噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
噬菌体分离纯化的原理和步骤
噬菌体分离纯化的原理和步骤1. 噬菌体简介好啦，大家，今天我们来聊聊一个有趣又神奇的东西，叫做噬菌体。
听起来像是外星人发明的玩意儿，其实它是一种专门攻击细菌的病毒，简直是细菌界的“灭霸”。
它们在微观世界中偷偷摸摸地工作，悄无声息地解决那些惹人烦的细菌问题。
咱们身边的细菌可不少，有的对我们有益，但有的却是个十足的“败类”。
这时候，噬菌体就像是细菌的天敌，真是太酷了！2. 分离纯化的意义2.1 为何要分离纯化噬菌体？那么，为什么我们要把噬菌体分离和纯化呢？首先，想象一下，如果你在一个大杂烩中找一颗珍珠，那可是相当困难的。
所以我们得把这些小家伙从杂乱的环境中“捞”出来，单独让它们站到聚光灯下。
这样一来，我们就可以更好地研究它们，了解它们是怎么攻击细菌的，有助于开发新的治疗手段，像是抗生素的替代品。
2.2 纯化的重要性再者，纯化的过程就像是给噬菌体洗澡，洗去那些多余的脏东西，只留下最纯粹的样子。
这样才能确保我们研究的数据准确，不然的话，可能会被一些“干扰分子”搞得一团糟。
想想，如果你的咖啡里多了一勺盐，那可就毁了整杯了，不是吗？3. 分离纯化的步骤3.1 收集样本接下来，我们来说说具体步骤。
第一步，得收集样本。
你可以从土壤、水源，甚至是一些腐烂的食物中找到细菌和噬菌体。
这可不是随便捞的，咱得选那些“鱼塘”丰富的地方。
想象一下，像在一片荒野中寻找“金矿”，可是比喻中的“金矿”得小心翼翼，别让细菌给我们添乱。
3.2 培养细菌收集好样本后，我们要把这些细菌培养起来。
通常用一些培养基，就像细菌的“自助餐”。
让它们在温暖的环境中肆意生长，像是细菌的“欢乐派对”。
可是咱可不能忘了，噬菌体也会趁机来“捣乱”，所以这时得时刻盯着它们的动态。
3.3 噬菌体分离一旦细菌培养得差不多了，就可以进行分离了。
这里可以用过滤的方法，把细菌和噬菌体分开。
想象一下，像是在过筛子，把沙子和金子分开，真是一场“筛沙子”的大比拼。
然后把留下来的液体提取出来，这里就大功告成了，噬菌体终于登场了。
细菌的噬菌体分型
细菌的噬菌体分型实验二细菌的噬菌体分型第一部分肠杆菌科噬菌体的分离、纯化与增殖噬菌体广泛存在于自然界。
凡是有细菌存在的地方，一般都能找到相应的噬菌体。
例如，土壤、肥料、腐烂有机物、粪便和阴沟污水等常是各种细菌的栖息地，从中能分离到相应的噬菌体。
从自然界分离某一噬菌体需要经过以下步骤:培养宿主菌(或叫做敏感菌);采集含噬菌体的样品;噬菌体富集培养;制备噬菌体裂解液;验证噬菌体的存在;噬菌体的纯化;噬菌体的增殖;噬菌体的效价测定和保存。
下面以大肠杆菌噬菌体为例详细介绍噬菌体的分离和纯化方法。
1( 噬菌体的分离(1)制备菌悬液:取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
(2)增殖培养:于10ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶(1支5ml吸管)中，加入污水样品20ml(1支5ml吸管)与大肠杆菌悬液0.2ml(1支1ml吸管)，37?培养12h,24h以增殖噬菌体。
(3)制备裂解液:将以上增殖的混合培养液2500r/min离心15 min(1支5ml吸管)。
将上清液倒入无菌平皿，针管抽取液体，在针栓式滤器上过滤除菌。
所得滤液倒入灭菌瓶内，取少量滤液作无菌试验，即将它接入牛肉膏蛋白胨培养液中(1支5ml吸管、1支1ml吸管、1支无菌带帽华氏管)，置于37?培养过夜，以作无菌检查。
(4)噬菌体确证试验:滤液经37?培养过夜，若无细菌生长则表明已经彻底除菌。
需进一步证明噬菌体的存在。
于已烘干的肉膏蛋白胨琼脂平板(平皿1个)表面加一滴大肠杆菌悬液(1支1ml吸管)，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。
放置数分钟，待琼脂表面干燥，在菌层的表面布点5个,7个，每点滴加上述滤液1小滴(1ml枪1把和枪头10个)，同时选择其中一点不加滤液只滴加一小滴生理盐水为对照，再放置数分钟，使液滴被琼脂吸干。
倒置平板，37?培养过夜。
次日观察结果，若平板上滴加滤液的部位出现噬菌斑，而在对照滴中处无噬菌斑，则表明该滤液中肯定含有大肠杆菌相应噬菌体。
噬菌体作为载体的使用流程
噬菌体作为载体的使用流程1. 简介噬菌体是一种可以感染细菌的病毒，它可以被利用作为生物学研究和生物工程领域的载体。
在使用噬菌体作为载体时，有一系列的流程需要遵循以确保实验的成功进行。
本文将介绍噬菌体作为载体的使用流程。
2. 噬菌体的培养和扩增在使用噬菌体作为载体之前，首先需要培养和扩增噬菌体。
以下是噬菌体的培养和扩增流程：•准备培养基：根据实验需求，选择适合噬菌体生长的培养基，并准备好所需的培养基。
•制备噬菌体接种物：选择适当的宿主细菌，如大肠杆菌等，并将其在培养基中进行培养，直至细菌达到适当的生长状态。
•加入噬菌体：将培养好的噬菌体加入到宿主细菌培养物中，使其与细菌发生感染。
•培养噬菌体：将噬菌体和宿主细菌混合物在恰当的条件下进行培养，如温度、pH等。
•扩增噬菌体：通过适当的培养时间和培养条件，使噬菌体扩增至所需的数量。
3. 分离和纯化噬菌体在培养和扩增噬菌体后，需要对其进行分离和纯化，以获得纯净的噬菌体溶液。
以下是噬菌体的分离和纯化流程：•离心分离：将培养物进行离心，以分离噬菌体颗粒和残留的细菌细胞。
•滤过分离：通过使用合适的孔径滤膜，将噬菌体溶液进行滤过分离，去除杂质。
•超速离心：利用超速离心技术进一步分离噬菌体颗粒和溶液中的其他组分。
•超滤：通过使用适当的分子量切割膜，将噬菌体颗粒从溶液中分离出来。
•冻干与储存：将纯化的噬菌体溶液进行冻干处理，并储存于适当的条件下。
4. DNA插入纯化的噬菌体作为载体可以用于DNA插入。
以下是噬菌体的DNA插入流程：•DNA准备：从源中提取目标DNA，并进行适当的处理，如限制性酶切。
•DNA连接：将目标DNA与噬菌体载体DNA进行连接，通过适当的连接酶进行连接。
•转化：将连接好的DNA转化到适当的宿主细菌中，使其得到插入噬菌体的DNA。
•选择与筛选：通过选择性培养基或筛选方法，选出携带目标DNA的宿主细菌。
5. 噬菌体的扩增和提取将DNA插入噬菌体后，需要对其进行扩增和提取，以获得足够的目标DNA量。
大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化优化版SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#噬菌体的分离与纯化实验用具及材料1.菌种：大肠杆菌2.试剂：氯仿3.培养基：1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等实验步骤1.噬菌体的分离（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。
/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。
待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。
如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。
噬菌体的分离与纯化
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
噬菌体的分离
按前面方法制备噬菌体裂解液
6.计数（效价测定） 计数（效价测定） 计数 在平板中倒入50℃下层培养基10-15mL,冷凝 用0.9mL无菌肉汤将噬菌体裂解液做10倍系列稀释 在4mL 48℃上层培养基中加入0.1mL噬菌体稀释液和菌液 0.9mL，用双手前后搓动 使混匀，立即倒入下层平板上 将平板倒置于37℃培养12-16h,统计噬菌斑数目
37℃，24h
3.制备噬菌体裂解液 制备噬菌体裂解液
方法1：离心法： 离心3000转/分，15min. 氯仿（0.5mL/10mL上清液） 振荡5min 离心3000转/分，15min.
增值混合液
方法2：过滤法：P142
离心4000转/分，15min.
上清液
离心4000转/分，15min.
0.22µm无菌过滤器过滤
大肠杆菌噬菌体分离 枯草芽孢杆菌噬菌体分离
大肠杆菌斜面 4mL无菌水
枯草芽孢杆菌斜面 4mL无菌水
大肠杆菌菌悬液
枯草芽孢杆菌菌悬液
2.增殖噬菌体 增殖噬菌体 污水200mL 大肠杆菌菌悬液2mL 感染噬菌体发酵液200mL 枯草芽孢杆菌菌悬液2mL
3倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基100mL
增值混合液
计算噬菌体效价 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数×10 噬菌体效价 数 稀释倍数×
报告要求 1、P143：1.结果 2、 P143：思考题（2）、（3）、（4）、 （5）、（6） 3. P145：1.结果 4.P145：2.思考题 （1）、（2）（3）、（4）
步 祝 你 进
三、技术路线
配制3倍料培养基、 配制 倍料培养基、制备菌悬液 倍料培养基 无菌试验
制备噬菌体裂解液 检验噬菌体 纯化 增值
双层平板法
噬菌体的分离与纯化(整理优化版)
噬菌体的分离与纯化实验用具及材料1.菌种：大肠杆菌2.试剂：氯仿3.培养基：1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g，NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏 0.9g，NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等实验步骤1.噬菌体的分离（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。
/取大肠杆菌斜面一支，加4ml 无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL 3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。
待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。
如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。
2.噬菌体的纯化（1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀；（2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培养12~24h；（3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。
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噬菌体的分离与纯化优化版SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#噬菌体的分离与纯化实验用具及材料1.菌种：大肠杆菌2.试剂：氯仿3.培养基：1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等实验步骤1.噬菌体的分离（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。
/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。
待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。
如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。
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噬菌体的分离与纯化实验用具及材料
1.菌种：大肠杆菌
2.试剂：氯仿
3.培养基：
1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，
NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；
2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，
NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭
菌；
3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入
1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；
4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入
0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌
4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌
过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴
锅，离心机等
实验步骤
1.噬菌体的分离
（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置
37℃培养过夜。
/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下
菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混
合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一
无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯
仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养
基表面上。
待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，
置37℃培养过夜。
如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明
或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。
2.噬菌体的纯化
（1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀；
（2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的
混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培
养12~24h；
（3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。
此过程制备的裂解液中往往
有多种噬菌体，需进一步纯化；
（4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培
养，直至试管中菌悬液由浑浊变清；培养物经离心后取上清
液，再重复步骤⑵、⑶直到出现的噬菌斑形态一致为止
注意事项
1.使用仪器要保证是灭菌的；
2.注意琼脂的浓度；
3.氯仿是易燃品，应远离火焰
一、生物测定法
1、双层琼脂平板法
1）倒下层琼脂
融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
2）倒上层琼脂
融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入大肠杆菌菌液0.2mL，上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。
3）恒温培养
30℃恒温培养6～12h观察结果。
4）观察结果
如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──噬菌斑。
2、单层琼脂平板法
省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入大肠杆菌和噬菌体增殖液，混合后迅速倒平板。
30℃恒温培养6～16h后观察结果。
噬菌体效价的测定
1、倒平板
将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。
2、稀释噬菌体
按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有
4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。
噬菌体与菌液混合
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。
分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
接种上层平板
将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基
5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立
即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。
水平静置，凝固后置37℃培养。
观察并计数
观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30～300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价。
❖计算公式：N=Y/V×X
（Ｎ：效价值，Ｙ：平均噬菌斑数／皿，Ｖ：取样量，Ｘ：稀释度）
例如：当稀释度为10-6时，取样量为0.1mL/皿，同一稀释度中３个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：Ｎ＝186
／0.1×10-6＝1.86×109。
结果
1、噬菌体检查
2）绘出平板上的噬菌斑检测结果，指出噬菌斑和宿主细菌。
2、噬菌体效价测定
1）平板上噬菌斑数目
噬菌体稀释度10-410-510-6对照
噬菌斑数（个）/皿
平均每皿噬菌斑数目
2）计算噬菌体效价(即噬菌斑形成单位pfu,plague-formingunit).。