建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记
芽孢杆菌及其提取物对兰花茎腐病的防治效果
作者 简介 ： 朱秋 潮 （９ ０一） １６ ，男 ，浙江 绍兴人 ，高 级农 艺师 ，从事 农业 推广工 作 。Ｅ ｍ ｉ： ｕ ｉｃａ ＠ ｙｈ ｏ ｃ 。 — ａ ｚ ｑｕ ｈ ｏ ａｏ ． ｎ ｌｈ － ａ ：ｈ ｎ ｌ ｊ ｅ ｕ ｅ 。 ｌ ｕ 通信作 者 ： 陈卫 良，Ｅ ｍ ｉ ｃ ｅ ｗ＠ ｚ ． ｄ ． ｎ
朱秋 潮 ，杨 惠 张 甲辰 陈 卫 良 ， ，
（ ．浙 江 省 绍 兴 市农 业 技术 推 广 总 站 ，浙 江 绍 兴 ３ ２ ０ ；２ １ １ ０ ０ ．浙 江 大 学 生 物 技 术研 究 所 ，浙 江 杭 州 ３ ０ ５ １０ ８
３ 杭 州 广 普 生 物 科技 有 限公 司 ，浙 江 杭 州 ３ １ １ ） ． １２ ５
为 ６ ． １ ，处 理 ３为 ６ ． ｌ ；药 后 １ ， 以 处 ２３ ％ ０ Ｏ％ ５ｄ
理 １对稻 飞虱 的防 治 效果 最 佳 为 ８ ． ３ ，处 理 ２ ６１％
次 之 为 ８ ． １ ，处 理 ３为 ７ ． ５ 。 ０２％ ３０ ％ 稻飞 虱 的 田问 药 效试 验 ［ ］ １ Ｊ．广 西植 保 ，
王 泽 乐 ，王 梓 英 ，刘 祥 贵 ，等．重 庆 市 稻 飞 虱 、稻 纵 卷 叶 螟
２０ ０９年重 发生 的特 点及原 因 ［］ Ｊ ．西南 师范 大学 学报 ，２ １ ，３ ０１ ６
（ ） ３—８ ． １ ：８ ７
刘 庆友 ，张 玉美 ，姚 骏
不 同 药剂 及 剂 量 防 治水 稻 稻 飞虱 药 效
… ｌ ｎ 人 估计 浙江 省每 年 因此 病 害而造 成 的损失 都在几 千
养兰者注意兰花头号“灾星”镰刀菌
养兰者注意兰花头号“灾星”镰刀菌养兰者注意兰花头号“灾星”镰刀菌2011年五六月份，摆放在阳台上的数盆兰花陆续出现了问题：有的小兰苗叶片起皱，轻轻一拔就抽出，其叶片基部腐烂，变黑色，呈水渍状，闻一闻似乎有点淡淡的腥臭味。
有的老株上，叶基部桔黄，后来逐渐从心叶开始，从叶片基部向上变褐变黑，最后全株干枯死亡；拔起病株，可见假鳞茎呈黑色，捏一捏还挺硬，也有的假鳞茎呈水渍状腐烂，但切开假鳞茎都可见到剖切面变褐（健康株呈乳白色），依书上说法和笔者的经验，认为前者很大可能是细菌性软腐病，后者则是兰友们所说的烂头病——茎腐病，对于较金贵的名品，切去病株后，把治细菌病的农用硫酸链露素和治茎腐病的噁霉灵等农药混合后用于浸泡发病兰盆的健康株，然后重新用新植料上盆；对于普通品种，则只是拔去病株，将农药粉末直接撒在发病株周围的植料中，可过了一段时间，发现效果并不明显，有的重新上盆后的健康株也发病了……这究竟是什么病？病原是什么呢？这年8月，笔者将一丛发病株送福建农林大学请张绍升教授做病原很久，鉴定结果出来了：病原是镰刀菌，为茎腐病。
茎腐病是兰花的不治之症，兰反们淡“腐”色变。
笔者当然知道它的厉害，但既然得了也就没什么理会它。
之后，在秋季又有两三盆得病；再后来，随着冬季气温下降，病害也基本没什么发生………笔者想，也许这“坎”就过了？！事情的发展并没有这么简单。
到了第二年，201 2年的梅雨季节，兰花又陆陆续续出现了问题，其症状与前一年相似，发病的兰盆数量明显增多，至秋季时发病盆数累计达到20多盆，占阳台的兰花盆数的三分之一，令人心痛。
在这些病株中，有些症状典型，明显是患了茎腐病；是不是也有其他的病害呢，如细菌性软腐病等呢？2012年-8月，笔者又取5个病株样本（含枯死的老苗、腐烂新苗、枯死叶片）、送福建农林大学做病原鉴定。
几天后，鉴定结果出来了： 5个样本病原都是镰刀菌！这结果有点出乎笔者的意料之外：春兰‘万字’、建兰‘铁骨白芽”均为前垄草新苗得病，且其腐烂处有点腥臭味，可能性更大的应该细菌性软腐病啊！建兰锦旗叶片从尖部开始枯黄（叶枯病），居然镰)J菌所致！由此，可以得出以下两个结论：（1）镰刀菌所致的茎腐病可发生于老苗或新苗，兰友们所持的“发病于老病为茎瞒病，发病于薪苗为细菌性软腐病”的观点是错误的。
化学生物学综合创新设计实验——大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白
３ 试 剂与 仪 器
３１ 试剂 ． 高保真 Ｔｑ酶 ，Ｎ Ｐ ， Ｔ 卡那霉 素， ａ ｄ Ｔ ｓＩ Ｇ， Ｐ 氯 化钙 ，４Ｄ Ａ连接酶 ， Ｔ Ｎ 限制性内切酶 Ｂｍ 和 Ｈｎ Ｉ ａ ＨＩ ｉｄＩ Ｉ
（ ａ ａ ａ ， 脂糖 ， 乙啶 ，Ｃ 纯化试剂 盒 （ ｍ ｇ ｉ ＴＫ Ｒ ）琼 溴 ＰＲ Ｏ ｅａＢｏ
１８ ６
江
西
农
业
学
报
２ ３卷
显微镜检测表达情况。
ｔ ，Ｎ Ｐ ｔ （ ． ｍ １ ，０ ｕｅ ｘ ｄ Ｔ ｓ Ｌ ２ ０ｍ ｏ） １ Ｂ ｆｒ ， Ｌ ２ｘ Ｘ ｆ２ 普通 Ｔｑ ａ 酶 ０２ （ ． Ｕ ， ． ２５ ）去离子水 １． 。反应条件 同４ １ ３３ ． 中条件。将反应后产物进行琼脂糖凝胶 电泳检测 ， 如果
验步骤。
收稿 日期 ： １ —０ ２ １ ６—２ ０ ５ ‘
笔者在任课教师 以往从事科研 的基础上 一 设计 ，
了该综 合 创 新 实 验 ， 绿 色 荧 光 蛋 白基 因 将 插 入 ｐ Ｔ ８ 表达系统 ， Ｅ ２ａ 进行绿色荧光蛋 白表达 ， 并使用荧光
基金项 目： 国家水体污染控制与治理科技重大专项 （０９ Ｘ ７２ — ０ ） 河南农业大学博士启动项 目（００ １ １ 。 ２０ Ｚ ０ ４３ ０３ ； ３ ３０７ ） 作者简介 ： 赵仲麟（９ Ｏ ）男 ， １ 一 ， 辽宁鞍山人 ， ８ 讲师 ， ， 博士 主要从事化学生物学及分子生物学的科研与教学工作。 通讯作者： 袁超。
江西农 业学报 ２ １ ，３ ８ ：６ ０ １ ２ （ ） １７～１８ ６
ＡｅａＡｇｉｕ ｕａ ｉｎ ｘ ｔ ｒｃ ｈ ｒｅＪａ ｇ ｉ
化 学生 物 学综 合创 新 设计 实验
西番莲茎基腐病病原尖孢镰刀菌生物学特性及木霉菌防治初探
西番莲茎基腐病病原尖孢镰刀菌生物学特性及木霉菌防治初探包文杰1，2，申凌婕3，杨效东1*（1中国科学院西双版纳热带植物园，云南勐腊666303；2中国科学院大学，北京100049；3普洱学院，云南普洱665000）摘要院西番莲（）茎基腐病是由镰刀菌（）引起的一种土传病害。
为了更好地防治该病，以西番莲病株中分离的茎基腐病病原尖孢镰刀菌（）和3种木霉菌（）为材料，测定不同pH值和温度条件下病原菌生长情况，同时，通过平板对峙试验，比较3种木霉菌对病原菌生长的抑制效果，探讨其作为生物防治菌剂应用于农业生态系统中的可能性。
结果显示，酸性和高温条件不利于病原菌生长，其中，最适生长pH值为7~9，最适生长温度为25~27℃，同时，3种木霉菌对病原菌生长均具有显著的拮抗作用。
希望研究结果能够为防治西番莲茎基腐病提供理论依据。
关键词院西番莲；茎基腐病；尖孢镰刀菌；生物学特性；木霉菌；生物防治西番莲（）又称百香果、鸡蛋果，为西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（）多年生常绿藤本果树，广泛种植于热带和亚热带地区[1-2]，果实具有丰富的营养价值和药用价值[3-6]。
西番莲在我国广东、广西、福建、台湾和云南等地均有分布，种植面积已超过3万hm2[7]，目前，市场上主要种植的2个品种是紫果西番莲（）和黄果西番莲（）[8]。
然而随着西番莲产业不断发展，由于病原菌入侵，使得西番莲生产正面临严重的病害威胁，其中，茎基腐病是生产中亟待解决的问题。
茎基腐病是一种典型的土传病害，能够造成植株茎基部腐烂，影响水分和营养物质的运输，最终导致整株枯萎死亡，严重时可引起种植区大面积连片枯死。
目前，人们对西番莲茎基腐病的病原菌种类已有了一定的了解，不同地区引起西番莲茎基腐病的病原菌有所差异。
郑加协等[9]、陈星等[10]通过分离培养和接种，鉴定福建和广西地区西番莲茎基腐病病原菌为尖孢镰刀菌（）；宋晓兵等[11]、Hao等[12]通过调查广东和云南地区西番莲茎基腐病，确定病原菌为腐皮镰刀菌（）；詹儒林等[13]通过形态特征，鉴定海南琼海西番莲茎基腐病的致病菌为烟草疫霉菌（）。
兰花茎腐病病原菌的分离与鉴定
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
２ 结 果 与分 析
２ １ 兰 花 茎 腐 病 症 状 ．
兰 花茎腐 病病 株取 自中国春 兰样 品园基地 和 台 州 、温 州等地 。
１ ２ 病 原菌 的分 离 纯化 ．
病 菌是 从 兰 花 根 部 侵 入 ，通 过 维 管 束 向 上 发
将 １ 丛健 康无 病 的兰花 分成 大 小基 本 相 同的 ４
株 ，编 号 １ ，３ ，２ ，４ ，用 剪 刀 剪 开 植 株 的 根 部 ， 再 将植 株 移 栽 到灭 过 菌 的 土壤 中 ，浇 透 水 。将 ２ ， ３ ，４号接 入 已计 数 的镰 刀 菌悬液 ，１ 号作 为对 照 不 接 入 菌液 ，２ ５℃室温 下培 养 。
１ ４ 回 接 实 验 ． １ ４ １ 镰 刀 菌 计 数 ． ．
用 双蒸水 悬浮 培养皿 内的菌落 ，用 ２层擦 镜 纸 过 滤获 得孢 子悬液 。用 双蒸 水适 当稀 释后用计 数 板
计数。
１ ４ ２ 镰 刀 菌 接 种 ．．
２０ ０ ５年 ４— ８月 ， 仅因茎腐病造 成兰花 损失 在 １ 亿元
关 键 词 ：兰 花 茎 腐 病 ；镰 刀 菌 ；分 离 鉴 定 中 图分 类 号 ：ｓ６ ２ ３ ８． １ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：０ ２ －０ ７ ２ １ ） ６０ ６ －２ ５ ８９ １ （ ０ ２ ０ －８ ０ ０
兰花 （ ｙ ｂ ｉｍ ｓｐ ）属 于 兰 科 兰 属多 年 生 Ｃ ｍ ｉ ｕ ｐ ． ｄ 草 本 单 子 叶植 物 ，以其 高 雅 、幽美 、独 特 的花 型 、 花 色 、香味深得 人 们 的喜爱 与 珍藏 ，在 国 内外花 卉 市 场上 占有 重要 的地 位 。但 随着 盆栽 兰 花混 摆 和野 生兰花 的 驯化 与 推 广 ，其 病 害 的 发 生 越来 越 严 重 ， 新 的病害也 时有 出现 ，严重影 响了兰 花的观 赏价值 ， 也带来 了很 大 的经济 损失 。兰花 茎腐 病 是其 中最严 重 的病害 。通 常情 况 下 ，因茎 腐 病造 成 兰花 死亡 达 ２ ％ 以上 ，有 的甚 至 可 达 ３ ％ 。云 南 大 理 州 调 查 ０ ０
6种杀菌剂对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的毒力及联合作用
6种杀菌剂对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的毒力及联合作用黄鹏;陈峰;姚锦爱;余德亿【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2018(033)004【摘要】为筛选出对建兰茎腐病防效好的增效混剂,室内测定6种杀菌剂对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的毒力及其联合作用.结果表明:6种杀菌剂对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌均有不同程度的抑制作用,抑制中浓度EC50的由小到大依次为:咪鲜胺、苯醚甲环唑、多菌灵和肟菌酯、噁霉灵和代森锰锌;设定的4组混剂配方,苯醚甲环唑+多菌灵、多菌灵+肟菌酯混配表现为增效作用,苯醚甲环唑+多菌灵混配的最佳有效成分质量配比为5:5,共毒系数为378.63;多菌灵+肟菌酯混配的最佳配比则为8:2,共毒系数为247.80.可见,苯醚甲环唑+多菌灵和多菌灵+肟菌酯合理比例混配能较好防控建兰茎腐病的发生为害.【总页数】5页(P396-400)【作者】黄鹏;陈峰;姚锦爱;余德亿【作者单位】福建省农业科学院植物保护研究所 ,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所 ,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所 ,福建福州 350013;福建省作物有害生物监测与治理重点实验室 ,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所 ,福建福州 350013;福建省作物有害生物监测与治理重点实验室 ,福建福州 350013【正文语种】中文【中图分类】S436.8;S482.2【相关文献】1.建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究 [J], 姚锦爱;黄鹏;陈峰;余德亿2.几种杀菌剂对番茄茎基腐病的毒力筛选 [J], 张博;张悦丽;马立国;祁凯;李长松;齐军山3.杀菌剂对葡萄白腐病、黑痘病病原菌的室内毒力测定 [J], 张久慧;杨胜清;马贵龙4.几种杀菌剂复配对棉花红腐病菌的联合毒力研究 [J], 潘月敏;高智谋;汪敬鑫;曹君;汪涛5.建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记 [J], 姚锦爱;张鸿;黄鹏;陈峰;余德亿因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究
建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究作者：姚锦爱黄鹏陈峰余德亿来源：《福建农业学报》2018年第02期摘要：为明确建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性，室内测定了温度、pH值、光照、碳氮源对病原菌生长和产孢量的影响，以及病原菌孢子的致死温度及时间。
结果表明：该病原菌生长及产孢最适温度为25℃、pH值为7、光照条件为12 h光暗交替、碳源为a-乳糖、氮源为NaNO2，病原菌孢子的致死温度及时间为55℃水浴5 min。
研究结果可为建兰茎腐病的有效防控措施的选择奠定基础。
关键词：建兰；茎腐病；尖孢镰刀菌；生物学特性中图分类号：S 436.8文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）02-190-05Abstract： Biological characteristics of pathogenic Fusarium oxysporum， which causes stem rot disease on Cymbidium ensiflium， were studied. Effects of temperature， pH， light， and carbon and nitrogen sources on the hyphal growth and sporulation of the pathogen were examined. In addition， the lethal temperature and time of F. oxysporum spores were determined. The results showed that the optimal conditions for the growth and sporulation of the pathogen were 25℃， pH 7， 12-h-L∶12-h-D exposure， lactose monohydrate for carbon， and NaNO2 for nitrogen. The lethality of the spores was 5 min in 55℃ water.The study provided reference for the effective control of stem rot on C.ensifolium.Key words： Cymbidium ensifolium； stem rot； Fusarium oxysporum； biological characteristics建兰Cymbidium ensifolium是兰科Orchidaceae兰属Cymbidium多年生单子叶草本植物，在我国民间有着悠久的栽培历史，植物学界以其主产地福建命名，是福建传统特色花卉及主要出口创汇花卉[1]。
快速检测百合鳞茎腐烂病病原菌——尖孢镰刀菌的方法[发明专利]
![快速检测百合鳞茎腐烂病病原菌——尖孢镰刀菌的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/1d51a8e652ea551811a6873d.png)
专利名称：快速检测百合鳞茎腐烂病病原菌——尖孢镰刀菌的方法
专利类型：发明专利
发明人：明军,袁素霞,杨盼盼,曹雨薇,徐雷锋
申请号：CN201511017538.4
申请日：20151230
公开号：CN106319039A
公开日：
20170111
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明为一种基于DNA分子检测技术，应用于快速检测百合鳞茎腐烂病病原菌——尖孢镰刀菌的方法。
它涉及一对用于扩增百合尖孢镰刀菌的特异性引物。
本发明解决了以往需要从感病鳞茎分离、纯化病原菌，提取DNA后经通用引物扩增及测序比对后才能鉴定出病原菌的种类，即无法用现有的通用引物直接从扩增结果中鉴定出百合尖孢镰刀菌的问题。
本发明用于扩增百合尖孢镰刀菌的特异性引物对命名为FO-lilii F/FO-lilii R，本发明的引物对能够快速准确地扩增出百合鳞茎腐烂病病原菌——尖孢镰刀菌的目的片段。
申请人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所
地址：100081 北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院蔬菜花卉研究所
国籍：CN
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建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记姚锦爱;张鸿;黄鹏;陈峰;余德亿【摘要】[目的]开展建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白标记研究,直观观察尖孢镰刀菌在建兰植株上的侵染为害,明确病原菌的致病过程,为开展建兰茎腐病原菌的相关研究提供良好技术手段.[方法]采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白(GFP)转化,并检测转化子的遗传稳定性.[结果]G F P基因可被成功导入到尖孢镰刀菌F-02中并获得表达,转化子在蓝色光源激发下,菌丝和分生孢子均能稳定散发绿色荧光;转化子10次继代培养后菌落生长良好,菌丝和分生孢子仍可稳定散发出绿色荧光,对寄主植物的致病力也未发生改变,[结论]G F P基因可在建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中稳定存在,并对其致病力没有影响.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2019(034)001【总页数】6页(P70-75)【关键词】建兰;茎腐病;尖孢镰刀菌;绿色荧光蛋白;基因标记【作者】姚锦爱;张鸿;黄鹏;陈峰;余德亿【作者单位】福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省作物有害生物监测与治理重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院作物研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省作物有害生物监测与治理重点实验室,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】S436.80 引言【研究意义】由尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum引起的建兰茎腐病是影响福建省建兰种植的最严重真菌病害之一，可引起兰株假鳞茎和根部腐烂、维管束褐变，导致兰株萎蔫至死亡，兰株感病率高达15%～35%[1]。
目前对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性已有一些认知[2]，但对该菌的致病机理还缺乏深入研究，因此探讨如何更直观、方便地观察该菌在建兰植株上的侵染、致病过程，对研究该菌在建兰上的致病机理、科学防治建兰茎腐病具有指导意义。
【前人研究进展】绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是一种良好的标记物，其片段小，易于与多种不同蛋白N端或C端融合，表达后对寄主细胞无毒性作用并能自发产生荧光蛋白，可作为报告基因进行定位与定性检测，目前已广泛应用于植物病原菌致病机理的研究[3-5]。
现阶段，国内外学者已成功利用GFP基因标记了番茄、香蕉、甜瓜和香石竹等寄主植物上的尖孢镰刀菌[6-10].【本研究切入点】目前尚未见将GFP用于标记建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的研究报道。
【拟解决的关键问题】本研究以pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp为转化载体，农杆菌AGL-1为转化介体，采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白(GFP)基因标记，并检测转化子的遗传稳定性，为建兰茎腐病原菌的致病机理研究提供技术手段。
1 材料与方法1.1 试验材料建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F.oxysporum野生型菌株 F-02，来源于福建省农业科院学植物保护研究所。
转化载体pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp和转化介体农杆菌AGL-1，来源于福建省农业科学院农业生物资源研究所。
抗生素(潮霉素B、卡那霉素、特美汀)购自美国Sigma公司。
农杆菌转化所用药品均为分析纯，储存液及MM(Minimal Medium)液体培养基、IM(Induction Medium)液体培养基、CM(Complete Medium)固体培养基的配制见表1。
表1 农杆菌转化所需储存液及培养基的配制Table 1 Ingredients in stock solutions and media used for agrobacterium transformation制剂Reagent100 mL储存液Stock solution to 100 mL100 mL培养基所需药品用量Amount required to make 100 mL药品Chemical用量Amount requiredMM 液体培养基MM liquid mediumIM 液体培养基IM liquid mediumCM固体培养基CM solid mediumK-缓冲液 K-buffer (pH 7.0)K2HPO420 g1 mL1 mL1 mLKH2PO414.5 gM-N 缓冲液M-N bufferMgSO4·7H2O3 g2 mL2 mL2 mLNaCl 1.5 g1% 二水合氯化钙1% CaCl2·2H2OCaCl2·2H2O1 g0.1 mL0.1 mL0.1 mL微量元素Spore elementsZnSO4·7H2O0.01 g1 mL 1 mL 1 mL CuSO4·5H2O0.01 gH3BO30.01 gMnSO4·H2O0.01 gNa2MoO4·2H2O 0.01 g20%硝酸铵20% NH4NO3NH4NO320 g0.25 mL 0.25 mL 0.25 mL 20% 葡萄糖20% GlucoseGlucose20 g1 mL 1 mL 1 mL 0.01%硫酸铁0.01%FeSO4FeSO40.01 g1 mL1 mL1 mL50% 甘油50% GlycerolGlycerol50 mL-1 mL1 mL1 mol·L-1乙磺酸1 mol·L-1 MES (pH 5.3)MES 21.32 g -4 mL4 mL卡那霉素Kanamycin stock0.15 mL0.15 mL0.15 mL乙酰丁香酮Acetosyringone-0.2 mL0.2 mL琼脂Agar1.5g去离子水Sterile H2O93.5 mL88.3 mL88.3 mL1.2 农杆菌转化及培养建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02菌株的GFP基因标记参照Khang和张俊华等[11-12]的方法，略作改动。
具体步骤：(1)将菌株F-02在PDA固体培养基上纯化培养6 d，后加入无菌水将分生孢子刮洗后用2层无菌擦镜纸过滤，滤液用IM液体培养基将分子浓度调整到1×106 个·mL-1，备用；(2)将转入pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp载体的农杆菌AGL-1在MM液体培养基中，28℃及250 r·min-1摇培2 d，后用IM液体培养基将菌液吸光值调整为OD600=0.15，接着摇培6 h(OD600≈0.60)；(3)将混合纤维微孔滤膜[生工生物工程(上海)股份有限公司]放置在CM固体培养基上，将100 μL菌株F-02孢子悬浮液和100 μL农杆菌AGL-1孢子悬浮液轻轻混匀后均匀涂布于混合纤维微孔滤膜上，25℃暗培养2 d；(4)2 d 后，将共培养的混合纤维微孔滤膜用无菌解剖刀划成小块，接菌面朝上分散摆放到筛选培养基(含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀的PDA固体培养基)上，28℃暗培养3 d；(5)经筛选培养基上培养后，将培养皿整皿放置在BD-BGC1蓝光切胶仪(上海勤翔科学仪器有限公司)中，在蓝色激发光下观察菌落发光情况，挑选发出绿色荧光的小菌落，取边缘菌丝于无菌水中，按梯度稀释涂布培养3～5 d后，将单一的孢子体转接到PDA固体培养基(含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀)上进行单孢分离与纯化，获得转化子。
1.3 转化子荧光显微镜观察鉴定将转化子用含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀的PDA固体培养基，28℃培养6 d后，挑取转化子菌丝和分生孢子样品制玻片，在奥林巴斯IX73荧光显微镜下进行观察鉴定以及照相。
1.4 转化子的遗传稳定性测定随机挑取6个经单孢纯化后的单菌落即转化子，接种于PDA 固体培养基中，28℃培养6 d，选取平皿边缘的菌丝转接到新的PDA固体培养基中，按以上方法连续培养9代，后将第10代接种到PDA固体培养基(含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀)中，观察转化子菌落生长情况；同时挑取转化子的菌丝和分生孢子制成玻片，在荧光显微镜下进行观察鉴定及照相，以野生型菌株F-02为对照。
1.5 转化子的致病力测定参照许志刚[13]的方法测定转化子的致病力。
将野生型菌株F-02和转化子菌株在PDA固体培养基上于28℃活化培养6 d，备用。
田间选取叶片和假鳞茎等无伤痕的一年生建兰健康植株，用无菌水轻轻冲洗干净，自然晾干后用于致病性测定。
采用造伤接种法进行接种：在植株假鳞茎部用无菌接种针轻轻刺伤，后敷上0.5cm×0.5 cm待测菌株的菌丝块，用无菌水浸湿的棉花包裹菌丝块保湿，后置于冷光源植物气候箱DRX-400(宁波赛福实验仪器有限公司)中，温度(28±0.5)℃，光周期16 L∶8 D，接菌5、7、15 d后观察发病情况，两处理菌株各接菌5株建兰植株，3次重复，待假鳞茎部产生典型病斑后重新分离病原菌。
同时，切取转化子的接种部位进行徒手切片，在奥林巴斯IX73荧光显微镜下选取观察效果佳的玻片，后使用Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜进行观察及拍照。
2 结果与分析2.1 菌株在混合纤维微孔滤膜上的转化情况建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02孢子悬浮液，在混合纤维微孔滤膜上与农杆菌AGL-1孢子悬浮液共培养2 d后，发生转化，产生少量菌丝和细菌混合物，略呈紫色(图1)。
图1 菌株F-02与农杆菌共培养后在混合纤维微孔滤上的生长情况Fig.1 Co-culture of F-02 and agrobacterium on mixed fiber microporous membrane 2.2 菌株转化后在筛选培养基上的生长情况经转化后的建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02，平贴在筛选培养基(含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀的PDA固体培养基)上，经过28℃暗培养3 d 后，在蓝光切胶仪中呈现绿色荧光小菌落，此小菌落即为转化子(图2)。
图2 转化子在筛选培养基上生长形态Fig.2 Morphology of transformants onselective medium2.3 转化子的荧光显微镜观察鉴定转化子的菌丝和分生孢子均能发出稳定的绿色荧光(图3)，说明GFP 基因已成功转入到建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中并获得表达。