%[1]。单增李斯特氏菌易于在冷藏食品中存活，是对人类健康危害最大的一种。在4 ℃的储存条件下依然能够生存繁殖，主要存在于牛奶、乳制品、生牛排、羊肉、腌腊食品、西红柿、沙拉、水产品等中。在我国，食品中单增李斯特菌要求为不得检出。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 材料来源 本实验室提供的食品样品，编号YYSJ-2019-003。1.1.2 主要仪器设备 生物安全柜（HR60-ⅡA2）、恒温恒湿培养箱（LHS-250SC）、全自动微生物生化鉴定仪（VITEK 2COMPACT）、 医用冷藏箱（HYC-390）和正置生物显微镜（BX43）。1.1.3 培养基与试剂 李斯特氏菌显色培养基、PALCAM琼脂、SIM动力培养基、血平板，北京陆桥技术有限公司；李氏增菌肉汤（LB1、LB2）、TSA-YE，广东环凯微生物科技有限公司；单增李斯特氏菌生化鉴定试剂盒（比色法），法国Bio Meriuex公司；标准菌株单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）、斯氏李斯特氏菌（ATCC35967）、伊氏李斯特氏菌（ATCC19118）、马红球菌（ATCC6939）、英诺克李斯特氏菌（ATCC33090），美国菌株保藏中心（ATCC）。试验中涉及的试剂和培养基均在有效期内并受质量控制。1.2 方法 按国家标准检验检测方法GB4789.30-2010[2]。首先使用酒精灯对样品表面进行烧灼消毒，之后用无菌剪刀切割并取样25 g深层肌肉，然后加入225 mL LB1增菌液，30 ℃培养24 h。取0.1 mL，转种于10 mL LB2增菌液内，30 ℃培养24 h。在李斯特氏菌显色平板以及PALCAM平板上，通过接种环将LB2增菌液以划线方式接种，并于36 ℃环境中培养24~48 h；同时，接种单增李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、马红球菌标准菌株[3]，分别作为阳性对照和阴性对照。从李斯特氏菌显色平板、PALCAM琼脂平板上取5个以上的可疑菌落，然后，将菌落接种于木糖、鼠李糖中，在36 ℃条件下培养24 h；并在TSA-YE培养基上纯培养后，再按照染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验和协同溶血试验的顺序进行操作。最后，使用李斯特氏菌属鉴定试剂盒和全自动微生物生化鉴定仪鉴定了TSA-YE上纯培养的菌株。2 结果2.1 选择性培养基的培养结果5个PALCAM培养基平板上菌落略微凸起，灰绿色菌落，表面光滑、湿润、边缘整齐，形态一致，周围有棕黑色水解圈；而实验样品和单增李斯特氏菌在李斯特氏菌显色培养基上为蓝绿色菌落，圆形、光滑的表面，边缘整齐、周围有白色晕圈，伊氏李斯特氏菌菌落形态与之相似；斯氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌菌落形态与单增李斯特氏菌相似，只是菌落周围没有水解圈。2.2 菌株生化特征 实验样品及四种李斯特氏菌标准菌株生化反应中，与葡萄糖、MR-VP、麦芽糖、七叶苷、甘露醇等具有相同的反应结果。另外，与木糖反应结果中，除伊氏李斯特氏菌的木糖反应为阳性，其他都为阴性。其中，通过溶血反应区分单增细胞李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌，并且通过协同溶血反应进一步证实英诺克李斯特氏菌的不溶血现象。使用木糖和鼠李糖发酵管反应，可以将单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌、斯式李斯特氏菌区分开， 见表1。2.3 生化鉴定结果 经由李斯特氏菌属生化鉴定板条的10种生化反应，鉴定实验样本和李斯特氏菌属，见表2。 （下转53页）单核细胞增生李斯特氏菌国家标准检验方法的 验证与探讨□ 马 源 边芝慧 赵 苑 陕西省榆林市榆阳区食品检验检测中心摘 要：本文旨在验证、分析和探索食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。方法：依据GB4789.30-2016，首先将实验样品预增菌24 h后，之后，用李斯特氏菌显色培养基和PALCAM琼脂分离培养，将菌株进行染色显微镜观察、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试验、李斯特氏菌属鉴定试剂盒、全自动微生物生化鉴定仪等鉴别菌种的方法。结果：实验样品和单核细胞增生李斯特氏菌以及伊氏李斯特氏菌菌落均在李斯特氏菌显色培养基上呈蓝绿色，周围环绕着白色晕圈，实验样本及4种李斯特氏菌标准菌株均是革兰氏阳性，短杆状，不产芽孢和荚膜；生化反应中与葡萄糖、MR-VP、麦芽糖、七叶苷、甘露醇等发酵反应结果一致。除了伊氏李斯特氏菌在木糖发酵管中反应呈黄色，为阳性外，其他李斯特氏菌菌株都呈绿色，为阴性。在溶血反应中，英诺克李斯特氏菌在血平板上没有溶血，为阴性，而其他菌株产生透明溶血圈，为阳性；由全自动微生物生化鉴定仪鉴定菌株均为李斯特氏菌属。结论：通过对国家标准测试方法—单增李斯特氏菌的验证，建议通过选择性培养基进行分离后，用木糖、鼠李糖生化反应区分单增李斯特氏菌与其他李斯特氏菌，最后用单增李斯特氏菌生化鉴定试剂盒验证，使检测效率提高同时也提升了检测的准确度。关键词：李斯特氏菌；方法验证；生化鉴定
食品中单增李斯特菌检验方法的应用分析
食品中单增李斯特菌检验方法的应用分析
摘要：目的：单增李斯特菌定性检测结合实时荧光PCR和MPN计数法，在食品源性致病菌检测中快速进行定性和定量检测。方法：将单增李斯特菌的菌悬液样品依据不同浓度用细菌培养法和实时荧光PCR法进行比较；分别对当日、冷冻2小时和6小时的增菌液进行MPN计数法定量检测，对三种情况下MPN计数结果进行比较。结果：细菌培养法和实时荧光PCR法检测两者结果一致；MPN计数法定量检测，（1）和（2）结果吻合，与（3）结果有差异。结论：实时荧光PCR检测和MPN计数法相结合，避免样品细菌培养法检测出阳性结果，定量检测时重新取样而导致的结果差异，减短检验周期和工作量，使工作效率得到提升。
关键词：食品；单增李斯特菌；检验方法
连年来，因食品污染单增李斯特菌导致食品中毒的事件逐渐增多，引起社会各界的广泛关注。单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌[1]，多存在于土壤、水产品和动物中，食物中涉及较多的是急冻食品、生菜食物和熟食店食物等。易感人群为新生儿、孕妇和40岁以上的成年人，临床症状表现为发热、化脓性结膜炎和败血症等，死亡率高达30%以上。本文将从实时荧光定量PCR法和MPN计数法相结合，对单增李斯特菌定量检测进行研究，有关情况如下。
1.材料与方法
1.1仪器和试剂
标准菌株采用我市提供的50000株单增李斯特菌，使用实时荧光定量PCR仪和离心机，选取实时荧光定量PCR试剂、全自动微生物鉴定仪和革兰氏阳性细菌鉴定卡，培养基选自李氏增菌肉汤等，均在有效期内使用培养基和试剂。用脑心浸液培养基将80℃标准菌株过夜培养温度控制在30℃，科玛嘉单李斯特显色琼脂平板培养24小时，温度设置为36℃至37℃。菌落的挑选规格为天蓝色、大小适中和周围有白色晕环，将菌落接种于脑心浸液琼脂平板分纯24小时30℃，菌液的浓度利用生理盐水控制在0.5至0.6麦氏单位，将调整好的菌液作为原液，1ml菌液和9ml无菌生理盐水放在试管中，把试管的液体进行均匀搅拌，制作成10-1菌液，重复上面的步骤，菌液制作成10位系列菌液。每进行稀释一次菌液，都要换用1次1ml的无菌吸管[2]，依次稀释到10-9，将2ml菌悬液分别加入2个无菌平皿，将单增李斯特显色培养基放满平皿，培养24小时，温度控制在36℃，计数平皿中天蓝色、大小适中，周围有白色晕环的菌落数，作好空白对照。
单核细胞增生李斯特菌三种检测方法的比较
大理学院学报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＤＡＬＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ 第１２卷第６期２０１３年６月 Ｖ０Ｊ．１２ Ｎｏ６ Ｊｕｎ． ２０】３ ［ＤＯＩ］１０．３９６９／＿ｉ＿ｉｓｓｎ．１６７２—２３４５．２０１３．０６．０１１
单核细胞增生李斯特菌三种检测方法的比较
张垣榕，颜 军，李文龙，侯敏，蒋玉佳，卜 舒，李桂满
（昆明市疾病预防控制中心，昆明 ６５０２２８）
［摘要］目的：通过比较国标法、ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ法￣ＺＬＡＭＰ方法，得到适合基层实验室快速检测单核细胞增生李斯特菌的方法。方 法：分别用国标法、ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ法和环介导的等温扩增（１ｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）法检测李斯特菌，并进 行方法比较。结果：三种方法对单增李斯特菌的检测结果一致．国标法整个检测过程需５～７ ｄ；ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ法实验条件要求高， 成本高，检测需１．５－２．５ ｄ；ＬＡＭＰ法实验条件低，成本低，检测时限与ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ相同。结论：ＬＡＭＰ法检测单增李斯特菌灵敏度 高、特异性强、快速高效和低成本，适合基层实验室应急检测和现场监测使用。 ［关键词］国标法；ＬＡＭＰ；ＰＣＲ；单核细胞增生李斯特菌检测 ［中图分类号］Ｒ１５５．５［文献标志码］Ａ［文章编号］１６７２—２３４５（２０１３）０６—００３８—０５
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＺＨＡＮＧ Ｘｕａｎｒｏｎｇ，ＹＡＮ Ｊｕｎ，ＬＩ Ｗｅｎｌｏｎｇ，ＨＯＵ Ｍｉｎ，ＪＩＡＮＧ Ｖｕｊｉａ，ＢＵ Ｓｈｕ，ＬＩ Ｇｕｉｍａｎ （Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２８，Ｃｈｉｎａ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｆｉｎｄ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）ｉｎ ｇｒａｓｓｒｏｏｔｓ ｌａｂｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ： ＧＢ ｌａｗ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ＬＡＭＰ ｗｅｒｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＬＭ，ｔｈｅｎ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｏｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｑｕｉｔｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＧＢ ｌａｗ ｔｏｏｋ ５ ｔｏ ７ ｄａｙｓ．Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｈｉｇｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｓｔ ｔｏｏｋ ２．５ ｄａｙｓ．ＬＡＭＰ ｍｅｔｈｏｄ，ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｌｏｗ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｓｔ，ｔｏｏｋ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ａｓ ｔｈｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｗａｓ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＬＭ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｂｙ ｇｒａｓｓｒｏｏｔｓ ｌａｂｓ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｊ ＧＢ ｌａｗ；ＬＡＭＰ；ＰＣＲ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
引言
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，可引起严重的食物中毒和感染疾病。为了及时诊断和控制该菌的传播，对其进行准确的生化鉴定非常重要。本文将介绍单核细胞增生李斯特氏菌的生化鉴定方法及相关实验步骤。
实验材料与方法
实验材料
• 单核细胞增生李斯特氏菌培养基
• Listeria Enrichment Broth（LEB）
• Listeria Agar Base（LAB）
• 乳清素蛋白水解物培养基（Trypticase Soy Broth，TSB）
• 乳清素蛋白水解物琼脂培养基（Trypticase Soy Agar，TSA）
• 碱性亮绿液
实验方法
1. 取一份食物样品，如肉类、奶制品等，加入适量LEB中，并在37℃孵育24小时。
2. 取0.1ml培养液，在TSB中进行预培养，37℃孵育24小时。
3. 从TSB中取出适量菌液，用胶体金法进行菌落计数，并将菌液稀释至10-4倍。
4. 取适量的稀释液分别接种于LAB和TSA琼脂培养基上，并在37℃孵育24小时。
5. 观察菌落形态、颜色等特征，并记录下来。
生化鉴定实验
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定步骤如下：
1. 琼脂凝胶双扩散试验：将单核细胞增生李斯特氏菌抗原与相应的抗血清共同扩散于琼脂凝胶板上，观察是否发生免疫反应。若有明显的线条或沉淀形成，则说明存在抗原-抗体反应，可以初步判断为单核细胞增生李斯特氏菌。
2. 碱性亮绿液试验：将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌与碱性亮绿液接触，观察是否产生绿色荧光。若产生绿色荧光，则说明菌株具有单核细胞增生李斯特氏菌的特性。
3. 单核细胞增生李斯特氏菌脂多糖（LPS）鉴定：采用酚-硫酸法或酚-硝基苯法，将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌进行LPS提取，然后进行比色反应。若出现红色或紫色沉淀，则说明存在LPS，可以进一步确认为单核细胞增生李斯特氏菌。
(十)-单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序
DBS22
DBS22/019—2012
吉林省食品安全地方标准
食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测
2013年 发布 2013年 实施
吉林省卫生厅 发布
前 言
本标准根据GB/T1。1—2000《标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则》的要求编写.
本标准分为两种检测方法：
第一法:单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；
第二法：MPN计数法 。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。
本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心.
本标准负责起草人: 刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇 1
吉林省食品安全地方标准
食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测
1 范围
本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的定量检验方法.
本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2。1 冰箱：2℃～5℃和—18℃.
2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃.
2.3 均质器。
2.4 显微镜:10×～100×.
2。5 电子天平:感量0。1 g。
2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。
2。7 无菌吸管:1 mL（具0。01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.8 无菌平皿:直径90 mm。
2。9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2。10 离心管:30 mm×100 mm.
2。11 无菌注射器:1 mL。
单核细胞李斯特氏菌检验原始记录第二法平板计数法
单核细胞增生李斯特氏菌检验原始记录（第二法平板计数法）
检验单位
检验员
检验日期 至 环境条件 温度 ____ ℃,相对湿度 _______ %
检验依据 GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》
样品名称
产品批号
仪罂设备及耗材：
电子天平、洁净工作台、电热恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、水浴锅、移液器、涂布棒
培养基及试剂：
缓冲葡萄糖蛋白陈水： ___________ m1 配制日期： __________________
李氏增菌肉汤1B： _______________ m1 配制日期： __________________
李斯特氏菌显色培养基： _______________ m1 配制日期： _________________
实验过程：
1 .样品稀释：
根据样品状态，无菌操作，称取25g∕吸取25m1样品，加入到装有225m1缓冲葡萄糖蛋白陈水或无添加剂的1B肉汤的无菌均质袋中均质，制成1:10样品匀液。
用Im1无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液Im1,沿管壁缓慢注于盛有9m1缓冲葡萄糖蛋白陈水或无添加剂的1B肉汤的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支In1I无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
按以上操作步骤，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次ImI无菌吸管或吸头。
2 .样品的接种
根据对样品污染状况的估计，选择2个-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），每个稀释度的样品匀液分别吸取Im1以0.3m1、0.3m1、0.4m1的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板，然后用无菌1涂布棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如琼脂平板表面有水珠，可放在25βC-50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
3 .培养
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定 2
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，是一种常见的细菌性食物中毒病原体。单核细胞增生组织均为生化鉴定的一种常见方法。
以下是李斯特氏菌生化鉴定的一些特征：
1. 嗜冷性：李斯特氏菌生长适宜温度为2-45℃，菌株能够在4℃下生长，并在冷藏食品中繁殖。
2. β-溶血素产生：李斯特氏菌能够产生β-溶血素，可以通过血琼脂（Blood agar）培养基上的溶血环进行观察。
3. 乳酸发酵：李斯特氏菌是一种革兰氏阳性乳酸菌，能够进行乳酸发酵。可以使用乳糖发酵基质（Lactose fermentation
medium）进行鉴定，如果产生乳酸则为阳性。
4. 半胱氨酸脱羧：李斯特氏菌具有半胱氨酸脱羧酶活性，可以将半胱氨酸转化为硫代氨基酸。可使用兰氏差异培养基（LDC
medium）进行鉴定。
5. 半乳糖酶活性：李斯特氏菌具有半乳糖酶活性，可以将乳糖转化为半乳糖。可使用半乳糖发酵基质（Rhamnose
fermentation medium）进行鉴定。
此外，李斯特氏菌还可以进行PCR扩增目标基因进行鉴定，如16S rRNA基因、Internal Transcribed Spacer（ITS）区域等。
需要指出的是，单纯进行生化鉴定可能存在一定的误判率，结合其他检测方法可以提高鉴定的准确性。此外，由于李斯特氏菌在环境中广泛存在，饮食中也常常带菌，所以对于临床病例的确诊还需要结合患者的临床表现、流行病学调查等综合分析。