荧光光谱
荧光光谱分析
百泰派克生物科技
荧光光谱分析
荧光光谱法（又称荧光分析法或分光荧光测定）是一种电磁光谱法，可以测量样品吸收光子后发出的光子强度。
实际上，大多数荧光分子是芳香族的，如蛋白质/肽中的色氨酸。
光学技术，如UV-Vis、圆二色谱（CD）、傅立叶变换红外（FTIR）和荧光光谱，都被用于获取被测化合物的结构、相互作用和动力学信息。
荧光光谱是研究溶液状态和显微镜下蛋白质/肽的实时结构和动力学的重要研究工具。
荧光光谱分析。
生物制药，特别是蛋白质和多肽类药物，在整个研发过程中都面临着独特的挑战。
在成功批准和上市之前，需要对治疗性蛋白质/肽的生物物理、生化特性和3D结构有透彻的了解，因为产品的活性、稳定性、毒性、功效和保质期会因结构-活性关系而受到影响。
与小分子不同，这些大分子需要多种分析方法结合进行分析。
荧光光谱法可应用于：1，通过改变荧光强度来探测结构变化或两个分子的结合；2，通过色氨酸荧光的波长定位色氨酸残基（在蛋白质表面或深埋在蛋白质内部）；3，通过荧光偏振和各向异性研究荧光团迁移率。
荧光发光光谱
荧光发光光谱荧光光谱（也称为荧光测定法或荧光分光光度计）是一种分析样品荧光的电磁光谱学。
它涉及使用一束光，通常是紫外线，激发某些化合物分子中的电子并使它们发光；通常但不一定是可见光。
一种补充技术是吸收光谱。
在单分子荧光光谱的特殊情况下，发射光的强度波动是从单个荧光团或荧光团对测量的。
测量荧光的设备称为荧光计。
分子具有称为能级的各种状态。
荧光光谱主要关注电子和振动状态。
通常，被检查的物质具有感兴趣的基电子态（低能态）和较高能的激发电子态。
在这些电子状态中的每一个中，都有各种振动状态。
在荧光中，物质首先通过吸收光子从其基态电子状态激发到处于激发电子状态的各种振动状态之一。
与其他分子的碰撞导致激发分子失去振动能量，直到它从激发电子态达到最低振动状态。
然后分子再次下降到基电子态的各种振动水平之一，在此过程中发射光子。
由于分子可能会下降到基态的几个振动能级中的任何一个，因此发射的光子将具有不同的能量，从而具有不同的频率。
因此，通过分析荧光光谱中发出的不同频率的光，以及它们的相对强度，可以确定不同振动能级的结构。
对于原子种类，过程是相似的；然而，由于原子种类没有振动能级，因此发射的光子通常与入射辐射处于相同的波长。
这种重新发射吸收的光子的过程是共振荧光，虽然它是原子荧光的特征，但也可以在分子荧光中看到。
在典型的荧光（发射）测量中，激发波长是固定的，而检测波长是变化的，而在荧光激发测量中，检测波长是固定的，而激发波长在感兴趣的区域中是变化的。
发射图是通过记录一系列激发波长产生的发射光谱并将它们组合在一起来测量的。
这是一个三维表面数据集：作为激发和发射波长函数的发射强度，通常描绘为等高线图。
荧光光谱的原理与应用
荧光光谱的原理与应用一、简介荧光光谱是一种非常重要的光谱技术，用于研究物质的光谱特性。
和吸收光谱相比，荧光光谱具有很多优点，包括高灵敏度、高选择性和动态特性等。
本文将介绍荧光光谱的原理和应用。
二、荧光光谱的基本原理荧光光谱是物质在受激发后发射荧光的光谱。
荧光的产生涉及两个过程：激发和发射。
具体来说，当物质受到足够能量的激发后，其内部的电子会升级到激发态，并在短时间内返回到基态，释放出荧光。
这个过程伴随着光的吸收和发射。
荧光光谱图通常由激发光和发射光组成。
激发光是用于激发物质的光，而发射光是物质在激发后发射的荧光。
通过测量激发光和发射光的强度和波长，可以得到荧光光谱。
三、荧光光谱的应用1. 荧光光谱在生物学中的应用荧光光谱在生物学中有广泛的应用。
例如，它可以用来研究生物分子的结构和函数。
荧光标记是研究生物分子的常用方法之一，该方法利用荧光染料或荧光蛋白标记生物分子，通过测量荧光光谱来研究它们的相互作用、分子结构以及代谢路径等。
2. 荧光光谱在材料科学中的应用荧光光谱在材料科学中也有很多应用。
例如，它可以用于研究材料的光电特性。
通过测量材料激发和发射的荧光光谱，可以了解材料的能带结构、载流子动力学等信息，对材料的性能进行评估和优化。
3. 荧光光谱在环境监测中的应用荧光光谱在环境监测中也起到重要作用。
例如，它可以用于水质监测。
通过测量水样中的荧光光谱，可以判断水质的污染程度和有机物的种类。
同时，荧光光谱还可以用于检测空气中的有害气体，如VOCs、NOx等。
4. 荧光光谱在食品安全中的应用荧光光谱在食品安全领域也有广泛应用。
例如，它可以用于检测食品中的有害物质和污染物。
通过测量食品样品的荧光光谱，可以判断食品是否受到了污染，确保食品的安全性。
5. 荧光光谱在医学诊断中的应用荧光光谱在医学诊断中也有很多应用。
例如，它可以用于癌症的早期诊断。
通过测量病变组织或体液中的荧光光谱，可以鉴别正常组织和癌变组织之间的差异，帮助早期发现癌症。
荧光光谱的原理和应用
荧光光谱的原理和应用1. 荧光光谱的基本概念•荧光：荧光是指物质受到激发后，在短时间内吸收能量并发出较长波长的光。
•荧光光谱：荧光光谱是指在特定激发光源照射下，物质发出的荧光光在不同波长下的强度分布。
•荧光发射：当物质受到激发并返回基态时，通过辐射发出光的过程称为荧光发射。
2. 荧光光谱的原理2.1 荧光激发和发射•荧光激发：物质受到外界能量的激发，电子从基态上升到激发态。
•荧光发射：激发态电子回到基态的过程中，通过辐射发出光。
2.2 荧光激发与发射能级•电子能级：物质中的电子具有不同能量的电子能级。
•激发态：电子从基态跃迁到更高能级的状态称为激发态。
•发射态：电子从激发态回到基态的状态称为发射态。
2.3 荧光与分子结构•分子结构：不同分子结构对荧光发射的波长和强度有影响。
•良好的激发能量传递：分子结构中共轭体系的存在有助于良好的激发能量传递。
3. 荧光光谱的应用3.1 荧光光谱分析•分析特性：荧光光谱可以提供物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
•应用领域：荧光光谱分析广泛应用于环境监测、生物医学、食品安全等领域。
3.2 荧光探针和标记物•荧光探针：利用荧光探针可以对生物分子进行检测和定量分析。
•标记物应用：荧光标记物在生物学领域中的应用非常广泛，例如细胞成像、蛋白质定位研究等。
3.3 荧光荧光显微镜•荧光显微镜：利用荧光显微镜可以观察和研究生物样本中的荧光信号，无需对样本进行染色处理。
•应用领域：荧光显微镜被广泛应用于生物学、医学和材料科学领域。
3.4 荧光染料•荧光染料：具有良好荧光性能的化合物，可以用于荧光显微镜观察、荧光分析和药物研究等方面。
•应用领域：荧光染料广泛应用于细胞成像、分子探针、生物传感器等领域。
4. 总结荧光光谱是一种重要的光谱学技术，在科学研究和应用中具有广泛的应用前景。
通过荧光光谱可以获得物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
荧光光谱在环境监测、生物医学、食品安全等领域发挥着重要作用。
荧光光谱
OH H2C O HO O H2C OH HO OH O HO C H2 O OH OH OH O HO O HO CH2 O HO O CH2 HO OH O O OH HO O HO O HO H2C OH
OH
O
CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2
HO
OCH2CH2(OCH2CH2)n OH
β－CD∶OP 加合物的组成
用摩尔比法测定了βCD∶OP 二元体系的组 成. 由图4 可以看出, β - CD 与OP 的摩尔比为1∶1 , 说明在溶液中形成了 1∶1 的二元加合物,
加合物形成的机理及其结构
OP 疏水性烷基链的长 度、径度和体积分别为 1.036 nm、0.400 nm和 0.216 nm3 。 β- CD 空腔的深度 (0.780 nm) 、空腔口直 径(0.780 nm) 和体积 (0.346nm3 ) 相比, OP 的 疏水性烷基链中至多有 6 个碳被包络在空腔内, 其余未被包络部分和极 性头基位于空腔外
H2C
H2C
CH3 N
NpMA
PyMA
DMAA AMPS NpMA PyMA
AIBN DMF
乙醚
乙醇多次洗涤干燥
萘和芘标记聚电解质在水溶液中的紫外光谱和荧光光谱
在水溶液中的紫外吸收 光谱与小分子萘和芘的 光谱基本相同, 说明萘 和芘标记到聚电解质上 并没有对它们的光谱结 构产生明显影响, 而且 混合溶液表现出两者光 谱的迭加. 290 nm 处萘有一吸收带, 而芘的吸收很弱, 所以 在混合溶液中可用290 nm 激发萘; 343 nm 处仅 有芘的吸收, 因此可用 343 nm 选择性地激发芘.
330 nm 为中心的发射带 是萘的荧光, 360～ 440 nm 是单体态芘的发射光 谱, 480 nm 是芘激基缔 合物的发射光谱.
pl光谱和荧光光谱
PL光谱（Photoluminescence Spectroscopy）和荧光光谱（Fluorescence Spectroscopy）在某些情况下可以互换使用，但严格来说它们之间有一些区别。
荧光光谱：
荧光光谱通常是指材料吸收了特定波长的光子后，电子从低能级跃迁到高能级，在返回低能级时释放出比入射光更长波长的光的过程。
这种现象是由于物质内部能量状态的变化引起的，并且需要一个外部光源来激发。
荧光光谱仪用于测量激发光谱、发射光谱、峰位、峰强度等信息，这些信息可以帮助了解分子或晶体结构以及其动力学性质。
PL光谱：
PL光谱则是指“光致发光”（Photoluminescence），它也是通过照射待测物体产生激发态粒子，然后激发态粒子自发地回到基态并释放出光子的过程。
然而，术语PL光谱常常特指半导体材料中的这一过程，特别是在研究半导体中缺陷和载流子行为的时候。
在实践中，两者之间的主要区别在于应用领域和技术细节。
荧光光谱更多地应用于生物医学、化学等领域，而PL光谱则常用于物理学和材料科学，特别是对于半导体的研究。
然而，这两者的基本物理原理是一样的：都是基于受激辐射导致的发光现象。
荧光光谱
0.46
0.60
λexmax(nm) 205 286
365
390
λ max em
(nm)
278
321
400
480
3. 刚性平面结构 荧光物质的刚性和平面
性增加，有利于荧光发射。
芴
F=1
戊省 0.52 580 640
联苯
F=0.2
-O
O
O
荧光黄
C
COO产生荧光
F=0.92
-O
O
酚酞
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱC COO不产生荧光
到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。
C. 激发光谱与发射 IF4800 固定em=620nm(MAX) 固定ex=290nm (MAX)
光谱的镜像关系
4400 4000
1→ 4
1→1
4 3
3600
S1
3200
1→ 3
1→2
2 1
2800
1→ 2
2400
1→4
2000
1600
1200 800
1→4
400
1→1
0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
4 3 2 1
S0 ex =290nm (MAX)
em= 620nm(MAX)
D.磷光光谱
与发射光谱相同条件下的磷光光谱
IF4800
4400 4000
488
τ p(s)
2.6
2.5
1.4
0.23 0.014 0.0023
含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。
荧光光谱名词解释
荧光光谱名词解释
以下是几个与荧光光谱相关的常见名词的解释：
1. 荧光：荧光是指物质吸收光能后，在经历激发态到基态跃迁过程中发出的光辐射。
这种光辐射通常具有较长的波长，可见光范围内的颜色。
2. 激发：激发是指将物质从基态转移到激发态，使其能级上升，通常是通过吸收光能或其他能量来实现。
激发是产生荧光的前提条件。
3. 激发光源：激发光源是用于激发荧光的光源。
常见的激发光源包括紫外线灯、激光器和白炽灯等。
激发光源的选择通常取决于所研究的物质的特性和所需的激发波长。
4. 荧光发射：荧光发射是指物质在激发后返回基态时所发出的光辐射。
荧光发射的波长范围通常比激发光波长长，且具有特定的荧光峰。
5. 荧光光谱：荧光光谱是通过测量荧光发射强度随波长的变化而得到的图谱。
荧光光谱可以提供有关物质荧光性质的信
息，如发射波长、发射强度和荧光峰的位置等。
6. 荧光光谱峰：荧光光谱峰指荧光发射谱中最强的发射峰。
荧光光谱峰的位置和强度可以提供关于物质结构和荧光特性的重要信息。
7. 荧光量子产率：荧光量子产率是指物质发生荧光的效率，即荧光发射光子数与吸收光子数之比。
荧光量子产率越高，表示物质更有效地发出荧光。
以上是一些与荧光光谱相关的名词解释。
荧光光谱是研究物质荧光性质和特征的重要工具，广泛应用于生物化学、材料科学、分析化学等领域。
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能量转移与供体的发射谱和受体的吸收谱的重叠、量子 产率、距离、相对取向相关。
（2）.能量转移的物理机制
（1）碰撞猝灭分析
Lackowicz “Principle of fluorescent spectroscopy”Chapt 8, p237-p265
碰撞猝灭的Stern-Volmer 方程
F0 / F =1+kqτ0 [Q]＝1＋KD[Q] 其中kq是猝灭速率 τ0 是无猝灭剂存在时的荧光寿命 [Q]是猝灭剂的浓度
激发态的供体能量被受体吸收，荧光强度下降。
能量转移可能以两种方式：辐射和非辐射。 共振转移的机制：
偶极子相互作用通过非辐射进行能量转移 （<10nm)。
荧光能量转移的先决条件： 1)供体和受体有一定谱重叠（共振能量转移）。 2)供体和受体距离比较近（正比于R6)。 3）供体和受体跃迁偶极距的方向不能垂直
F F0et /
公式中的τ即为荧光寿命
荧光寿命和量子产率示意图
Q
k nr 1
k nr
Q为量子产率，为荧光发射速率，knr为
非辐射转移速率,τn为荧光自然寿命.通常
量子效率和波长相关，但生化的荧光通常 和波长无关。
n 1/
（ 2). 荧光各向异性
荧光偏振： 荧光偏振（参数）： p=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +F⊥) 荧光各向异性: γ=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +2F⊥) p和同时描述荧光偏振。
•荧光猝灭，荧光能量共振转移都可以影响荧光的寿命， 因此用时间分辨谱进行研究。
5. 荧光标记
有些物质不发荧光，而且生化分子中如氨基酸中只有少数残基发 荧光，成为内源荧光。
如染料与与研究对象结合，作为探针应用荧光方法与蛋白质结合 后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区大小、粘性、分 子间距离等。
加入染料不应影响大分子的结构 加入染料不应影响大分子的功能 标在不同位置，效果不同。 标记方法： 1）有转基因标记： 单点转基因标记: 把某个氨基酸改变成Trp,或者转变成Cys再与荧
光探针结合。 荧光蛋白：在蛋白中插入含发色团的荧光蛋白，GFP, YFP, 1）绿
色荧光蛋白（GFP,green fluorescent protein）BFP
2）量子点荧光标记
量子点：Quantum Dot
•量子点又可称为半导体纳米微晶体。目前研究较多的 主要是硫化镉、硒化镉和碲化镉（CdS、CdSe 和 CdTe） 。
时间分辨荧光光谱： 荧光各向异性： 荧光量子点标记，转基因荧光标记 双光子荧光光谱
2.常用荧光光谱
荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。 通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。 1）荧光的激发光谱，发射谱
激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发
射的荧光强度与激发光波长的关系曲线 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多
（2）时间分辨寿命
•所得到的是平均结果。一般来讲，样品不会是完全均 匀分布也不是高度有序。
•利用瞬态测量寿命时，式中的时间寿命是基于只有一 个衰减时间的假设。但如果有多组分，则需要取平均 寿命。
•另外采用有供体和受体时的荧光强度，用的是积分强 度。
•在固体样品中，可以克服样品在溶剂中旋转扩散的影 响。
（1）各向异性的时间相关特性
一般情况下，要用水合体积进行计算旋转相关时间。 如果是球形的样品，将会有单一衰减指数；
大多数情况将会有多个衰减指数。 原因主要是样品为非球形蛋白质或样品中有不同 运动状况的荧光发色团。衰减时间与沿各分子轴的 旋转相关。 如果样品内部某些片断是柔性的，衰减时间也会 改变。因此荧光各向异性可用于研究蛋白的内部动 力学。 能量转移也会影响各向异性衰减。 在膜蛋白的研究中，通过各向异性衰减也有很多 信息。
e)系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 如 电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
f）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振
动弛豫的时间10 -12 s。
2）荧光的应用
荧光发光分为内源荧光和外源荧光。 外源荧光应用很广，如染料结合作为荧光探针与蛋
白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区 大小、粘性、分子间距离等。 荧光寿命和量子产率： 荧光猝灭： 荧光能量共振转移：
l3
l1
l 2 l 2
a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10-15s。此时， 荧光分子处于激发态。
b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射 跃迁过渡到低的能级。
c)外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的 作用，以及能量转移，过渡到低的能级
d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子 激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命 约为10ns左右。
（2）.荧光偏振的定量描述
设发射振子和Z轴夹角为 Y为荧光检测方向
Z θ
X
φ
F∥
F⊥ Y
p=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +F⊥)
cos2 cos2 sin2 p
cos2 cos2 sin2
cos2 cos2 d 1 d 2
(3cos2 1) / 2 p
(1 cos2 ) / 2
满足上述条件即为荧光。因此荧光范围比较宽， 从X射线到红外光谱区仍然是荧光。
其他的能量如（化学反应、加热、生物代谢等） 也会有荧光。生活中很多现象都与荧光相关。如： 钞票防伪，日光灯管，萤火虫发光。
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
F0/F～[Q]曲线。单一线性猝灭曲线预示所有发色团 和猝灭剂是具有相同的可接近性。如果其中有一种不可接 近，则Stern-Volmer曲线不是线性的。
（2)静态猝灭
荧光发色团和猝灭剂形成不发荧光的复合物，吸收光以
后，以无辐射跃迁的形式回到基态。
解离常数为：
[FQ] Ks [F ][Q]
F0 [F ] [FQ]
荧光各向异性可以采用稳态测量，也可以用瞬态方 法进行测量。稳态测量是得到的是一个平均值，虽然 容易解释，但需要做很多假设。
瞬态测量是测量脉冲激发后的时间相关各向异性。 可以直接从实验数据中观察得到并进行解释。
各向异性与样品尺寸、形状以及标记分子的柔性 相关，需要从各种分子模型进行计算拟合。 各向异性衰减可以从TD或FD方法得到。 目前还是采用时间分辨进行测量。
第3讲 荧光光谱
1. 荧光是怎么产生的？有什么用途？ 2. 常用荧光光谱有哪些？荧光光谱有哪些特征？ 3. 荧光强度和物质浓度是什么样的关系?还有哪
些因素会影响到荧光强度？ 4. 荧光光谱的有哪些光谱参数？ 5. 有哪些实验方法？各种荧光测量方法有什么
用途？
1.荧光介绍
1）荧光产生及其物理机制
荧光：某些物质受到照射后发出能量较低的光，一 旦光照停止，光线也立即消失，称为荧光。入射光 和发射光频率之差称为斯托克频移。
3 .荧光光谱仪及使用 技术
1）荧光光谱仪
光源
激发单色器
样品池
检测器
发射单色器
检测器
荧光是散射谱，所以一般在垂直入射方向接收。背 景是没有入射光，是“暗背景”，因此灵敏度更高。
2）荧光强度和溶液浓度的关系
I0
薄层吸收的光强为：
dF
dI I0[ekcx ekc(xdx) ] I0kcekcxdx
11
2/3
p 3 (3cos2 1) / 2
3）.荧光能量共振转移
（1）能量转移：
Fluorescent resonance energy transfer（FRET)
术语：Förster resonance energy transfer
纪念德国科学家 Theodor Förster Theodor FÖrster 简介
溶液发出的荧光光强正比于吸收光强。
F A dI AI0 kcekcxdx AkI0[1 ekcl ]
如果kcl<<1，进行展开，有
ekcl 1 kcl (kcl)2 (kcl)3 • • • 1 kcl
2!
3!
样品池长度通常为1cm，因此荧光强度为
F ' K 'I0c
荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。 原因可能是： a 浓度增加，分子碰撞机会增加，增加了非辐射损耗。 b 溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（内滤光） c 吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（自吸收） d 仪器原因
Ks
[F0 ] [F ] [F ][Q]
F0 F
1
K s [Q]
与动力学猝灭的形式相仿，然而荧光寿命并没有发生改
变。静态猝灭也是和猝灭剂呈线性关系，因此需要通过改变温
度或测量荧光寿命来区分。kq～T/η（因为和扩散系数相关）
另外可以通过测量吸收谱的方法确定。
2）荧光偏振 （1）荧光偏振现象及用途
一旦用偏振光照射，从许多样品出射的光也是偏 振的。当样品各个方向出射的偏振光是不相同的， 可以说样品显示出偏振的特性。 研究偏振可以提供分子及周围环境更多的信息： 偏振光照射到荧光分子上，分子对光的吸收和发射 过程与分子框架相对偏振光的偏振方向相关。 荧光偏振可以用来测量蛋白质的变形，蛋白质的结合 以及蛋白质的内部动力学。 与膜结合的荧光发色团用来估计膜的内部粘性以及居 于相变温度之上的磷脂复合物的特性。