(优选)间充质干细胞的临床应用心得
有关骨髓间充质干细胞的临床应用
有关骨髓间充质干细胞的临床应用崔潇 杨莹 周晓霞【摘要】 骨髓间充质干细胞具有高度的自我更新和多相分化潜能。
由于取材容易、培养简便及应用前景广泛等特点成为干细胞中研究的热点,在医学各个领域都具有研究和应用价值,目前已应用于多种临床治疗当中。
骨髓间充质干细胞(bone marr ow mesenchy mal ste m cell, MSC)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多相分化潜能的成体干细胞,又称骨髓基质干细胞、间充质祖细胞。
1 MSC的生物学特性M SC具有高度自我更新能力和多相分化潜能,体外培养的M S C有快速黏附和克隆能力,可以在体外培养20～25代而没有形态、生长曲线和免疫表型的明显改变,且保持着细胞的染色体核型和端粒活性。
MSC在体外诱导培养条件下,能够向不同谱系的细胞分化,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、星形胶质细胞等[1]。
2 MSC的免疫学特性由于MSC不表达主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ分子、CD40、CD80、C D86等共刺激分子,不表达或极低水平表达MHCⅠ分子, MSC不易被宿主T细胞识别,并能逃脱宿主免疫系统的排斥,因此认为MSC具有低免疫原性[2]。
3 MSC在临床医学中的应用311 MSCs用于心血管疾病的治疗机制 当M SCs移植到损伤的心肌局部后,M S Cs能分化为心肌细胞系,表达心肌特异性蛋白质,包括:α2actinin,tr oponin2T,tr opomyosin,myosin heav2 y chain2MHC,phos phola mban,和其他的心肌特异性蛋白质[3]。
更重要的是,在MSCs移植后的心肌组织中检测到了connex2 in243,该种蛋白质反映的是细胞之间的连接以及细胞与细胞之间的电偶联[4]。
31111 M SCs促进缺血或梗死部位血管再生 由于新生血管的生成,增加了梗死部位心肌的血供,通过挽救冬眠的心肌、减少肥大的心肌细胞的凋亡、帮助恢复损伤的基质来减少心室的扩张和改善心功能[5]。
骨髓间充质干细胞总结
2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。
一、骨髓间充质干细胞的分离目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
1. 直接培养法（全骨髓培养法）1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增2 0-30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。
culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7 -10天传第一代，以后2-3天传代。
培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1:1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。
布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟，换液去除悬浮细胞（2）原代培养24h,48h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。
【干货】间充质干细胞功能及应用
负面消息（包括无效）的特点
1，活性差、功能低的间充质干细胞（自体骨髓间充质干细胞） 2，脐血单个核细胞（mononuclear cell，不是monocytes）冒充间充质干细胞 （部分医院和企业） 3，干细胞制剂里添加各种药物（激素） 4，治疗方案没有经过优化 5，各种忽悠的干细胞类型，比如：外周血干细胞（外周血含有少量的间充质 干细胞，但目前无法扩增到临床所需的细胞数）、母乳干细胞（退一步说，即 使母乳里含有干细胞，但经过胃酸和肠道消化，早就死翘翘了）、植物干细胞、 心脏干细胞（专业上有心肌干细胞）等
Biology of Blood and Marrow Transplantation 13:1477-1486, 2007
评价MSC的质量
克隆形成能力 细胞大小 免疫调节能力
分泌细胞因子的量
HGF、TGF-β1、PGE2、IDO
VEGF165、
抗凋亡
FGF-2、HGF 因子
免疫调 节因子
趋化因 RANTES、SDF-1α、
endogenous: Hsp, DNA, RNA, TNF,CD40L exogenous: unmethylated CpG sequences in microbial
?? Safe signals
意义：能够解释更多免疫学现象，成功地解释了坏死细胞为何能诱导免疫应答反应。
chronic phase acute phase
J Tissue Eng Regen Med 2011;5(2):146-150.
风险控制
基因组 • 体外扩增导致 稳定性 的基因突变
稳定性评价
微生物
• 病毒 • 细菌 • 支原体
辅料素
• 内毒素 • 胎牛血清残留
临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
临床研究用人间充质干细胞质量检验规范-讨论版
临床研究用人间充质干细胞质量评价规范（讨论稿）前言人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。
除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。
hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。
过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。
目前在登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮，等等。
然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。
其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和技术的合理性等问题，因此导致不同研究者间的研究结果很难具有可比性，或结果难以重复，因此也很难形成相对统一的质量标准。
而临床研究中所存在的问题是，绝大多数临床研究还处在早期阶段，所观察的病例数还很有限，临床研究中细胞质量的标准化和细胞使用的规范性仍存在巨大差异，所有这些尚不足以完全支持hMSCs的安全性和/或疗效。
除此以外，因hMSCs临床前研究还远不够完善，对其临床研究的指导作用还不强，或者临床前研究与临床研究存在严重脱节现象，临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立，等等。
间充质干细胞输注期的观察和护理
间充质干细胞输注期的观察和护理目的经验总结间充质干细胞输注期的观察和护理要点，更好地指导临床护理工作。
方法从输注环境的准备、成体干细胞的准备、输注器具的选择、静脉通路的选择、输注速度的要求、输注期的观察重点和对应的护理对策六个方面进行总结。
结果23例患者顺利输注，相关并发症能及时发现，得到相应的治疗和护理。
结论对间充质干细胞进行相应的环境准备和物品准备，合理调节输注速度，做好常见并发症的观察和护理，是保证配合医疗新技术、提高护理质量的关键。
标签：间充质干细胞；输注期；观察；护理近年来，随着细胞生物实验技术的快速发展，干细胞的研究和应用成为生命科学的研究热点。
对于干细胞的临床优势，国内外学者普遍达成共识：干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体[1，2]，同时还具有支持造血及免疫调节等功能[3]，被医学界称为”万用细胞”。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）根据取材来源不同可以分为两种：脐血间充质干细胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）和脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal-derived stem cells，UCMSCs），MSCs移植是近几年新兴的治疗多系统疾病的方法。
1临床资料23例患者中男1例，女22例，年龄13～59岁，中位年龄37.1岁，其中系统性红斑狼疮19例，类风湿关节炎1例，硬皮病1例，重型再生障碍性贫血1例，骨髓增生异常综合征1例）。
脐带间充质干细胞的来源由江苏省干细胞库提供，细胞数6×107，细胞活率>85%。
2护理2.1护理人员的准备参与输注间充质干细胞的护理人员，在操作前均应接受相关知识培训，包括间充质干细胞的特性、适应人群、保存与输注的要求、输注中和输注后的观察、并发症的处理等。
2.2环境的准备对环境无特殊要求，在输注当日按无菌原则的要求，病室内减少人员走动，床头柜洁净无物，便于操作。
间充质干细胞的临床应用心得共47页
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
间充质干细胞的临床应用心得
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权பைடு நூலகம்会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
干细胞与组织工程间充质干细胞及其应用
通过间充质干细胞的软骨分化能力，构建软骨组织工程产 品，用于关节软骨损伤、退行性关节病等治疗。
心肌组织再生
利用间充质干细胞的心肌分化潜能，结合生物材料支架和 生长因子等，构建心肌组织工程产品，用于心肌梗死、心 力衰竭等治疗。
挑战与前景展望
挑战
目前间充质干细胞在再生医学领域的应用仍面临许多挑战，如细胞来源、安全性、有效性等问题。
干细胞与组织工程间充质干细胞的精准医疗应用
随着精准医疗理念的深入人心和基因编辑技术的发展，未来有望实现间充质干细胞的精 准医疗应用，为个体化治疗提供新的解决方案。
干细胞与组织工程间充质干细胞的跨领域合作与创新
未来，随着多学科交叉融合的不断深入，有望实现间充质干细胞在再生医学、组织工程 、生物材料等多个领域的跨领域合作与创新，推动相关产业的协同发展。
原理概述
组织工程是应用生命科学和工程学原 理，通过构建生物功能替代物来修复 、维持或改善人体组织功能的一门新 兴交叉学科。
技术手段
主要包括细胞培养、生物材料支架制 备、细胞-材料复合物构建、移植及体 内外评价等步骤。
在再生医学领域应用实例
骨组织再生
利用间充质干细胞的成骨分化能力，结合生物材料支架， 构建骨组织工程产品，用于治疗骨缺损、骨折不愈合等。
03
间充质干细胞鉴定与功能分 析
鉴定方法
形态学鉴定
通过显微镜观察细胞形态，间充质干细胞呈长梭形或纺锤形，具 有贴壁生长的特性。
表面标志物鉴定
采用流式细胞术等方法检测细胞表面标志物，如CD73、CD90、 CD105等，以确认间充质干细胞的身份。
多向分化能力鉴定
在特定条件下诱导间充质干细胞向成骨、成脂、成软骨等方向分化 ，以验证其多向分化潜能。
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P=0.029
无区别
P5代后降低
P10代后降低
张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006
➢ 表面标记测定
表 达 CD29、CD44 和 CD105
不 表 达 CD14、CD34、 CD45 、HLA-DR 正常组与狼疮组表型表达 并无差异（P<0.05)
张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006
#
#
*
*
#
10
5
0 IL-4 IL-6 IL-10 IFN-γ TNF-α IL-12
Intercellular cytokines
*为有统计学意义 Sun LY, et al.Scand J Rheumatol,2006
➢ 转录因子T-bet 和 GATA-3
T-bet β-actin
ABC A BC
➢ 形态观察
正常人与SLE患者 BMSCs形态大小上无差 异，均以长梭形为主
SLE骨髓（P0）MSCs第25d 倒置显微镜观察 ×100
孙凌云等，中华风湿病学杂志，2005
➢ SLE与正常对照组BMSCs培养比较
原代培养时间 形态学 扩增效率
SLE 组 26±7.76 d
正常对照组 17 ±5.46 d
➢ 正常人与SLE患者BMSCs细胞因子表达比较
Beta-actin
对照
IL-7
❖ SLE中IL-6、 IL-7 表达降低（P<0.05）
❖ 而IL-11,M-CSF表 达无区别
SLE
张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006
➢ SLE患者BMSCs染色体组型
——为正常的染色体组型
张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006
单独T细胞 T ＋狼疮BMSCs T ＋正常BMSCs
Sun LY, et al.Scand J Rheumatol,2006
❖ 对T细胞亚群的影响
➢ T细胞内细胞因子测定
1.正常鼠BMSCs对狼疮T细胞IFN-γ、 IL-4生成的影响
IFN-γ生成T细胞被刺激增多 IL-4生成T细胞被抑制减少 正常BMSCs可促进TH1而抑制TH2细胞生成—影响SLE病情
共孵育： ↑IL-6*, IL-4, IL-10 ↓ TNF-α*
向TH2偏移
% CD3+ Tcells
R2
R1
0
200 400 600 800 1000
100
101
102
103
104
FSC-Height
FL 1-H
30 25
#
20 15
#
*
T cells
T cells/Bc MSCs
T cells/NW MSCs
对TH1/TH2平衡影响
正常MSCs：使TH1/TH2平衡向TH1偏移 狼疮鼠病情缓解？
狼疮MSCs：使TH1/TH2平衡向TH2偏移 狼疮鼠病情恶化？
狼疮鼠BMSCs对T细胞免疫调节功能存在缺陷
MSCs与B细胞
❖ 人BMSCs可抑制B细胞增殖
❖ 增殖抑制与B细胞的凋亡无关， 而与细胞周期滞留于G0/G1有 关
❖鼠 ➢ 形态学
BALB/c
NZBWF1/J （P0）×100
形态上无显著差异
但狼疮MSCs增殖速度更快、传代时间更短 不同于人？
Sun LY, et al.Scand J Rheumatol,2006
MSCs与免疫细胞
MSCs与T细胞
❖ 不活化异基因T细胞
❖ 抑制T细胞增殖 ➢ 包括初始和记忆性T细胞的增殖 ➢ 包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激
❖ 对T细胞凋亡影响 ➢ 一：不诱导静止期T细胞凋亡（Tse WT et al.
Transplantation，2003，75：389-397.）
➢ 二：诱导活化的T细胞凋亡（Plumas J et al.Leukemia
2005; 19:1597-604. ）
➢ 三：使活化的T细胞凋亡降低
与正常（BALB/c）及 狼疮鼠（NZBWF1/J） BMSCs共培养均导致活 化的T细胞凋亡下降 （P<0.05)
A. T ＋狼疮 MSCs B. 单独 T C. T＋正常 MSCs
GATA-3 β-actin
与正常鼠BMSCs共培养：T-bet↑，GATA-3↓ 与狼疮鼠BMSCs共培养：T-bet↓，GATA-3↑
TH1↑ TH2↑
Sun LY, et al.Scand J Rheumatol,2006
Deng W, et al. DNA and Cell Biology. 2005;24:458-463
2.BMSCs与正常T细胞共孵育前后细胞内细胞因子的变化
❖ 与正常鼠BMSCs(BALB/c)共 孵育： ↑IFN-γ*, IL-12* IL-4*, IL-10 , IL-6，TNF-α*
向TH1偏移 ❖ 与狼疮鼠BMSCs(NZBWF1/J)
BONE （优选）间充质干细
MARROW
MSCs 胞的临床应用心得
间充质干细胞
（Mesenchymal Stem Cells，MSCs)
生物学特性
来源广泛
❖ 可来源于骨髓、胰腺、皮肤、肺 脏等多处器官组织
adipocyte osteocyte chondrocyte myoblast
自我更新、多向分化潜能 易扩增传代能力
产生多种细胞因子
❖ 分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、干细胞生长因子（SCF）、 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、转化生长因子 -β（TGF-β）等
无MHC限制
❖ 不管MSCs或T细胞来源种类，MSCs均能对T细胞增殖产生免 疫抑制作用
免疫调节作用
狼疮骨髓MSCs（BMSCs） ❖人
➢ 正常人与SLE患者BMSCs生长曲线比较
12000
10000
8000
SLE
6000 4000Leabharlann Normal20000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 天d数
生长曲线呈S形 SLE患者BMSCs总体生长较
正常人缓慢
Cell p 细op 胞ul数ation
张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006
❖ 体外能够传40代，并保持稳定的 表型和多向分化的潜能
cardiocyte Nerve cell hepatocyte
MSCs
IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, SCF, SDF-1 GM-CSF, M-CSF..
表达多种细胞表面分子
❖ CD105、CD73、CD44、CD71、CD90、CD166、基质细胞抗原 （STRO-1 ）等