清醒动物脑部微透析操作流程
脑和脊髓微透析采样技术的理论
脑和脊髓微透析采样技术的理论、方法和应用1王云综述 1 岳云2史琳审校1首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉科（100020）2比利时布鲁塞尔自由大学医学中心麻醉科1、概述全麻下中枢神经系统功能变化的研究是麻醉学领域内重要的课题之一，全麻下中枢神经系统的功能诸如学习和记忆、感觉和运动、觉醒与无意识等的变化与神经元之间的信息传递有着极大的关系。
而神经元之间的信息的传递是以递质分子的释放、识别和灭活为基础的。
神经细胞间隙是神经元之间传递信息的主要场所，因此了解全麻下中枢神经系统活动机理，必须对神经细胞间隙中的化学物质进行动态监测。
传统的神经化学的研究大多是对离体脑组织的分析，这些离体分析方法所提供的通常是一种静态的、混杂的结果，包括了细胞器、细胞浆及细胞外液中成分的总和。
随着认识的深入和材料科学的进步，人们在推挽灌流基础上发展了的微透析技术，再加上微量递质检测技术的飞速发展，使得活体动物神经递质的在线测量成为可能，从而使行为学的研究与中枢神经系统相应区域的神经递质的释放相联系起来，有利于更深层次地揭示整体动物神经活动过程中的化学调控规律。
目前，此技术已成为研究全麻下神经化学特别是神经递质和神经肽的重要手段，并开始应用于疼痛的脑和脊髓机理的研究，临床上亦有使用该技术监测脑代谢的报道。
2、脑和脊髓微透析的原理2．1原理微透析是监测活体组织细胞外化学物质变化的一种技术，它以小分子物质和水能通过半透膜顺浓度梯度扩散的原理为基础。
将透析膜植入特定区域，用组分和理化性质类似于相应组织细胞外液的溶液进行持续灌流，当待测物质的浓度在透析膜一侧较高时，这些物质就会顺浓度梯度进行扩散。
由于灌流的持续进行，透析管内的液体不断的流动更新，因此跨膜浓度梯度始终存在。
通过不断收集一定量的灌流液测定其中的待测物质的含量，从而达到对该物质的动态监测。
2．2回收率（recovery）微透析探头的透析效能可以它对待测物质的回收率来表示，通过比较透析液和探头外介质中待测物质的浓度可以确定该物质的回收率。
利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法
利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法本文通过查询文献并结合笔者的实际操作经验，介绍微透析技术原理，以及利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法。
标签：微透析；透析液；立体定位；rACC脑区；大鼠前扣带皮层（anterior cingulate cortex，ACC），尤其是其吻侧部（rostral ACC，rACC）是参与情绪情感反应的重要中枢[1-3]。
已有研究证实，rACC也是伤害性刺激传入高位中枢时形成痛厌恶情绪的重要脑区[4-6]，那么在痛情绪发生时rACC脑区神经元释放的神经递质有何变化是我们所关注的。
微透析技术正是一种可以探究这一問题的手段。
该技术是将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术，具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点[7]。
目前，微透析技术主要应用于大脑、血液、脊髓等部位[8-11]，通过定位后取样再检测，观察目标神经递质的相对变化，可在麻醉或清醒的生物体上使用。
在清醒生物体上进行微透析实验比起麻醉生物体，取得的样本会更接近于正常生理状态[12]。
但由于动物处于可自由活动的状态，存在很多不确定因素，因此实验中所需的条件和对动物的各种操作均要在不断地摸索和尝试中确定。
笔者通过查询文献并结合作者的实验操作经验，介绍利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法，现报道如下。
1 定位1.1 微透析探针的选取微透析探针的供应商有瑞典的CMA公司，美国的BAS公司和日本的EICOM公司，另外也有实验室采用自制的微透析探针。
本实验室采用的是EICOM公司的探针，根据定位脑区的深度和所需检测的目标神经递质的分子量大小（一般检测的神经递质为氨基酸类神经递质和单胺类神经递质），选择所需的探针规格。
EICOM公司的脑组织探针主要有三个系列，本实验室选用的探针样式为A-Z系列带有导管、内芯和导管配套的螺帽，探针规格为管长4 mm，膜长2 mm，膜材料：人造纤维素，50 kDa截留分子量，见图1。
微透析取样技术在药动学方面的应用
１ ． 统 组 成 ２系 态 下取血得到样本 ， 两者的吸收和分布会有差异 ， 然而微透析方法可 以 微透 析系统 的组成 主要分为 四个部 分 ， 微注射泵 、 微透析探针 、 微 更 加直接 的取得药物作用靶 部位的细胞外 液游离药物 的样本 ， 且用 同 收集 器以及连接 这些 部分的导管 。其中最主要 的部分是微透析探 针 。 位素法实时校正探针的 回收率 ， 使实验数据更精确且可靠性更高 ， 体现 微 透析探针有 多种类 型 ， 同心 圆型的探针ｎ是现在应 用最为广泛 的探 了微透析技术应用于脑 内药动学研究 的优越性 。 针 。这种探针是 一种顶端连有半 透膜的 同心 圆型套管 ， 主要应 用于脑 另外 ， 透析技术也 为药物在对血脑 屏障穿透性 的研 究方面提供 微 内微透析实验 。除了同心圆形探针外 还有柔性探 针 、 线性探 针 、 分流探 了更加有效的试验方法 。血脑屏障是保持 中枢神经系统 内微环境稳定 针等 ， 每种探针所应用 的条件是不 同的 ， 实验时需要根据实验的具体 的重要屏障 。也正是因为有血脑屏障 的存在 ， 在 很多药物难 以进入脑 内， 要求来选择不 同类 型的探针进 行实验 。有 些时候 在考虑到实验成本或 使一些药物无法发挥其原有的效应 。利用微透析取样技术和现代检测 技术联用 ， 以准确 的测定药物转运至脑 内的含量 ， 于研究药物对血 可 用 则实验需 要特殊类型 的探针时 ， 可以实验室 自制微透析探针 ， 也 辛亮 等人对 微透析探 针进行研究后 自制了同轴 型微 透析探针 ， 并对 此探针 脑屏障穿透性 。马爱梅等 在研究 Ｐ 糖蛋 白对卡马西平和苯妥英钠通 一 进行 了性 能评 价 ， 实验结 果显示 实验室 自制探针性能稳定 ， 可用于体 内 过大 鼠血 脑屏障 的影 响时在大 鼠的大 脑皮质内放置微透 析探针 ， 既是 微 透析研究 。微 透析系统建立成 功后 ， 因为药 物在探针 内外存 在浓度 为 了收集透析液 ， 检测卡马西平和苯妥英钠在脑 内的浓度 ； 又是为 了将 Ｐ 糖蛋白拮抗剂 ） 局部应用 于靶部位 。经过腹腔注射卡马西 差 ， 系处 于不平衡 的状 态 ， 体 透析液中的药物也只是靶器官细胞外液中 维拉帕米 （一 ２ｍ ／ ） ｋ ５ｍ ／ ） ｋ 用 药 物的一部分 ， 需要测定微透 析探针 的相对 回收率。而微透 析探针 平 （０ ｇ ｇ 和苯妥英 钠 （０ ｇ ｇ 收集 透析液后 ， 高效液相 色谱进 故 结果显示 ： 应用 维拉帕米后 ， 卡马西平和苯妥英钠 在脑 内的浓 的相对 回收率受到很多 因素 的影响 ， ： 如 温度” 、Ｈ 待测物质 的相 行分析 ， ｐ 值ｕ 、 在大 鼠的脑 细胞外液 中 ， 马西平 和苯妥英钠 分别在 卡 对分子质 量 、 的半径 和长度ｕ 、 探针 灌流液的组成和灌流速度 、 微透析 度都 有所上升 ， 膜 的性 质 以及生 物体本 身一些因素 的影响等 。所 以还 需要对探针的 ６ ｍｉ［１ ４± ．８ ｐ ／ 】 ９ ｍｉ［１ ７± ．１ ￣ ／ ］ ３ ｒｉ［１ ８ － ０ ｎ（． Ｏ２ ） ．ｍｌ ０ ｎ（． ０３ ）ｘ ｍ１和 ０ ｎ（ ． ７ ｇ ， ８ ｇ ａ ０４ 相对 回收率进行校正口 ， 到较为准确 的实验结果 。 哪 以得 ０３ ） ｇｍ １６ ｍｉ［１５ ＋ ．２ ￣ ／ １ １０ ｎ（．１ Ｏ１ ） ｇｍ１内 药 ．０ ￣ ／ ｌ，０ ｎ（ ． ＿ ２ ） ｇ ，５ ｍｉ［Ｏ９ ± ．９ ￣ ／ ］ ４０ ｍｌ １ ． ３技术特点 物浓度与未 添加维 拉帕米的脑细胞外液中卡马西平 ６ ｒｉ［１ ５ Ｏ２ ） ０ ｎ（． ± ．１ ａ ４ 在药动学研究 中 ， 的方 法往往 是以收集血液 、 传统 尿液等或则是采 ｐ ／ ］９ ｍｉ［１５ ￣ ． ） ｇｍ］ 苯 妥 英 钠 ３ ｍｉ［Ｏ８ － ．Ｏ ￣ ／ ］ ￣ ｍ１ ０ ｎ（ ． ０２ Ｉ ／ １ ｇ ， ２ ２ｘ 和 ０ ｎ（．０． ２ ） ｇｍ１ ０ ， 取组织匀 浆的方法来研 究药物在体内的变化过程。 即在给药后不 同时 ６ ｍｉ［１ ４ Ｏ２ ） ｇｍ １１０ ｎ（．２ ０１ ） ｇｍ］ ０ ｎ（． ± ．３ ￣ ／ ｌ，５ ｍｉ［Ｏ７ ＿ ．５ Ｉ ／ １ ２ ＋ ｘ 的药物浓度相 比具 间点采取血样 或者活检组织制成 匀浆 ， 测定 血浆或组织匀浆 中的药物 有统计学 差异 ， 明维拉 帕米 的应用 可以提高卡马西 平和苯妥英钠通 说 浓度， 以血浆 药物浓度或则组 织匀浆药物浓 度对时间绘制 药物浓度一 过大 鼠的血脑屏障。因此 ， 以推 断出 Ｐ 糖 蛋 白限制 了卡马��
宠物疾病诊疗-电解质及血气检查--采血
静脉血采集
应用：
为了获得静脉血样本进行分析。
常用解剖部位：
颈静脉、前肢头静脉、后肢外侧隐静脉、 后肢内侧隐静脉
常用部位
颈静脉
颈外静脉是位于颈静脉沟内的浅表大静脉，颈静脉沟位
于颈部两侧，气管的背外侧。
颈静脉采血方法
小型犬和猫俯卧保定与桌子上，以便 进行颈静脉穿刺术。紧靠腕关节上方抓住 前肢，并将前肢拉出桌子边缘。伸展动物 的颈部，使其鼻子朝向天花板。
头静脉采血方法
左右头静脉是位于前肢头侧面的浅表静脉，很容易进行静 脉穿刺。
头静脉穿刺的保定方法
保定人员应站在将要抽血肢的对侧，用一只 手臂环绕动物的颈部以保定其头部，并使其远离 抽血肢。用另一只手臂抓住动物的肘部向前推， 使该肢伸展。
用手握住前肢，将头静脉向外翻转并压迫， 使静脉充血扩张。
固定头静脉
中型犬可俯卧或坐在桌子上，用一个 手臂环绕犬的身体，使之贴着保定人员的身 体，另一只手保定头部，使其鼻子朝向天花 板。
大型犬可坐在地上，保定人员跨在全身 上，将其鼻子朝向天花板
在胸腔入口处按压气管外侧的颈静脉沟，使静脉 充血扩张。
用酒精消毒，触摸扩张的静脉，摸清它从下颌角 到胸腔入口处的路径。
针尖斜面向上，针头与静脉成20 ° -30°角刺入。 血样采集完后，立刻放松压迫静脉的手，停止抽 吸，从静脉内拔出针头。轻轻压住静脉穿刺点约60s。
保定者用一只手伸展猫的颈背，另一只手屈 曲上面的后肢。穿刺者抓住靠近桌面的后肢跖部 ，并使其伸展。
保定人员对腹股沟部施压，压紧内侧隐静脉 使之充血扩张。
外侧隐静脉穿刺的合理保定姿势
动物侧卧保定，四朝向静脉穿刺者，背部靠 近保定人员。
保定人员用一只手抓住动物两前肢，轻轻提起 使其离开桌面，同时用同一只手的前臂对动物的颈部 施压以保定动物。用另一只手抓住位于上方的后肢。
线性微透析探针用户指南(上)
LM线性探针用户指南02/06转A-1340介绍微透析采样的应用起源于神经科对于大脑内部组织的研究。
微透析采样技术在药代动力学中的应用已被证明有许多优势：比如频率更高的采样数据点，更加纯净的样品，以及样品在每次研究中在被试动物体内更少的损耗。
BAS线性组织探针适用于对于外周组织的体内采样：例如真皮层、皮下组织、肌肉、肝脏等器官。
微透析探针由一截短的中空透析纤维分别与窄孔的入口和出口管连接而成。
与组织周围体液中成分相近的灌注液以恒定的流速泵入并通过探针。
小分子量分析物可以在探针内外自由扩散，而大分子如蛋白质或蛋白质化合物则被透析膜排除在探针外。
进入透析管内的分子被连续流动的灌流液不断带出。
透析所得液体将被收集起来以供分析。
设计标准探针透析膜的有效长度有10毫米或5毫米两种。
设计长的入口和出口管能够在用于清醒的动物时，使得探针在皮下组织更容易外化。
纤维骨架有助于增加探针植入时的强度。
塞子在纤维骨架延伸的一端密封探针。
这个塞子可防止在手术中有体液进入探针。
它需要在探针连接到注射推进器并被灌注液体前切断。
半透膜纤维骨架临时塞子（保护探头在植入）探针制备半透膜的腔体内涂有一层甘油保护膜。
在去除之前，甘油可能会干扰实验结果或影响恢复。
因此在体内研究中，探针植入时一般不需要冲洗。
甘油会在组织的正常恢复过程中代谢吸收（通常在植入手术完成数天后）。
由于需要去除塞子，因此不建议对进行体内研究的探针进行预处理。
此外，一旦润湿，半透膜将变得更加柔软和难于操作。
对于体外研究，临时塞子必须在灌注液体前去除。
将探针浸入水、林格氏液或人工脑脊髓液中，同时灌注相应溶液30分钟（2μL/ min），即可除去甘油。
探测效率微透析采样通常不会在平衡条件下进行，因此探针内的溶液将与周围组织液产生浓度差。
灌注液的流速通常过快，使得它在探针内外样品浓度达到平衡之前带走样品。
透析液中分析物的浓度相对于样品基质中的浓度称为回收（recovery）。
微透析技术
微透析技术一、微透析技术微透析(Microdialysis)技术是一种将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术。
具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点。
可在麻醉或清醒的生物体上使用，特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。
目前已成为实验神经生理学和神经化学的重要研究工具之一, 它可提供递质释放、摄取和代谢的必要信息。
1、主要原理以透析原理作为基础，通过对插入生物体内中的微透析探头在非平衡条件下进行灌流，物质沿浓度梯度逆向扩散，使被分析物质穿过膜扩散进入透析管内,并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的。
2、微透析系统及其特点2.1、微透析系统装置主要由微量泵、微透析探头、收集器、连接管及配套设备组成。
2.1.1、微量泵以注射泵为佳,有利于减少恒流泵和蠕动泵的波动, 流速一般为1~5μl/min。
2.1.2、微透析探头有直线性探头、环形探头、同心型探头等不同的类型(微透析管因实验对象不同而形状大小各异)；按照探头的形状分为穿颅探头、U型探头、I型探头、环形探头等。
目前普遍应用的是同心型探头，微透析探头通常是由一管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成双层管道；长度一般为1～10 cm。
半透膜由再生纤维素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成, 载留分子量5～10 KD不等。
实际应用需根据具体组织和待测物选择不同的微透析探头。
微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体( in vivo)、实时( real time) 和在线(on line) 取样, 特别适用于研究生命过程的动态变化。
微透析技术的优点是活体取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等。
该技术的另一大优点是样品的采集与分析过程既可在位又可离位进行。
此外微透析技术的独到之处是可以单独取得细胞外液, 因此可对体内神经递质的释放量进行动态监测, 具有重要的生物学意义。
脑内微透析采样技术
对高K+的影响
高K+能诱导神经元产生去极化进而释放 神 经 递 质 增 加 ， 研 究 发 现 当 灌 流 液 中 K+ 浓度由30mM增加到100mM，灌流液中DA、 5-HT、Ach、NA等释放迅速增加。同时发 现氨基酸类物质释放也增加。
应用脑电刺激的影响
通过电刺激脑内神经投射通路促 进神经递质的释放。
TTX是一种神经毒素，能够阻断Na+通道， 抑制神经元的电活动，减少神经递质的 释放。根据文献报道，TTX对DA，5-HT等 这类递质的释放有较高的敏感性。而对 氨基酸如谷基酸、牛磺酸等物质的释放 无效。
对Ca2+的依赖性
Ca2+的内流与神经递质的释放有密切的关 联，降低细胞外Ca2+浓度能抑制突触神经 递 质 的 释 放 。 实 验 发 现 用 不 含 Ca2+ 的 Ringer's 液 灌 流 发 现 灌 流 液 中 递 质 如 DA 、 5-HT、Ach、NA等释放逐渐消失。
样品检测
透析样品可直接用HPLC-电化学/荧光/紫 外检测技术或其他高灵敏度微量化学分 析法测定。对于某些含量极低的物质， 可增加回收率的方法来弥补灵敏度的不 足。如可加长透析膜的有效长度、改变 灌流速度，也可使用药方法（如在灌流 液中添加摄取阻断剂）以提高待测物质 含量。
微量采样的定量方法
在微透析实验中，我们通常关心的是药 物或行为操作所引起的神经递质释放的 变化，这种变化可以用相对于基础浓度 的百分数表示。也可以通过计算透析回 收率，将透析液中物质的浓度转换成脑 内细胞外的实际浓度。
微透析与传统的灌流方法相比 具有：
由于灌流液并不直接与脑组织接触，其 对脑组织损害较小。
微透析样品通过透析膜过滤而得到，样 品避免受到大分子物质如蛋白质、酶类 等污染，透析样品可直接进样测试。
猫咪肾衰的透析治疗
小动物透析机在猫咪肾衰竭的治疗上，除了用药、输液外，对于体内排毒的需要，透析也是必不可少的，肾衰竭影响肾的滤过作用，若不能及时将营养和毒素过滤出来分别输送至体内和排出体外，将会对机体造成进一步的损害，透析分为血液透析和腹膜透析两种，在若干年前，腹膜透析一直是肾衰透析的主要方法，近年随着血液透析技术的不断完善，血液透析液逐渐被运用于医疗中。
一、血液透析血液透析（HD）是急慢性肾衰竭，少尿或无尿期肾病等最有效的肾脏替代治疗方法之一，而血液透析治疗已成为人医学领域中最成功的器官替代治疗方法，而在动物方面仍属空白。
肾脏替代治疗的目的是通过清除血循环内的尿毒症毒素以阻止它们在组织中的蓄积，血液透析将动物血液与透析液分别引入人造半透膜的两侧，作逆向流动，通过扩散、对流、吸附作用实现半透膜两侧溶质的移动，通过超滤作用实现水的清除。
血液透析步骤待动物麻醉苏醒后，测定血压，根据动物体表面积选择合适的体外循环管路及人工肾，并进行透析液A、B液浓度检查。
开机自检：打开水处理开关，进行水处理预冲。
将透析机打开，按要求进行机器自检。
血液透析管路的安装：检查血液透析器及血液管路外包装无破损后按照体外循环的血流方向依次安装，使其一端与动脉端相连，另一端与静脉端相连。
透析液管道分别与透析器的透析液室出入口相连，然后把动脉端段嵌在血泵上，将静脉捕气室固定好，血液透析器静脉端朝上。
管路预冲：启动血液透析机，用生理盐水洗净透析管路和透析器血室气体。
待生理盐水预后进行闭式循环，最后用肝素盐水预冲。
透析前测定动物基础凝血功能检查，ACT：108S，检查血液透析导管，用注射器回抽检查血流并推注首剂量肝素，5分钟后重检ACT值为262S，达到理想值后，准备连机引血。
透析完成后回血操作：插入无菌针头，调整血流量至2ml/min，关闭血泵，用血透钳夹住动脉端，并将动脉端与生理盐水相连，打开血泵，用生理盐水全程回血后夹住静脉端。
用准备好的无菌纱布、弹力绷带等对手术部位进行包扎。
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清醒动物脑部微透析操作流程
一、微透析技术基本原理
微透析技术是一种在体微量化学采样与检测技术，由西班牙之Delgado 及瑞典之Ungerstedt 等人于1972年自更早的压抽导管（push-pull
cannula）改进而来。
其基本的原理（如右图
所示）：选择具有一定截留分子量的纤维半透
膜制成的探针埋入待测的组织区域，以恒定速
度向探头内灌注与组织液成分相近的等渗灌
流液，当灌流液流经探头前端透析膜时，组织
内小分子量生物活性物质即顺浓度梯度从膜
外扩散入膜内，并随灌流液被引流至探针外，
按一定的时间间隔连续收集透析液，检测其中
待测生物活性物质水平，可监测该区域内细胞
外生物活性物质浓度的经时变化过程。
二、实验材料
1. 麻醉、定位手术：
异氟烷麻醉系统（含麻醉空气泵、麻醉机、脑立体定位/回收面罩、麻醉诱导盒、异氟烷）、废气回收系统（含活性碳过滤罐、气体回收器或气体回收泵）、颅钻（含钻头）、冷光源、显微镜、体温维持仪、脑部微透析或微注射动物手术器械包（主要含#3号手术刀柄、11#手术刀片、手术剪、精细剪、撑开器、组织镊、三角缝针、缝线、止血钳、微型凝血器、十字小螺丝刀、灭菌盒、动物剃毛器、碘伏、酒精棉球、无菌干棉球、）
2. 微透析：
微透析泵、1-5mL规格注射器、探针及配件（导管、导管帽、锁紧螺帽、探针夹持器、导管定位适配器）、低温冷冻收集器、样品收集管、连接管路、管路接头、清醒活动装置（含动物活动笼）、牙科水泥（含牙托粉和牙托水）、灌流液
3. 个人防护：
一次性乳胶手套、实验服、鞋套、口罩、帽子
三、操作步骤
1、动物准备
（1）动物麻醉与固定：①将脑立体定位/回收面罩安装于动物适配器上，面罩入口与出口分别连接麻醉系统和废气回收系统，如下图2所示；②快速诱导麻醉：手提动物尾根部，将动物放入麻醉诱导盒，打开麻醉系统（氧气流量调节：大鼠一般为500-700ml/min，小鼠一般
为300-500ml/min，异氟烷浓度调为4-5%），通入异氟烷麻醉气体，一般5min左右，动物即进入深度麻醉状态（可通过动物的呼吸、眼角反射、摇晃诱导盒综合判断动物的状态）；
（2）动物固定：将麻醉气体转换开关通向脑立体定位/回收面罩，调节异氟烷维持麻醉浓度（大鼠一般2-2.5%，小鼠一般为1-1.5%），从诱导盒取出动物，通过“固定门齿、压鼻梁、左右耳道插入耳杆”三部位固定动物头部；固定时，务必使动物头部处于水平状态（具体操作详见第（5）步）；
（3）备皮：①用剃毛器将头部手术部位及周边部位的毛发剔除干净；②依次用碘伏、酒精棉球消毒；
（4）暴露颅骨：①用手术刀片沿颅面中线切开头皮，切口长度约1cm，剔除颅骨表面的软结缔组织，再用无菌干棉球轻轻擦拭颅骨表面，即可清晰地看到前囟（Bregma）部位的十字缝线和后囟（Lambda）部位的人字缝线；
（5）定位调节：此步骤对于精确将探针定位到目标核团非常重要，可通过几个操作确定，①首先，保证动物的鼻尖与适配器的中心线在一条直线上；②夹持一根注射针，针尖刚好接触前囟点，然后以此点为标准，依次沿前囟→后囟的方向移动，在中间和后囟再取两个点，观察针尖是否也刚好接触这两个点，否则需调节适配器的高度；③左、右耳杆高度应一致、位置需对称保持平衡；④用拇指和食指轻捏动物左右额面，摇晃头部，看是否晃动，否则需调节鼻杆固定；
（6）定位钻孔：①参考脑立体定位图谱，
精确找准目标核团（比如海马）水平方向的
X、Y坐标点（AP值和ML值），此点即为导
管或探针植入的点；②钻孔：选择与导管的
杆外径尺寸近似的钻头（比如导管的杆外径
为0.6mm，则可以选择0.8mm直径的钻头）；
同时，需另外钻两个孔安置固定螺丝（同样，
需选择与螺丝直径尺寸近似的钻头，比如螺
丝直径为1mm，则钻头可以选择0.8mm），
这两个孔的位置与植入导管的孔一般成正三角形（如下图3所示），此步操作的目的是增加导管基座与颅骨的粘合力，使导管不容易脱落。
值得注意的是：钻孔时，双手垂直握住颅钻手柄或通过颅钻夹持器固定手柄，切忌用力过大，因为大小鼠颅骨均很薄，约0.5mm左右，用力过大很容易伤到脑组织，且会大量出血；缓慢用力，当孔转开时，有很强的落空感，此时应停止向下用力，可调整钻头旋转方向，对孔的边缘做适当休整。
2、植入探针
（1）植入螺丝：选择规格合适的小螺丝，用十字螺丝刀将螺丝固定于颅骨里（如图4所示）；
（2）植入导管：导管植入前，使用注射器的尖头刺破脑组织表面的硬脑膜，然后将用导管夹持器夹紧导管头部固定，按计算好的目标核团的Z坐标（DV值）垂直植入导管；
（3）牙科水泥固定：骨螺丝和导管均植入完毕后，按适当比例混合牙托粉和牙托水，将骨螺丝和导管一起粘合在颅骨表面，为了确保固定牢固，牙科水泥需添加到导管头上两个孔的高度（如下图5所示）。
等待牙科水泥凝固后，方可松开导管夹持器或退出定位器，之后缓慢插入导管帽；
（4）伤口缝合：根据伤口和牙科水泥固定的实际情况，缝合皮肤，并在伤口周围可适当涂
抹靑链霉素，防止伤口感染；
（5）动物恢复：①上述步骤完成后，解除动物头部固定，关闭麻醉系统和废气回收系统，约5分钟之内，动物即可苏醒；②将手术后的动物单独放于活动笼饲养，可每日注射1次抗菌素，等待动物恢复3-5天后，可进行清醒动物的微透析。
3、微透析
（1）微透析探针的准备：打开包装后，首先进行探针检测：①准备1mL或者2mL的注射器，装满双蒸水，固定于微透析泵；②用管路接头和管路连接探针的入口与注射器针头；③低速（1-2ul/min）向探针开始注射双蒸水约5-10min，若观察到整个探针膜表面有湿润或“流泪”现象，探针出口无双蒸水流出，这是正常现象，并非探针膜有破损；若观察到探针膜某处成“股”状流出双蒸水，说明探针膜有破损或漏洞，应更换探针；④若前一步骤检测的现象正常，停止注射，将探针浸入双蒸水约5min后，以同样速度重新开始注射几分钟，若观察到探针的出口有双蒸水流出，则证明探针良好，可以继续使用；
▲特别注意：①检测时，切忌使用生理盐水、PBS或其它缓冲液进行注射，否则易损坏探针膜；②检测时，切忌错误地将注射器连接探针的出口；③探针正式使用前，须排除气泡：在探针出口不连接任何管路或管路接头时，直接往探针的入口充气，即可排除探针膜内的气泡，否则气泡会导致回收率降低；
（2）灌流液的准备：常用非缓冲人工脑脊液（aCSF）或生理盐水作灌流液，其中CSF灌流液配方如下：
• 140 mM NaCl
• 3.0 mM KCl
• 1.2-3.4 mM CaCl2
• 1.0 mM MgCl2
• 1.2 mM Na2HPO4
• 0.27 mM NaH2PO4
• 7.2 mM glucose
• pH 7.4
▲特别注意：①切忌使用PBS缓冲液，容易形成磷酸钙盐导致探针堵塞；②灌流液在使用前，需进行脱气处理，否则容易导致探针膜内充满气泡，降低回收率。
（3）连接好微透析泵、注射器、清醒活动装置、样品低温收集器等装置；
（4）动物恢复后，将动物放于动物诱导盒，用异氟烷快速诱导麻醉后，取出导管帽，插入准备好的探针，连接好探针的出入口以及用系绳或者马甲固定好动物，即可开始进行透析；（5）灌流速度通常在0.5-5ul/min，一般选择1-2ul/min，流速过低易引起膜表面“固体”物聚集，回收率低；流速过高，膜内外没有充分的平衡时间，同样会导致回收率过低，更值得注意的是，若探针的出口连接的管路过长（大于150cm），高速灌流会导致压力过大，损坏探针膜，因此建议探针出口连接样品收集器的管路长度不超过150cm；
（6）开始灌流后，由于各连接部件存在死体积，且需要一定的平衡时间，所以通常选择在30min后的样品，具体采样时间、采集体积、间隔采样时间可根据实验需求而定。
4、管路和探针的清洁和保养
（1）探针：透析结束后，应立即取出探针，用导管帽插入导管封闭。
取出的探针置于双蒸水中，用双蒸水在1-2ul/min的速度下冲洗过夜（保持原管路的连接一起冲洗），充分排尽整个管路及探针中的盐分，然后取下探针，置于新鲜双蒸水中保持湿润状态，于4℃冰箱中保存（目的是防止探针膜收缩）。
（2）转环：在上述双蒸水过夜冲洗完成后，再用100%丙酮以1-2ul/min的速度冲洗约1个小时（切忌使用次氯酸冲洗），之后自然晾干，密封其出入口，置于低温条件保存，否则易长菌，导致后续微透析时回收率降低。
（3）管路：在第（1）步完成后，用次氯酸冲洗约0.5个小时，然后再用双蒸水冲洗约1个小时，清除残留的次氯酸，之后密封其出入口，置于低温条件保存，否则易长菌，导致后续微透析时回收率降低。
5、回收率的测定（体外）
在aCSF液中加入所要透析的目标物的标准物品（已知浓度），将探针置于此溶液中，在相同灌流速度（Ringer’s液）、相同外界温度的条件下进行透析，收集透析出来的样品，测定目标物的的浓度，从而可得此条件下该探针的相对回收率。
▲影响回收率的因素：
☐目标物的特性，如分子量大小、溶解性
☐微透析膜的特性，如材质、孔径、长度（0.5-10mm）
☐灌流速度，一般为0.5-5ul/min，一般在30-60min后开始收集
☐灌流液的化学成分、PH值等……
四、注意事项
微透析实验与许多实验不同，很多方面取决于操作者的技能水平，特别值得注意的有以下几点：
1、埋置探针的位置（AP、ML、DV值）要准确，选择合适的探针膜长，一般来说，在目标部位纵向跨度范围内，膜长选择越长，回收率越高；
2、探针操作时，需要特别细心，避免探针膜的损坏，从而延长探针的寿命和使用次数；
3、探针使用前的预处理，以及在使用间隔期间的处理、冲洗、浸泡，目的也是延长探针的寿命和使用次数；
4、连接管路时，需仔细检查，防止漏液和堵塞，同时也要防止连接管和接头的损坏。
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