从噬菌体抗体库中筛选抗Cry1Ac蛋白单链抗体
从噬菌体表面展示肽库中筛选衣原体单克隆抗体识别的抗原表位
ｒ ｅａ ｔ ｅ ． ｉ ｎ ｉ ｎ ｖ ｇ Ｋｅ ｒｂ：Ｐ ａ ｅ ｄ ｓ ｌ ｙ Ｒａ ｄ ｍ ｅ ｆ ｅ ｌ ｒ ｒ Ｃｈａ ｄ ａ Ｅｐｔ ｐ ｙ ｗ０ 【 ｈ ｇ ｉ ａ ； ｎ ｏ ｐ ｐ ｄ ｉ ａ ｙ； ｔｍｙ ｉ ； ｉ ｅ ｐ ｉ ｂ ｏ
正常小 鼠 ｌＧ筛选结果为阴性 （ ） ｇ ０ 。三轮筛 选后 ， 若 Ｐ ０比值大于 ２ 可认为出现富集 ， ／ ０ 随机挑选单克 隆制备原种 。筛选所用单抗 Ｃ ７ 正常小 鼠 ｔ １及 ｇ Ｇ 包被酶联板 ， ％Ｂ Ａ封闭非特 异性结合位点。加 ５ Ｓ 单克 隆 噬 菌 体 原 种 与包 被 抗 体 充分 结 合 后 ， 以 ＨＩ 一ｎｉ ３ 、 ＭＢ显 色 。Ｄ ３ ２Ａ 型 酶 联 免 ａｔ Ｍ１Ａｂ Ｔ Ｇ ０２
２ １ 生 物淘 洗 （ ｉ ａｎｎ ） ． Ｂｏ ｎ ｉ ｐ ｇ 单抗 Ｃ ７和正 常 小 鼠 ［Ｇ 溶 液 各 １０ ｌ 被 １ ｇ ０ 包 酶联板微 孔 ， 盒 ４ 过 夜 ，％Ｂ Ａ 封 闭 。淘 洗 方 湿 ℃ ５ Ｓ
心的研究 、 小分子肽疫苗设计、 抗原表位的确定中显 示 出优势 －。 １Ｊ ３
疫检 测 仪测 ０３５ 。 １４０ ２３ 提 取 阳性 克 隆单 链 Ｄ ． ＮＡ＋ ＱＩ ｒｐＳ ｉ 按 Ａｐｅ ｐｎ Ｍ１ ｔ５ ） 剂盒操 作 指 南进 行 。送 北 京 市普 京 ３Ｋｉ ０ 试 （ 康 生 物工程 技术 有 限公 司测序 ， 序 列 比较 分析 。 进行 ２ ４ 竞争 抑制 试验 Ｌ ． ５ Ｊ 衣原 体 超 声 波 破 碎 抗 原 包 被 酶 联 板 ， ％Ｂ Ａ ５ Ｓ
从大容量噬菌体抗体库中筛选抗体
将所分析得到的抗原性高的基因序列进行 ＢＬＡＳＴ比 对。选取抗原性高且与其他蛋白没有同源性的蛋白片 段进行表达。 １．２．２ 细胞培养 ＨｅＬａ细胞以 １×１０５接种于含 １０％ 胎牛血清的 ＤＭＥＭ 培养液中，５％ＣＯ２／９５％空气，３７℃ 孵育培养。 １．２．３ 总 ＲＮＡ提取及 ＲＴ?ＰＣＲ 收集指数生长期细 胞，Ｔｒｉｚｏｌ提取总 ＲＮＡ。定量后，Ｍ?ＭＬＶ逆转录酶合成 ｃＤＮＡ第一链。以反转录获得的 ｃＤＮＡ为模板，分别用 两对引物 Ｐ１，Ｐ２和 Ｐ３，Ｐ４对目的基因片段进行 ＰＣＲ扩 增。扩增反应的条件均为：９５℃预变性 １０ｍｉｎ，９４℃变 性 ４５ｓ，５５℃退火 ３０ｓ，７２℃延伸 １ｍｉｎ，扩增 ３０个循环。 ＰＣＲ扩增产物经 １％琼脂糖凝胶电泳回收纯化。 １．２．４ 重组克隆载体 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ４ 的构建与鉴定 将纯化的两段 ＰＣＲ产物分别连入载体 ｐＧＥＭ?ＴＥａｓｙ，构建重组质粒 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?Ｔ ＤＰＫ４，转化感受态 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α后 挑 取 阳 性 克 隆，用 ＮｄｅⅠ ／ＸｈｏⅠ 双 酶 切 质 粒 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?Ｔ ＤＰＫ４，将两段目的基因片段分别回收纯化。 １．２．５ 重组表达载体 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４ 的构建与诱导表达 将纯化的两段目的基因与经 Ｎｄｅ Ⅰ ／ＸｈｏⅠ双酶切的载体 ｐＥＴ?２２ｂ（ ＋ ）相连接，分别 构建重组表达载体 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４，转 化感受态 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α后挑取阳性克隆，用 ＮｄｅⅠ ／Ｘｈｏ Ⅰ双酶切鉴定。经测序分析正确的重组质粒 ｐＥＴ２２ｂ? ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４ 转 化 感 受 态 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ （ＤＥ３），挑取阳性克隆，接种于 １０ｍｌＬＢ／Ａｍｐ＋培养基 中，于 ３７℃培 养 过 夜。按 １％ 比 例 将 工 程 菌 转 接 于 ５００ｍｌ新鲜的 ＬＢ／Ａｍｐ＋培养基中，３７℃培养至 ＯＤ６００约 ０．５时，加 入 终 浓 度 为 ０．８ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱 导 表，于 ３７℃培养 ３ｈ。表达产物用 ＳＤＳ?ＰＡＧＥ检测。取 ５０ｍｌ 经诱导表达 的 工 程 菌 超 声 裂 解 后，分 别 取 上 清 组 分 及 沉淀组分 ＳＤＳ?ＰＡＧＥ分析。 １．２．６ 融合蛋白 ＤＰＫ３和 ＤＰＫ４的纯化 收获的工程 菌经超声破菌后，将沉淀物用 １％ ＴｒｉｔｏｎＸ?１００漂洗后 用缓冲液 Ａ（２ｍｏｌ／Ｌ尿素，２０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ，ｐＨ７．５）于 ４℃洗涤 ２ｈ，离心收集沉淀。经粗提的包涵体溶解于 缓 冲 液 Ｂ（８ｍｏｌ／Ｌ 尿 素，２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ ｐＨ８．０， ０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑），４℃搅拌 ２ｈ，使其充 分溶解。离心后取上清以 １ｍｌ／ｍｉｎ的流速上样于经缓 冲液 Ｂ平衡后的 ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和柱，上样后以缓冲液 Ｂ洗 柱；而 后 通 过 梯 度 混 合 器 形 成 从 缓 冲 液 Ｂ到 Ｃ
噬菌体展示库筛选构建血管细胞黏附分子-1单链抗体及其效价检测
噬菌体展示库筛选构建血管细胞黏附分子-1单链抗体及其效价检测刘纯宝;宋夷龄;张永学【摘要】目的：从噬菌体重组抗体库中筛选获得靶向血管细胞黏附分子‐1（Vcam‐1）的单链抗体，纯化浓缩后进行亲和性鉴定，并与单克隆抗体效价进行比较。
方法扩增Vcam‐1基因克隆质粒并转入真核细胞中表达获得Vcam‐1抗原蛋白，纯化后包被免疫管，通过4轮压力逐渐增大的“吸附‐洗脱‐扩增”过程筛选获得阳性克隆。
对阳性克隆进行ELISA检测，选取效价高的克隆送予测序并转入大肠埃希菌进行表达，认定高表达的样品为最终的阳性克隆。
将该阳性克隆转染入感受态细胞表达单链抗体，纯化后经ELISA检测并评价其抗原亲和性。
结果真核细胞表达的Vcam‐1抗原蛋白的分子量为85～90 kD。
以Vcam‐1抗原蛋白为免疫原筛选4轮所得的阳性克隆进行单噬菌体ELISA检测，从检测结果中选取9个效价高的克隆经基因测序共获得3个序列，其中1个序列对应的克隆高表达。
表达的单链抗体分子量约30 kD ，ELISA检测其对Vcam‐1抗原蛋白有较高亲和性，效价较单克隆抗体低。
结论利用噬菌体展示技术获得了靶向Vcam‐1的单链抗体，为随后的诊断和治疗应用奠定了基础。
%Objective To screen out single chain variable fragment antibody (scFv)specific to vascular cell adhesion mole‐cule 1(Vcam‐1)from phage recombinant antibody library ,and to evaluateits activity and compare its activity with full‐length monoclonal antibody.Methods Amplification of Vcam‐1 was performed by PCR and Vcam‐1 gene plasmid was transferred into eukaryotic cells to express Vcam‐1 antigen protein.Immune cuvette was coated with purified Vcam‐1 antigen ,and the positive clones were screened out by 4 rounds of“adhesion‐elution‐proliferation” process with gradually increasing pressure.The posi‐tive clones were tested by ELISA method and high titer clones were chosen for gene sequencing.Then the high‐titer clones were transferred into E.coli ,and the clone with the highest expression was regarded as the final requisite petent cells were infected by the final requisite clone and scFv was expressed.After purification ,the activity of scFv was tested by ELISA and its affinity was evaluated.Results Molecular weight of Vcam‐1 antigen protein was 85-90 kD.Positive clones were screened out by taking Vcam‐1 protein as the antigen ,and 9 high titer clones were obtained by single phage ELISA.Gene sequencing of these clones was carried out and 3 sequences were obtained ,1 of which got the highest expression.Molecular weight of the expressed scFv was about 30 kD.The scFv got high affinity to Vcam‐1 antigen according to ELISA ,in spite of its lower activity than full‐length monoclonal antibody.Conclusion scFv antibody specific to Vcam‐1 was successfully obtaine d from phage display librar‐y ,which laid the foundation of subsequent in vivo diagnosis and therapy.【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】5页(P390-394)【关键词】噬菌体展示;单链抗体;血管细胞黏附分子-1;重组抗体【作者】刘纯宝;宋夷龄;张永学【作者单位】华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，武汉 430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，武汉 430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，武汉 430022【正文语种】中文【中图分类】R543.1;R541.4抗体是疾病诊断和治疗的重要工具，抗体的制备经历了多克隆、单克隆和基因工程抗体三个阶段。
应用噬菌体抗体库技术制备抗体
应用噬菌体抗体库技术制备抗体摘要：噬茵体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因，将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(scFv)与噬茼体外壳蛋白基因PⅢ或PVI]I连接，使融合蛋白表达于噬茵体颗粒的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程富集筛选特异性抗体.。
这一技术将抗体基因型和表型联系在一起，使识剐抗原的能力和噬茵体的可扩增性统一起来，较好的模拟了体内的抗体产生的过程，成为一种高效的筛选体系。
噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。
构建容量大、特异性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心，也是其远大前景的基础.本文就噬茵体抗体库技术的原理、构建、筛选做一综述。
关键词：噬茵体抗体库技术；抗体库；噬茵体噬菌体抗体库技术(phage display antibody li—brary techniques)是指用聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性抗体。
20世纪80年代中期，Smith 在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。
由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了许多学者投入这一研究中，使得噬菌体抗体库技术得以迅速发展，并由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线.1 噬菌体抗体库技术的基本原理噬菌体抗体库技术的原理是将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与噬菌体的外壳蛋白Ill(PIl1)或外壳蛋白Ⅷ(PⅧ)基因随机重组，继而感染大肠杆菌，经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或ScFv一外壳蛋白融合蛋白的形式表达。
这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程就能筛选并富集特异性抗体。
所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。
基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定
基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定张留圈;张霄;刘媛;徐重新;张存政;谢雅晶;寇莉萍;刘贤金【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2014(000)009【摘要】【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略，建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法，为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。
【方法】采用磁珠液相正负筛选方法，经过4轮筛选后，对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定，通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆，并对其进行PCR鉴定和DNA测序，确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。
将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。
利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”，Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为“检测抗体”，建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。
【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原，利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。
结果显示，相对产出率随着筛选轮数的增加而提高，第4轮较第1轮提高了42倍；单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体，以试验孔OD450/阴性孔 OD450大于2.1为阳性标准，从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落，经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆，分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。
其中，hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。
对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现，在935 bp处均有明显的目的条带，通过对其进行测序和氨基酸序列比对，最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。
从人源大容量噬菌体抗体库中筛选抗生存素抗体
物 。 目前 ， 已经 有 多 种 针 对 ｓｒｉｎ靶 点 的药 物 开 ｕｖ ｉ ｖ 始 进 行 Ｉ期 或 Ⅱ 期 临 床 试 验 ， 反 义 寡 核 苷 酸 如
殖腺 中有微 量表 达 ， 其 他 正 常组 织 中均 未检 测 到 在
其表 达 ， 而在 大 部 分 肿 瘤 中则 高 表 达 尤 其 是 肺 、 乳
《 医 杂 》 １年１月 第１ 第２ 转化 学 志 ２ ２ ０ ０ 卷 期
Ｔｎ ｒｓ ａ
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１ 材 料 与方 法 １１ 大容 量抗 体 库及 主要 试 剂 大 容 量 噬 菌 体 抗 ．
３ｑ 培养 至对 数生 长期 ， ７３ 加入辅 助病毒 Ｖ Ｓ １ ， Ｃ Ｍ ３ ３ ＇培 养过夜 ， 心 收取上 清 即得 到 噬菌体 抗体 。 ０２ ｔ 离
分析有 ８种不 同的抗 ｓｒｉｎ的 ｓＦ 基 因 ， ｕｖ ｉ ｖ ｃｖ 在这 ８种 中有 ５种 获得 可溶性表达 。结论 术 获得 了特异性 的人 源抗生存 素抗体 ， 为其在今后肿瘤 治疗 中的应用奠定基础 。 利用噬菌体抗 体库技
［ 关键词 ］大容量抗体库 ； 生存素 ； 噬菌体抗体 ； 可溶性抗体 ［ 中图分类号 ］Ｒ ９ ． １ ３ ２ １ ［ 文献标志码 ］Ａ ［ 文章编号］２９ —０ ７ ２ １ ） ２０ ８ － ０ ５３ ９ （０ ２ ０ －０４０ ４
从噬菌体抗体库中筛选抗HIV-Tat蛋白单链抗体
序列 测定 ，并检测其抗原结合活性 。结果 经过筛选 ，获得了 １株能 与 Ｔａｌ蛋白特 异性结合 的 阳性 克隆 ，经检索 ｋａｂａｔ 数据 库 ，发现其轻 、重链 可变 区分别属于 ｖ Ｉ型 、Ⅶ Ⅲ型。结论 利用 噬菌体抗 体库技术可 以不经 过免 疫制备 出高
特异性 的人源化抗 Ｔａｔ蛋白单链抗体。
ｂｒａｒｙ．Ｍ ｅｔｈｏｄｓ Ｐａｎｎｉｎｇ ｏｆ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ—Ｔａｔ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｓｐｅｃｉｆ ｉｃ ａｎｔｉ—ＨＩＶ—Ｔａｔ ｓｃＦｖ．Ｔｈｅ ａｎｔ ｉｇｅｎ
ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆ ｉｅｄ，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｐａｎｎｉｎｇ，１ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｓｃＦｖ ａｌｓｏ ｃａ／１ ｂｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ，
Ｋ ｅｙ ｗｏｒｄｓ，Ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ；ＨＩＶ－Ｔａｔ；Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
（Ｃｈｉｎ．『ｌａｂ脚 ，２０Ｏ８，１２：０５９２）
，ＺＨＡＮＧ
Ｃｕｏ－ｌｉ，ｅｌ ａ１．（Ｔｈｅ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ删 如 Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆＰＩＡ，Ｃｈａｎｇｃｈ．ｎ １３００６２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｌｏｉｌｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔ ｉ—ＨＩＶ—Ｔａｔ ｓｉｎｇｌｅ—ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｓｃＦｖ）ｆｒｏｍ Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ（Ｉ＋Ｊ）ｐｈａｇｅ ａｔ￣ｔｉｂｏｄｙ ｌｉ—
抗呼吸道合胞病毒融合蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定
２ 结 果
２ ． １ 噬菌体单链抗体库的筛选 以纯化的 Ｒ Ｓ ＶＦ蛋白作为抗原对噬菌体抗体库进 行了 ５轮“ 吸附? 洗涤 ? 洗脱 ? 扩增” 的亲和富集和筛选， 测定每轮洗脱下来的噬菌体抗体滴度， 计算投入产出 比， 以估计富集效果（ 表１ ） 。从第 １轮到第 ５轮， 投入 产出比不断增加， 第 ５轮噬菌体收获率是第 １轮的 １ ０ ８ 倍， 说明特异性针对 Ｒ Ｓ ＶＦ蛋白的噬菌体抗体得到了 有效富集。
。但迄今为止， 对Ｒ Ｓ Ｖ的感
染仍然缺乏有效的特异性治疗方法， 且尚无安全、 有效 。噬菌体抗体库技术（ ｐ ｈ ａ ｇ ｅｄ ｉ ｓ ｐ ｌ ａ ｙ
［ ３ ］
ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙｌ ｉ ｂ ｒ ａ ｒ ｙｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｑ ｕ ｅ ｓ ） 是指利用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法扩增抗 体的全套可变区基因 ， 通过噬菌体表面展示技术， 把 扩增出的抗体 Ｆ ａ ｂ段或单链抗体（ ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅｃ ｈ ａ ｉ ｎｆ ｒ ａ ｇ ｍ ｅ ｎ ｔ ｖ ａ ｒ ｉ ａ ｂ ｌ ｅ ， ｓ ｃ Ｆ ｖ ） 表达在噬菌体表面上， 再通过“ 吸附 ? 洗 涤? 洗脱? 扩增” 过程筛选出与靶抗原相对应的特异性抗 体。研究以从 １ ０名健康成人外周血分离淋巴细胞构 建的人源性大容量噬菌体单链抗体库为基础， 利用纯 化的 Ｒ Ｓ Ｖ融合蛋白（ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ，Ｆ ） 筛选出特异性抗 Ｆ蛋白 ｓ ｃ Ｆ ｖ ， 并进行了初步鉴定， 为Ｒ Ｓ Ｖ感染的预防及 特异性治疗等进一步研究奠定了基础。
摘要 目的： 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗呼吸道合胞病毒 Ｆ蛋白的单链抗体。方法： 以Ｒ Ｓ ＶＦ蛋白为靶抗原， 通过“ 吸附? 洗涤? 洗脱? 扩增” 过程从天然人源性噬菌体抗体库中筛选特 异性抗 Ｆ蛋白单链抗体。５轮筛选后， 单克隆经 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检测， 阳性克隆进行核酸序列分析， 并将阳 ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｈ Ｂ ２ １ ５ １ ， 经Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱导， 制备抗 Ｒ Ｓ ＶＦ蛋白的可溶性单链抗体， 并进行 性克隆噬菌体感染 Ｅ Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂ ｌ ｏ ｔ 及Ｄ ｏ ｔ ｂ ｌ ｏ ｔ 分析。结果： 经过筛选， 获得了 １ ８株能与 Ｆ蛋白特异性结合的阳性克隆， 取Ｏ Ｄ值最高的克隆 Ｅ ４经测序并检索 Ｋ ａ ｂ ａ ｔ 数据库分析， 显示其基因与人免疫球蛋白可变区基 因具有高度同源性， Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂ ｌ ｏ ｔ 及Ｄ ｏ ｔ ｂ ｌ ｏ ｔ 分析表明为单链抗体。结论： 利用天然人源性噬菌体 抗体库技术制备出高特异性的人源性抗 Ｒ Ｓ ＶＦ蛋白单链抗体。 关键词 人呼吸道合胞病毒 Ｆ蛋白 噬菌体抗体库 单链抗体
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·论著·文章编号:1007-8738(2009)12-1146-03从噬菌体抗体库中筛选抗Cry1Ac 蛋白单链抗体王 耘1,2,刘 媛2,王 祥3,钱亚萍3,刘贤进23(1南京农业大学植保院,江苏南京210095;2江苏省农业科学院食品质量安全检测研究所,江苏南京210014;3扬州大学,江苏扬州225009)收稿日期:2009-02-19; 接受日期:2009-03-23基金项目:国家自然科学基金资助项目(30871658);国家高技术研究发展计划(863)资助项目(2006AA06Z411)作者简介:王 耘(1985-),女,江苏南京人,硕士生Tel:025*********;E 2mail:yuebaiheapp le@sina .com3Corres ponding author,E 2mail:jaasliu@jaas .ac .cnScreen i n g of an ti 2Cry1Ac scFv fro m Aphage d ispl ay an ti body li braryWAN G Yun1,2,L IU Yuan 2,WAN G X iang 3,Q IAN Ya 2ping 3,L IU X ian 2jin231College of Plant Pr otecti on,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095;2I nstitute of Food Quality Safety and Detecti on,J iangsu Acade my of Agricultural Sciences,Nanjing 210014;3Yangzhou University,Yangzhou 225009,China[Abstract] A I M :To c l o ne hum a n an ti 2C ry1Ac si ng l e 2cha i n an ti bo d i e s (scFv )fr om Tom li n so n J p hage an ti bo dy li b ra ry .M ETHOD S:A hum a n l a rge p ha ge a n ti bo dy li b ra ry w a s p anned fo r fo u r r o und s o f “adhe si o n 2e l u ti o n 2am p li fi ca 2ti o n ”.The sp e c i fi c ity o f the an ti gen b i nd i ng ac ti vity o f the se l ec te d c l o ne s w a s i den ti fi e d by EL I SA a nd the va ri ab l e gene s w e re ana l yze d and i den ti fi e d.RESUL TS:Afte r the p ann i ng,2po s iti ve c l o ne s w e re o b ta i ned,w h i ch co u l d b i nd C ry1Ac sp e c i fi ca ll y .DNA se quence a na l ysis show ed tha t the y had d i ffe ren t a n ti bo dy V reg i o n e nco d i ng gene s .CO N 2CL US I O N:B y 2p a s si ng i m m un i za ti o n,the sp ec i fi c hum an a n ti 2C ry1Ac scFv a lso can be p rep a re d by u s i ng p ha ge a n ti 2bo dy li b ra ry .[Keywords]p ha ge an ti bo dy li b ra ry;C ry1Ac;s i ng l e 2cha i n a n ti bo d i e s[摘要] 目的:从Tom lins on J 噬菌体抗体库中筛选人源化抗Cry1Ac 蛋白单链抗体(scFv )并进行鉴定。
方法:以Cry1Ac 蛋白为抗原包被固相,经4轮“吸附2洗脱2扩增”过程后,挑取单克隆,用E L I S A 法测定特异性结合活性,并对其进行基因序列测定。
结果:经过4轮筛选,获得了2株能与Cry1Ac 蛋白特异性结合的阳性克隆。
结论:利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Cry1Ac 蛋白scFv,为Cry1Ac 毒素蛋白检测提供了条件。
[关键词]噬菌体抗体库;Cry1Ac 蛋白;单链抗体[中图分类号]Q78 [文献标识码]A 苏云金芽孢杆菌(B acillus thuringiensis ,B t )是一种革兰氏阳性(G +)细菌,它在形成芽孢的同时能产生伴孢晶体,又称杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal p r oteins,I CPs ),其对鳞翅目、双翅目和鞘翅目等昆虫有杀伤活性。
伴胞晶体进入昆虫的消化道后,释放出的原毒素在蛋白酶的水解作用下,转型为毒性多肽分子,其与昆虫肠道上皮纹缘细胞表面的特异受体相互作用,诱导细胞膜产生一些孔道,扰乱细胞的渗透平衡,引起细胞肿胀甚至裂解而导致昆虫死亡[1]。
对苏云金芽孢杆菌毒素进行E L I S A 检测首先需要制备纯度较高的抗原和特异性高的抗体[2]。
目前检测Cry1Ac 蛋白的试剂盒中使用的多是多克隆或单克隆抗体(mAb ),王保民等利用Cry1Ac mAb 检测了转BT 基因棉的毒蛋白[3],而采用噬菌体展示技术筛选重组抗体则没有报道。
噬菌体抗体库技术将噬菌体表面表达的抗体片段的基因型与表型联系在一起,把抗原分子的结合特性同噬菌体的可扩增性统一起来,成为一种高效的筛选体系。
它从根本上改变了传统的mAb 制备流程,抗体完全可以绕过免疫系统和免疫步骤在体外制备,并且可以在体外改良抗体的特异性和进行体外亲和力成熟[4]。
本研究旨在探究利用B t HD 2171提取的B tCry1Ac 蛋白制备scFv 的方法,为研制灵敏、快速的B t 晶体蛋白检测试剂盒开辟一条新的制备路线。
1 材料和方法1.1 材料 天然噬菌体抗体库(英国Geneservice 有限公司),氨苄霉素,卡那霉素(Sig ma 公司),牛肉膏,蛋白胨,酵母粉均为生兴公司产品,辣根过氧化物酶标记的抗M13(GEHealthcare ),辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A 蛋白(博士德),大肠杆菌TG1,HB2151由本实验室保存,酶标板,I PTG,酶标仪。
1.2 方法1.2.1 Cry1Ac 抗原的制备 37℃、12h 活化菌种;按1%量接种于牛肉膏蛋白胨培养基中,30℃、230r/m in,培养30～40h (观察晶体裂解情况决定具体时间);4℃、8000r/m in 离心10m in,去上清收集菌体后用1mol/L 预冷NaCl 洗1或2次,再用用预冷的灭菌水洗1或2次;沉淀加入裂解液,调节pH值至9.5～10,同时以每升裂解液中加入30mL巯基乙醇的比例,0℃、100r/m in离心4h,12000r/m in离心20m in,取上清,加入4mol/L pH4.5Na Ac2HAc缓冲液,4℃静止过夜。
离心12000r/m in离心15m in,用预冷的无菌水洗2遍,在冰浴中摇至完全溶解,-20℃保存。
用胰蛋白酶水解毒素蛋白晶体(蛋白和胰蛋白酶质量比为40∶1),得到活性片段。
1.2.2 辅助噬菌体(hel per phage)K M13的扩增 将200μL 扩增培养至A值为0.4的大肠杆菌TG1与经过一系列稀释的K M13在37℃温育30m in,倒入上层琼脂后铺于TYE平板上,过夜。
挑一个噬菌斑与新鲜培养的TG1(A值为0.4),37℃摇床培养2h。
加入到200mL的2×TY2K(50mg/L Kana my2 cin),30℃过夜培养。
将过夜的培养液10800g离心15m in, 400mL的上清加入100mL PEG/NaCl(200mL/L聚乙二醇6000,2.5mol/L NaCl)并放置于冰上1h。
10800g离心30m in,倒掉PEG/NaCl。
用8mL P BS悬浮沉淀并加入PEG/ NaCl,混匀后置于冰上20m in。
3300g离心30m in,去掉PEG/NaCl。
最后用5mL P BS于11600g离心悬浮沉淀,即为扩增后的K M13。
1.2.3 特异性噬菌体的筛选 将4mL,100mg/L Cry1Ac包被细胞培养瓶的底部4℃过夜。
20mL/L M P BS(1L P BS中加入20g脱脂奶粉)封闭后加入噬菌体抗体库溶液,室温孵育2h;用含5mL/L T ween220的P BS溶液洗掉未结合的重组噬菌体(第1轮洗10次,第2轮洗20次,第3、4轮均洗30次),与Cry1Ac有结合活性的重组噬菌体则以Tryp sin2P BS (50μL,10g/L Tryp sin溶于450μL P BS)洗脱。
再次感染处于对数生长期的TG1细胞,取10μL稀释一定的梯度测定被洗脱出来噬菌体侵染的细菌个数cfu。
剩余的用2×YT2AG培养,经K M13超感染,2×YT2AKG培养,次日离心回收上清,沉淀,得到重组噬菌体抗体次级库并测定其滴度pfu(具体步骤同辅助噬菌体的扩增)。
再重复这一“吸附2洗脱2感染扩增”过程3次,得到富含对Cry1Ac有亲和性的重组噬菌体抗体四级库,并对每一轮筛选均测定次级库滴度并计算:产出率=产出克隆数(cfu)/投入克隆数(pfu),作为特异性噬菌体抗体富集的指标。
1.2.4 噬菌体E L I S A方法鉴定阳性重组噬菌体 将第4轮富集的重组噬菌体感染E.coli TG1细胞,37℃培养1h后涂在含TYE2AG的固体培养基上培养过夜,随机挑选300个单菌落,分别接种于200μL2×YT2AG培养基中,37℃培养至A600=0.5～0.8时,加入25μL2×YT2AG2hel per phage (109),37℃摇床250r/m in培养1h,1800g离心10m in,倒掉上清,用2×YT2AK悬浮,30℃培养过夜,次日,离心取上清做免疫学鉴定,即Monocl onal phage E L I S A:各取100μL加入到包被人工抗原的E L I S A板中反应1h,1g/L BS A和30g/L 脱脂奶粉作为阴性对照。