鸦胆子素A诱导非小细胞肺癌细胞株H460凋亡及机制的初步研究

结果 MTT 结果表明，与对照组相比，BA 能显著抑制 H460 细胞增殖。对 A549、H1299、H1355 三株非小细胞 肺癌细胞系进行抑制增殖作用检测，结果显示 BA 对三株 细胞系均有不同程度抑制作用。BA 作用 48 h 后，各浓度 BA 处理 H460 细胞凋亡率均高于对照组，具有时间依赖 性，差异具有统计学意义。BA 处理组可见明显的染色质凝 集，细胞核碎片化，DNA 损伤标志蛋白 γ-H2AX 表达明显 增加。Western blot 结果显示，BA 作用 48 h 后，促凋亡 蛋白 Bax 表达升高，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表达降低，与对照 组相比，Bax/Bcl-2 比值显著升高。同时与对照组相比，凋 亡通路中的 cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 表达明显 增加，并引起凋亡标志蛋白 PARP 切割。RT-PCR 结果显 示，BA 处理 H460 细胞后，与对照组相比，Bcl-2 基因表 达显著降低。
中国医药生物技术 2019 年 8 月第 14 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 2019, Vol. 14, No. 4
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人非小细胞肺癌细胞株 H460 购自美国 ATCC；胎 牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国 Gibco 公司；RPMI1640 细胞培养基、细胞培养用磷酸盐 缓冲液（PBS）、0.25% 胰蛋白酶、10000 U/ml 青霉 素 G-链霉素均购自美国 Hyclone 公司；RNase A、 四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国 Amresco 公 司；PVDF 膜、ECL 化学发光显色液购自美国 Millipore 公司；Bradford 蛋白定量试剂、5 × 上样 缓冲液由普利莱基因技术有限公司提供；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自北京四正柏 生 物 科 技 有 限 公 司 ； Hoechst 33342 和 β-actin （A1978）抗体购自美国 Sigma 公司；细胞裂解液、 Western blot 所 用 一 抗 购 自 美 国 Cell Signaling Technology 公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购自 北京中杉金桥生物技术有限公司；其他无机试剂均
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 实验试剂 鸦胆子素 A（CAS 25514-31-2， HPLC ≥ 98%）购自南京春秋生物工程有限公司；
基金项目：国家自然科学基金（500101206） 作者单位：100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所 （李聪、王燕、蒋建东），医药生物技术研究所（赵晓丽、王真） 通信作者：蒋建东，Email：jiang.jdong@；王真，Email：wangzhen @ 收稿日期：2019-03-06
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中国医药生物技术 2019 年 8 月第 14 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 2019, Vol. 14, No. 4
DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.002
·论著·
鸦胆子素 A 诱导非小细胞肺癌
细胞株 H460 凋亡及机制的初步研究
结论 BA 能抑制人非小细胞肺癌细胞株 H460 细胞增殖， 显著诱导其凋亡，该作用与 BA 引起 DNA 损伤并激活线 粒体凋亡通路有关。
【关键词】 鸦胆子素； 细胞凋亡； 癌，非小细胞肺；
H460 细胞

中国医药生物技术, 2019, 14(4):294-301
肺癌是世界上发病率、死亡率最高的恶性肿瘤
李聪，王燕，赵晓丽，王真，蒋建东H460 细胞凋亡的影响和作用机制。
方法 用 BA 对 H460 细胞进行处理，采用 MTT 法检测 细胞增殖情况，并利用 Annexin V-FITC/PI 双染法检测 BA 对 H460 细胞凋亡的影响。Hoechst 33342 染色和免疫荧光 染色观察细胞凋亡时染色质的凝集以及 DNA 损伤标志蛋 白 γ-H2AX 表达情况。Western blot 和 RT-PCR 检测 H460 细胞内凋亡相关蛋白表达水平。
之一，其中非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer， NSCLC）占到 85%。统计显示，NSCLC 患者 5 年 生存率极低（约 15%），原因是患者早期症状不明 显，约有 75% 的患者发现时已处于中晚期[1]，平 均生存期仅为 4 个月[2]。目前的治疗方法主要是手
术治疗、放化疗、免疫治疗、分子靶向治疗以及药 物辅助治疗等[3-4]。手术方法和放化疗是临床常用治 疗手段，但具有一定局限性；免疫治疗和分子靶向 治疗，应用时间尚短，其安全性和有效性仍需进一 步认证[5-6]。目前，从天然产物中发现抗肿瘤活性化 合物是新药发现的主要途径，植物来源的紫杉醇、 长春新碱等已广泛应用于临床治疗，因此寻找新的 活性高、毒副作用小的药物迫在眉睫。近年来，研 究人员尝试从天然产物中发现能有效抑制恶性肿 瘤的活性成分用于非小细胞肺癌的治疗。
鸦胆子素 A（bruceine A，BA）又称鸦胆子苦 素 A，是从植物鸦胆子[Bruceine javanica (Linnaeus) Merrill]果实中提取分离的苦木内酯类化合物。中医 认为，鸦胆子味苦、性寒，有小毒，归大肠、肝经， 有清热、解毒、截疟、止痢和腐蚀赘疵之功效[7]。 在我国南部地区，鸦胆子多用作抗疟药，临床常将 鸦胆子油乳剂用于肺癌及肺癌脑转移、肝癌和消化 道肿瘤的辅助治疗。有研究表明鸦胆子油乳剂具有 诱导细胞凋亡达到人急性髓性白血病的潜力[8]，但 关于鸦胆子中的单体成分 BA 是否具有抗肿瘤作 用，目前尚无实验数据。本实验拟利用 H460 细胞 这一 NSCLS 细胞株，针对 BA 进行体外抗肿瘤 作用研究，主要观察其抑制 H460 细胞增殖及诱导 凋亡作用，同时探讨 BA 作用下 H460 细胞发生 凋亡的可能分子机制。