实验五：细胞融合与凝集
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导编者梁亦龙张继承生物信息学院2004年9月前言细胞是一切生物(包括人类)最基本的结构和功能单位。
生命科学中的各个学科领域，甚至非生命科学的许多学科领域中的学者们，越来越多地投入到对细胞生命现象的研究。
细胞是生命的载体，不理解细胞就不理解生命。
在现代生命科学教学中，不设置细胞生物学课，所培养出来的学生就称不上是完全的生命科学家。
在细胞生物学放学中，实验课不可或缺。
实验课的基本任务是，让学生学习细胞生物学基本技术，使他们具有一定的实验操作技能，并培养他们树立独立设计实验的思考观念和进行科研的基本素质。
我们借鉴兄弟院校的经验编写了这本《细胞生物学实验指导》•，供我院开设的各专业选用。
由于我们主客观条件所限，而且编写时间仓促，肯定会有不少缺点和错误，请提出批评意见，帮助我们不断改进教学。
编者梁亦龙2004年9月目录实验是规则与操作要求 (1)实验一细胞形态及大小的观测 (2)实验二相差和暗视野显微镜的原理、使用及标本观察 (5)实验三荧光显微镜原理及应用 (9)实验四电镜参观 (12)实验五植物细胞骨架的显示及光镜观察 (14)实验六人淋巴细胞染色体标本制作 (15)实验七人淋巴细胞姐妹染色体区分染色 (17)实验八碱性磷酸酶的显示 (19)实验九叶绿体的制备及其对染料的还原 (22)实验十人体细胞核型图的制作 (24)实验十一线粒体的分离及活性测定 (27)实验十二联会复合体的染色与观察 (32)实验十三细胞融合 (33)实验十四死、活细胞鉴别 (39)实验十五细胞固定染色法 (41)实验十六早熟染色体凝集（PCC） (43)实验十七细胞同步化 (46)实验十八动物染色体分带技术 (48)实验十九线粒体的显示 (50)实验二十植物愈伤组织培养以及再分化 (52)实验二十一肿瘤细胞培养实验步骤 (57)实验二十二细胞器的分离 (62)实验二十三石蜡切片的制作 (66)实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。
第5章细胞融合介绍
三 基本原理 对于植物细胞而言， 1、一般先将两种不同植物的体细胞(来自其叶或 根)经过纤维素酶、果胶酶消化，除去其细胞壁， 得到原生质体； ２、 而后通过物理或化学方法诱导其细胞融合形成杂 种细胞； ３、 继而再以适当的技术进行杂种细胞的分检和培养， 促使 杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直 至形成杂种植株，从而实现基因在远缘物种间的 转移。 ４、由 于这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和 细胞质，在适宜的条件下来培养，长成的生物个 体就是一个新的物种或品系。
3.体细胞融合还有一个重要的价值，就是创造 细胞质杂种。在体细胞杂交中双亲的细胞质 都有一定的贡献。据试验，融合后的杂种细 胞质最终会选择某一亲本的叶绿体，但线粒 体可以实现双亲重组。因此，有可能通过细 胞融合获得细胞核、叶绿体、线粒体基因组 的不同组合，这在育种上无疑有着重大价值。 4.体细胞杂交在作物育种和种质创新上有其独 到的意义和作用。随着新的融合技术(如电融 合技术)进一步完善和发展，体细胞杂交对作 物改良必将发挥出更大的作用。
2. 基本过程 以植物原生质体为例，PEG法诱导原生质 体融合的过程见图5-4所示。 融合中应注意： (1)事先要做好两种原生质体的识别标记，如 色素、缺陷型、抗性标记等。 (2)原生质体的密度应在105个／ml左右，两种 原生质体按1:1等量混合。
(3)常用PEG的分子量通常为4000~6000，加热熔 化与Eagle溶液配成50％(W／V)浓度(小分子质 量的PEG配成55％浓度)。加入PEG后，24 ℃ 培育10-20min(注意时间宜短不宜长，过长，使 原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，会降低 融合率)，缓缓加入高pH、高钙离子溶液， 15min后用冲洗液清洗，离心收集原生质体。 (4)计算：融合率=(融合细胞的细胞核总数／视野 内全部细胞的细胞核总数)×100％
细胞生物学实验
二、实验原理
植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁而使原生质体释放出来。
原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。
选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。
将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。
二、实验原理
凝集素是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。
01
凝集素与糖分子结合有一定的专一性和结合价，并与细胞膜上受体的分布有关。
01
三、实验仪器
显微镜、粗天平、载玻片、滴 管、 离心管、离心机等.
用镊子撕去叶的下表皮，然后将叶放有酶液的培养皿或带盖三角瓶，每10ml酶液放2g叶片；
洋葱、小麦种子或黄豆幼根根尖
人口腔上皮细胞
五、实验内容与实施过程
1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察
1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上 ↓ 滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液 ↓ 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞 ↓ 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 ↓ 染色10-l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) ↓ 盖上盖玻片,显微镜下观察
细胞融合实验报告
细胞融合实验报告
本实验旨在探究细胞融合对细胞生长和功能的影响，为了达到这一目的，我们进行了一系列的实验操作和数据分析。
在实验中，我们选取了两种不同类型的细胞进行融合，并观察了融合细胞的形态特征、生长情况以及功能表现。
首先，我们以显微镜观察了融合细胞的形态特征。
结果显示，融合细胞的形态呈现出明显的异质性，既有细胞A的特征，也有细胞B的特征，这表明细胞融合后细胞的形态会发生明显的改变，产生新的细胞类型。
其次，我们进行了细胞生长曲线的测定。
通过对融合细胞和单一细胞的生长情况进行比较，我们发现融合细胞的生长速度明显快于单一细胞，这说明细胞融合可以促进细胞的生长和增殖。
随后，我们对融合细胞的功能进行了评估。
实验结果显示，融合细胞在某些功能上表现出了明显的增强，例如对外界刺激的响应能力和分泌功能。
这表明细胞融合可以提高细胞的功能表现，使其具有更强的适应能力和生存竞争力。
最后，我们对融合细胞进行了基因表达谱的分析。
结果显示，融合细胞的基因表达谱发生了明显的改变，一些基因的表达水平显著上调或下调，这说明细胞融合会引起基因表达的重新编程，从而影响细胞的功能和特性。
综上所述，本实验结果表明，细胞融合对细胞的形态、生长和功能都产生了明显的影响，这为我们进一步探究细胞融合的机制和应用提供了重要的实验依据。
希望通过我们的努力，能够为细胞融合领域的研究和应用做出更多的贡献。
细胞实验预习报告
实验一细胞凝集反应实验目的：1.了解细胞膜表面结构。
2.掌握凝集素促使细胞凝集的原理。
3.学习研究细胞凝集反应的方法。
实验原理：凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质，被认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。
凝集素使细胞凝集是因为它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞发生凝集。
大多数凝集素存在于储藏器官中，作为一种氮源；对某些植物而言，受到危害时，凝集素作为一种防御蛋白发挥作用。
凝集素与糖结合的活性及专一性决定其功能。
实验材料及试剂：1.马铃薯块茎2.显微镜、粗天平、载玻片、滴管2支、离心管2支3.PBS缓冲液4.2%的红细胞液实验步骤：1.制备鸡血悬液：取1ml鸡血于离心管中，加食盐水至5ml，用滴管吹打均匀，平衡后放入离心机中，2000r/min来离心5min。
离心完毕后，将上清液倾倒再加食盐水至5ml，2000r/min，离心5分钟。
连续重复5次，最后得到的鸡血细胞再加入食盐水至5ml，即为2%的红细胞悬液。
2.取两个玻片，分别向两玻片上滴加一滴鸡血。
向其中一个鸡血玻片上再滴加一滴土豆凝集素，另一玻片不加，作为对照。
然后同时向两玻片滴加一滴PBS缓冲液，静置5min，观察血细胞的凝集反应。
注意事项：1.注意控制加入双凹片孔中的液体的量，以免双凹片的2个孔中液体混合。
2.样品加到孔中后，摇一下双凹片，并进行计时。
实验二叶绿体的分离与荧光现象实验目的:1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实验原理：将组织匀浆悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞的常用方法。
由于沉降系数和所受到的离心力的不同以及自身性质的不同，可用不同的转速来分离出不同的细胞器。
荧光显微技术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。
某些物质在一定短波长的光的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时就能在极端的时间内射出比照射光波长更长的光，这种光称为荧光。
细胞生物学实验教学大纲
细胞生物学实验教学大纲一、课程的性质、地位和任务细胞生物学是生命科学四大基础学科之一，它从细胞水平、亚细胞水平和分子水平三个不同层次上研究细胞的结构功能和生命活动的基本规律，位于分子生物学与个体生物学之间，同他们互相衔接，互相渗透。
因此，细胞生物学又是一门承上启下的学科。
细胞生物学实验课程教学以理论课教学为基础，理论与实践相结合，加深对所学知识的理解，对实验仪器要求较高，因此开设本课程的目的是使学生掌握细胞生物学实验设备的操作方法，使学生更加牢固地掌握基础知识，更重要的是培养学生的动手能力和科学研究能力，为学生学习生命科学中的其他相关课程作好基础准备。
同时也使学生具备观察和研究细胞结构与功能的基本方法，学会发现问题和解决问题的基本技能，为毕业后从事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。
该课程是生命科学相关专业学生的必修课程，也可作为非生命科学专业扩大知识视野的选修课程。
二、教学要求通过实验教学，使学生初步掌握制备植物细胞减数分裂玻片标本的技术和方法，了解石蜡切片的制作过程；初步掌握荧光染色的方法和原理，并熟悉荧光显微镜的使用；掌握细胞电融合方法和化学介导剂诱导细胞融合的原理和方法；了解细胞器的超活染色技术和组织化学技术；了解细胞器分离的一般原理和方法；掌握并熟练地使用各类常用的光学显微镜。
实验教学过程中，要求学生预习实验内容，掌握实验目的及设计思路，了解实验步骤；教师应该认真讲解，细心指导和演示；学生要认真观察实验现象，实事求是地记录实验数据和结果，经过积极的思考后，书写实验报告，报告内容简明扼要，结果翔实，并且分析实验中的一些现象；实验过程中要遵守实验规章制度，爱护实验财产和仪器设备，保持实验室卫生；教师应负责巡视检查实验课的各个环节，认真评阅实验报告，进行实验教学总结。
三、实验考核方式及办法学生对实验课的态度、操作技能和实验报告制作的平时考核及相应期末笔试相结合的综合评分，并以百分制计分。
四、实验学时安排: 24学时五、实验项目一览表实验项目一览表序号实验项目名称实验类型实验要求适用专业课时1 植物细胞的活体染色及观察验证选做理学、农学 42 细胞膜的渗透性验证必做理学、农学 43 叶绿体的分离与荧光观察综合必做理学、农学 44 植物细胞骨架的光学显微镜观察验证必做理学、农学 45 细胞融合综合必做理学、农学 46 DNA的Feulgen染色法和PAS反应法显示多糖综合必做理学、农学 47 膜蛋白质的分离创新选做理学、农学 48 减数分裂中的染色体行为比较设计选作理学、农学 49 电子显微镜技术综合选做理学、农学 410 显微摄影与暗室技术设计必作理学、农学8六、实验项目的具体内容：实验一植物细胞的活体染色及观察1.实验目的和要求1.1掌握植物细胞活体染色的原理和方法。
鸡血细胞的体外融合
四、实验方法与步骤
2. 鸡离心管中， 吸取 鸡血细胞悬液放入离心管中 4mlHanks液混匀，1000rpm离心 液混匀， 离心5min。弃去上清液， 液混匀 离心 。弃去上清液， 用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。 用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。
1. 高Ca2+浓度能够提高细胞融合率。有些抗凝剂中含有 浓度能够提高细胞融合率。 结合的化合物，与血液中的Ca 和Ca2+结合的化合物，与血液中的 2+形成难解离的 可溶性络合物，导致血液中的Ca 浓度降低， 可溶性络合物，导致血液中的 2+ 浓度降低，故起抗 凝血作用，但同时会造成细胞的融合率较低。 凝血作用，但同时会造成细胞的融合率较低。 2. 必须严格控制 必须严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞 ～ 的作用时间， 的作用时间 通常处理细胞1～ 2min。PEG和二甲基亚砜（DMSO）并用，可以提高 和二甲基亚砜（ 。 和二甲基亚砜 ）并用， 细胞的融合率。 细胞的融合率。 3. 融合细胞继续培养就变成一个杂种细胞，它的染色体 融合细胞继续培养就变成一个杂种细胞， 数不是两核的倍数，因为一些染色体会逐渐消失。 数不是两核的倍数，因为一些染色体会逐渐消失。
1. 鸡血细胞悬液的制备
从家鸡的翼根静脉采血制备抗凝全血。 加入4倍体 从家鸡的翼根静脉采血制备抗凝全血。 加入 倍体 积的0.85 %NaCl溶液，制成红细胞储备液，保存于 溶液， 积的 溶液 制成红细胞储备液， 4℃。取鸡血细胞储备液 ℃ 取鸡血细胞储备液1ml，加入 ，加入4ml 0.85 %NaCl 溶液，混匀后， 离心5min，弃去上清液， 溶液，混匀后，1200rpm离心 离心 ，弃去上清液， 再加入5ml 0.85 %NaCl溶液按上述条件离心一次。最 溶液按上述条件离心一次。 再加入 溶液按上述条件离心一次 弃去上清液，加入10ml的GKN溶液制成鸡血细 后，弃去上清液，加入 的 溶液制成鸡血细 胞悬液。 鸡血细胞悬液， 胞悬液。取0.5ml鸡血细胞悬液，用GKN溶液稀释至 鸡血细胞悬液 溶液稀释至 1X107个/ml，备用。 ，备用。
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导实验目录:实验一：特殊显微镜的原理及其使用实验二：电子显微镜的原理及使用实验三：细胞膜的渗透性实验四：细胞的凝集反应实验五：诱导细胞融合—聚乙二醇法实验六：线粒体和液泡系的超活染色与观察实验七：叶绿体的荧光原位观察实验八：细胞骨架的观察实验九：细胞中DNA、RNA的显示实验一特殊显微镜的原理及其使用I.暗视野显微镜的原理和使用一、实验目的1.了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理；2.了解暗视野显微镜的特殊组件和位置；3.掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。
二、原理和结构特点在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。
暗视野显微镜就是利用此原理设计的。
它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜。
从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。
在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像．并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。
但被检物体为非均质时，并大于1/2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。
一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004μm以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2μm)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。
三、仪器、材料与试剂（一）仪器具有暗视野聚光器的显微镜（二）材料牙垢微生物，洋葱内表皮细胞，载玻片，盖玻片，牙签，尖头镊子，滤纸条，指甲油，擦镜纸等。
（三）试剂生理盐水四、实验步骤1.样品制备：在一张无划痕、清洁的载玻片上滴一滴生理盐水，用牙签取牙垢或用镊子撕洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上一片无划痕、清洁的盖玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，用指甲油封片（或不封片）。
细胞融合实验原理及步骤
实验十三细胞融合一、实验目的：两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。
人工细胞融合开始于五十年代。
六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广，不仅名类细胞可以全并，种间远缘细胞也能合并，细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。
动物细胞如此。
因此融合细胞的研究成为生物学不论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路，如目前在核质关系，体细胞的遗传与发育，新品种的培养，免疫作用，疾病的治疗和性状的改良。
潜伏病毒的研究等方面上，有的已取得了显著的成绩，有的正在探索之中。
通过实验对体细胞融合有一个清楚概念。
并初步掌握动物细胞合并技术。
二、材料和方法（1）取艾氏腹水瘤细胞。
用注射器剌入接种瘤细胞7—10天的小白鼠腹腔内吸取1或2ml腹水，注放离心管内；加改良的Hank’s液（pH7.4）（缺葡萄糖的Hank’s液，Okaba，1962）以800rpm（转速）离心5分钟，取出上清液，再入改良Hank’s液，搅拌，再同样清洗两次，一次5分钟，一次十分钟，最后再加上适量Hank’s液。
计算每亳升的细胞数量，如与其它细胞合并用，适宜数目一般为107个/ml，即毫升约1000万个细胞。
（2）取鸡血球，在一只公鸡的翼静脉抽取，抽取数量随需要而定，如取5毫升，可用20毫升针筒，先将针与筒用Alsver液润湿，吸入50毫升Alsver 液剌入翼下静脉，吸取5毫升液，注入15毫升Alsver液瓶内，使血液与Alsver 液的比例为1：4。
存入4℃冰箱内务作一星期使用。
作实验时取这种贮备的鸡血球1毫升加入4毫升0。
85%生理盐水以1200—1500rpm离心三次（5分钟、5分钟、10分钟），每次离心后去上清液，加0。
85%生理盐水并搅匀，最末一次离心后，根据沉淀血球量的多少，加入适量0。
85%生理盐水使成1%悬液（0。
1毫升血球加10毫升液体），取1%悬液1毫升加上2毫升或3毫升0。
85%生理盐水或改良Hank’s液，使每一毫升含有血球1500万左右。
细胞融合实验报告
细胞融合实验报告【实验题目】动物细胞融合【实验目的】1.了解动物细胞融合的常用方法。
2.学习化学融合的基本操作过程。
3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。
【实验材料与用品】1、材料鸡血红细胞2、试剂50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。
3、器材倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。
【实验原理】细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。
目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。
1、病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。
用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2、化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。
这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。
PEG是广泛使用的化学融合剂。
3、电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等。
其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。
电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
【实验步骤】在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。
具体实验步骤如下：1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好，可直接使用】2、取（1）中悬液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： 1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； 1000-1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml；1000-1200r/min下离心7min【因时间关系此次实验只离心一次】3、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN至1-2ml，使之成为10%的细胞悬液；4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球xxxx个；5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，2-3min后，显微镜下观察。
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细胞生物学实验
实验结果
土豆凝集素对兔血红细胞的凝集作用
PBS对照
PEG诱导, 鸡血细胞融合情况
实验报告
细胞生物学实验
绘图或照片表示观察到的细胞融合现象,哪些因素 会影响其融合?（进行多个视野的测定，统计平均 融合率.若进行多个时间的融合实验，请比较融合 时间对融合率的影响，分析可能的原因）
➢ 细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个具有双核 或多核细胞的过程。在自然情况下，体内和体外培养的细胞 均能发生自发融合现象;
➢ 细胞融合可在自然条件下或利用人工条件 (生物的、物理的、 化学的)下进行;
➢ 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处 质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子 层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发 生融合,形成双核或多核细胞 ;
细胞生物学实验
实验五
细胞融合（聚乙二醇法） 凝集素对细胞的凝集反应
实验目的
细胞生物学实验
通过细胞融合的观察
了解细胞融合的原理 掌握用PEG诱导细胞融合的方法
通过细胞的凝集反应的观察
➢ 了解细胞膜的表面结构 ➢ 了解细胞发生凝集反应的原因 ➢ 学习研究细胞凝集反应的方法
实验原理
细胞生物学实验
细胞融合
染色镜检
➢ 取1滴PEG诱导后血细胞悬液滴于载玻片上,再加入0.2% Janus Green B染液1滴，混匀，盖上盖玻片，染色5-15min 后,显微镜下观察观察细胞融合状况;
➢ 注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞
计算融合率(%) 融合率 = 融合细胞数/总细胞数 ×100%
细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与 该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百 分比表示, 而且要进行多个视野测定，进行统计分析。
细胞融合的诱导
➢ 取以上细胞悬液1ml放入10ml的离心管中，置40℃水浴中预热，同 时将50％PEG液一并预热20min；
➢ 取0.5ml的50％PEG溶液逐滴沿离心管壁加入到细胞悬 液中，边加边摇匀，置40℃水浴中保温2-10min (可处理
1,2,5,10min取样)，染色镜检
实验步骤
PEG诱导鸡血细胞融合(续上)
➢0.2% Janus Green B ➢抗凝剂:肝素溶液(200μg/ml) 实验器材
➢显微镜、离心机、水浴锅、研钵、镊子、凹 面载玻片、盖玻片、吸管、试管、离心管等
实验内容
细胞生物学实验
PEG诱导鸡血细胞融合 土豆凝集素对兔血红细胞的凝集作用
PEG诱导鸡血细胞融合
实验步骤
2%鸡红细胞悬液制备
绘图或照片表示观察到的血细胞凝集现象，并说明 原因。
思考题
细胞生物学实验
1.如何测定凝集素的活性与效价？
2.凝集素活性的影响因素有哪些？
3.根据自己的实验结果，分析在实验过程中影 响融合率的主要步骤。
➢ 凝集素广泛存在于植物，动物和微生物中，是一类 可逆结合特异糖基的蛋白质，能与细胞膜外被的寡 糖链相连接，使细胞发生凝集;
➢ 一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的 能力
实验用品
实验材料 ➢土豆块茎、鸡全血、 兔全血
实验试剂 ➢磷酸缓冲液(PBS),pH 7.2 ➢50%聚乙二醇(PEG,MW=4000) ➢GKN液 ➢生理盐水
➢ 融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、 反应温度、细胞的生理状态与密度等有关。
➢ 通过有丝分裂，细胞核便发生融合，形成杂种细胞。
实验原理
细胞生物学实验
细胞凝集反应
➢ 细胞膜的基本成份是膜脂和膜蛋白质，膜脂和膜蛋 白又可被糖基化成糖脂和糖蛋白，分枝状的糖基主 要位于质膜外侧构成细胞表面的糖外被;
➢ 取抗凝全血1mL，移入10mL离心管，加入4mL生理盐水混匀， 3000rpm离心3 min。重复洗涤1次。弃去上清，加GKN液4ml，再 洗涤离心1次；
➢ 收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入适量的GKN溶液，转入 1.5mlEP管,3000rpm离心3min，按压积红细胞体积配成2％的红细 胞悬液（用GKN配制，可以用血球计数板计数将其调整约为107个 /ml)
实验步骤
土豆凝集素对兔血红细胞的凝集作剂)1 ml,移入10mL离心管, 加入4mL生理盐水 混匀, 3000rpm离心3min,离心洗涤3～5次(Why?)
➢ 把最后的沉淀转至1.5mlEP管中， 3000rpm离心3min，最后按压 积红细胞体积加生理盐水配成2%兔血细胞液。
马铃薯凝集素提取
➢ 称取马铃薯去皮块茎2g，加少许磷酸缓冲液研磨成匀浆，最终加到 15ml磷酸缓冲液，浸泡0.5～1h，浸出的粗提液中含有可溶性马铃 薯凝集素。
细胞凝集反应观察
➢ 吸取马铃薯凝集素粗提液1滴置凹玻片上, 加2%兔血细胞液1滴, 充 分混匀，加盖玻片,静置片刻后于光学显微镜下观察细胞凝集现象。