细胞培养技术基础

贴壁细胞的传代
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从细胞培养瓶中小心吸走培养基 缓慢加入37度温浴的PBS或不含血清的培养基，让培养基沿容器壁流 下，小心不要直接滴在细胞上，以免冲掉附着不牢的细胞 小心移去PBS或培养基 加入含0.25%胰蛋白酶的PBS，加入量以刚没过细胞为宜 停留30秒左右，立刻吸去胰蛋白酶 室温放臵5-15min，每隔几分钟用肉眼观察当容器晃动时细胞是否脱 落，如果是，下一步。如果没有，可以在37度保温5min 加入含血清的新鲜培养基，吹打细胞使细胞分散，在显微镜下确认 获得的是游离的单个细胞 吸取少量细胞悬液到EP管 细胞计数，确定需要的稀释倍数 吸出适量的悬液到新的培养皿或培养瓶中，加入适量的新鲜培养液 轻轻晃动培养瓶，使细胞均匀分散在培养皿表面 将细胞放回培养箱，适度拧松盖子

连续传代细胞株/系：
◦ 通过对高生长率的细胞筛选，自然或人工转化的方式可以得到性状稳定，能无 限传代的细胞；相当部分来源于肿瘤细胞，也可以通过人工转化； ◦ 形态学，细胞功能，生长特性发生改变；由于基因型的改变，有时不能很好地 模拟in vivo的情况； ◦ 实验中使用相对原代或有限传代细胞更容易获得及培养；

pH值
◦ 培养基的pH值介于7.2-7.4 ◦ 一般都会以NaHCO3缓冲
◦ 当培养基中的营养消耗时，培养基中的酚红（指示剂）会变黄。细 菌污染或者培养箱中CO2浓度过高也会引起变黄，注意区分
◦ 不同的培养基配制时需要添加不同浓度的NaHCO3
细胞培养基 （续）

市售基础培养基
◦ 干粉：需要自行加去离子水按比例配制，价格最低；需要用0.22微米滤器正 压过滤。（负压产生的泡沫会破坏其中的蛋白成分） ◦ 浓缩液：用灭菌去离子水按比例稀释 ◦ 液体：直接可以使用，方便，进口的液体培养基价格最昂贵。
对一个细胞系的特性了解的越多，越容易解 释和解决培养中可能出现的问题。
例：细胞株的说明书
来源：
例：细胞株说明书-ATCC
来源：/
例：细胞株说明书（续1）
例：细胞株说明书（续2）
细胞的日常维护

◦ 冻存细胞以防备因为意外而损失重要细胞系 ◦ 即使是无限传代的细胞系，经过长期传代和培养都可能发 生表型漂变

准备细胞冻存所需的试剂和设备耗材：
◦ 参考ATCC、细胞库提供的冷冻特定细胞株的冷冻配方 ◦ 一般冻存液为10%DMSO+90%FCS ◦ 专用的细胞冻存管，一般都带有螺纹盖，可以耐受低温。 不能使用EP管 ◦ 在液氮罐里找好存放细胞的位臵
血清：
◦ 血清是非常昂贵的试剂，常常分装后冻存，在使用前再加入培养基中 ◦ 不同细胞需要的血清种类和浓度不同，请事先确认 ◦ 通过血清可能传播某些感染因子或颗粒，因此只购买能够确定血清来源的 血清。例如，禁止从出现疯牛病的国家进口牛血清 ◦ 市面上有假冒血清，不要为省钱去购买来源不明的血清 ◦ 同一品牌不同批次的血清仍可能存在差异，尽量购买使用后效果好的批次


理想的情况下，每个小室大约有200 -500个细 胞
细胞悬液的浓度：每个1x1x0.1 mm 面积内的 细胞数量 = 细胞数 x 1*10^-4 cm3，即为 (1*10-4 ml). 再乘上稀释倍数 避免同一个细胞数两次，只数两条边

细胞冻存

细胞可以在-135~175度的液氮中保存保存上几年时间， 或者在-80度冰箱中保存几个月而仍能复苏生长
细胞冻存流程
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选择生长状态良好的对数生长期细胞 进行活细胞计数，不要冻存死细胞比例达到20%的细胞 根据冻存细胞量准备冻存管，每个管一般装1ml液体，细胞量 在5X106左右 准备好冻存液，一般冻存液包含10%DMSO+90%FCS，也可以 是10%DMSO+20%FBS+基础培养基 用冻存液重悬细胞，轻柔的吹散细胞 每个冻存管装入1ml悬液，并放在冰上30min 将冻存管放入-80度冰箱24小时过夜 转移到液氮罐或超低温冰箱长期保持
◦ 操作前后用70%酒精擦拭 ◦ 当使用结束后关好玻璃柜门

独立的层流细胞培养间：
◦ 实验室中划出的独立区域 ◦ 所有气体经过HEPA滤网过滤
清洁的塑料或玻璃器皿
细胞培养用移液管、试剂瓶、培养皿、多孔板等等
一次性的塑料制品：
◦ 经处理的表面，细胞更容易贴附生长，特别是单层细胞培养 ◦ 比可重复使用的玻璃制品贵 ◦ 适合4度冰箱低温保存

为了维护细胞，必须： 给养：细胞生长过程中汇消耗培养基中的某些必需因子，必须 及时更换培养基 传代：随着细胞的生长，细胞数量会不断增长，多数细胞每24 小时增殖一倍，很快培养皿里就满了 冻存：无论什么时候你获得或构建了一个细胞株，都必须分装 冻存。避免细胞受到污染后发生表型漂变
永远不要在没有进行显微镜观察的情况下就进行细胞传代、实验或 者冻存细胞。

培养基储存
◦ ◦ ◦ ◦ 存放4度冰箱 暗处避光保存，某些成分对光和热敏感 禁止高温灭菌 血清可以在使用时再按比例添加
细胞的获得

请同一实验室的同事同学给送给你
◦ 观看赠送者的培养操作步骤，尽量记下操作细节

Байду номын сангаас
特殊细胞系需要请某些实验室赠送
◦ 找出使用该种细胞的文献和报告，写信请求
◦ 向周围的人询问

有限传代细胞:
◦ 正常的细胞只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖的能力。这种细胞就被称 为有限传代细胞系； ◦ 形态与生理特性仍与来源处细胞比较接近； ◦ 增殖快的细胞会占据优势，最终导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度 一致；
◦ 有限传代细胞系可以转化成持续传代细胞系（如：引入病毒的SV40）
耗材：
◦ ◦ ◦ ◦ ◦ 细胞培养基：根据所培养的细胞选择配制 培养容器：培养皿，培养瓶，多孔细胞培养板，滚板等等 无菌的一次性吸管、移液头、离心管等等 70%医用酒精、酒精棉球 其他：废液罐、pH计等等
无菌操作基础

实验往往要求一段时间的连续培养，因此，保护细胞免受细菌、真菌 和病毒等微生物的污染对成功的细胞培养至关重要。
悬浮细胞的传代
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从培养箱中取出培养瓶，轻轻摇匀培养瓶中的细胞培养物，吸出大 约1ml到EP管中 对细胞进行计数，同时观察细胞状态 计算所需要的稀释倍数，决定需要的种子液的量 吸出适量的细胞到新的培养瓶 加入适量37度预热的新鲜培养基 将培养瓶放回培养箱中，并把盖子松开，以便进行充分的气体交换 继续培养原瓶细胞，不加入新的培养基，以防传代后细胞污染，在 培养瓶上标明“备份”，并在下一次传代后丢弃

无菌技术主要包括以下几个方面：


清洁的细胞房工作环境
使用无菌或灭菌的玻璃及塑料器皿

良好的个人卫生习惯和操作技巧
保持培养基、试剂不受污染

清洁的细胞培养工作区

细胞培养通风橱/生物安全柜：
◦ 相对封闭的操作环境 ◦ 工作区能保持清洁，容易维护 ◦ 需要定期更换HEPA滤网 ◦ 需要供电
◦ 操作前后用紫外灯照射

生物安全性等级与操作要求
*所操作的微生物危险等级参考《人间传染的病原微生物名录》（卫 生部，2006），并向实验室管理人员咨询相应的操作区域与设备
细胞培养设备

细胞培养的基本设备：
◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ 细胞培养通风橱（层流通风橱或生物安全柜） CO2培养箱 （5%CO2，37度恒温） 恒温水浴锅 移液器 离心机 冰箱和冰柜：用于储存培养试剂 倒臵显微镜：观察和记录
细胞培养基本概念

贴壁细胞：
◦ 这类细胞在培养皿表面黏附，形成单层细胞 ◦ 大多数组织来源的细胞都需要贴壁才能生长，包括成纤维细胞核上皮细 胞。 ◦ 容易进行显微观察、杂交和其他试验

悬浮细胞：
◦ 在培养基中悬浮生长。起源于血液，脾脏或骨髓的细胞，特别是未成熟 的细胞趋向悬浮生长。 ◦ 悬浮培养的好处是容易得到大量悬浮细胞，收集容易。
玻璃制品：
◦ 能耐受0度以下低温 ◦ 可以反复灭菌使用
良好的个人卫生习惯和操作技巧

穿好实验服、戴好乳胶手套，换专用拖鞋。 用70%酒精擦拭工作区 只有在操作时才打开灭菌的培养皿，培养板的包装，实验结束 后未使用的器材要尽快包好 实验所用的移液管，移液器枪头只有在工作台内打开包装并且 保持干净 细胞培养用的培养基或试剂均需要预先过滤或高温灭菌 保持试剂瓶与桌面成45度角的时候打开瓶盖，打开后不要将瓶 盖开口朝上放臵。使用完要立刻盖上盖子 每瓶溶液用单独的移液管，避免移液管或枪头碰触任何的非灭 菌物品，移液管不要留在瓶内 工作区内尽量减少手臂运动，提前准备好可能用到的东西。 酒精灯附近会形成向上的气流，操作可以在酒精灯附近完成。
细胞培养基

完全培养基的成分
◦ 细胞生长所需必需氨基酸、维生素、有机盐、葡萄糖 和一定比例 的血清（血清中含有生长因子，激素及细胞因子），酚红及抗生素
◦ 血清和基础培养基（MEM、DMEM、RMPI1640等等）分开购买 ◦ 细胞培养时常添加10%小牛血清，胎牛血清，也有部分细胞需要马 血清，羊血清。
细胞复苏流程
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将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37度水浴锅中快 速解冻（1min内） 捏住冻存管的盖子部分，轻轻而快速的转动冻存管，小心 不要让水没过盖子或渗入冻存管内 全部解冻后，在生物安全柜中将内容物转移到15ml离心管 中 添加10ml预热的完全培养基，在200 X 的离心力下将细胞 悬液离心5-10分钟。实际的离心速度和时间取决于细胞的 种类 小心的移去培养基，用预热的培养基重悬细胞。 以适当的密度转移到培养瓶或者培养皿中，放回细胞培养 箱 大约1hr后可以观察细胞的生长情况