实验五逆境对植物组织的伤害
实验五逆境对植物组织的伤害
—电导率法检测植物细胞质膜透性和愈创木酚法测定过氧化物酶活性
一、实验目的：1.了解研究植物抗逆生理的实验方法，学会使用DDS-11A型电导率仪，掌握绝对电导率和相对电导率的概念；2.熟悉植物组织过氧化物酶活性的测定方法，学会分光光度计的“动力学”测量程序
二、实验原理：（P78和P97）
三、实验材料：绿豆幼苗
四、实验步骤：
1.材料处理：10株幼苗为一组分别置于45℃（纯水最好预热至该温度）和室温中（在上课之前请先处理好材料，以课堂小组为单位）。
2.电导率的测定：2h后小心取出幼苗，冷却至室温后测定浸出液和纯水的电导率。
（不必测材料煮沸后的电导率）
3.过氧化物酶（POD）活性测定P97
3.1POD的提取：材料1g，加入KH2PO4冰浴研磨成匀浆，低温4000rpm离心15min,收集上清液，定容至25mL,低温保存
3.2POD的测定：先在分光光度计的“动力学”或“时间扫描”程序上设置好参数取比色杯2个，1个将对照液放入参比杯按照程序调零，另一个比色杯拉出加入20μL酶液，再加入1mL KH2PO4 ，最后加入3mL反应混合液，立即测量。
❖723G型分光光度计“动力学”测定
❖【3
按“
按“
按“ENT”后，出现：
测量出图谱后，按“ESC”返回到界面:
按“3”进入活性测量功能，出现如下界面：
按“SET”进行具体设置，按“ENT”可得出相应值。
按“4”进入图谱处理功能，出现如下界面：
其中按“1”可见原始图谱，按“2”可进行峰谷检测，按“3”通过横纵坐标的缩
放可达到图谱缩放功能，方便观察图谱。
按“4”具有具体的实验查询功能。
思考题
1.电导率的测定主要有哪些影响因素?
2.相对电导率和绝对电导率的概念?
3.请说出电导率和电导度的概念区别。
4.温度和CO2会影响电导度的测定结果吗？在操作中应注意什么？
5.影响酶提取、纯化和活性测定的因素有哪些？
6.测定时酶活性的测定应当定在什么时间范围内？测定植物组织过氧化物酶活性的意义与用途。
7.请分析比较两种处理下绿豆幼苗的膜透性及过氧化物酶活性。
最新植物生理指标测定方法
实验一植物叶绿素含量的测定（分光光度法）(张宪政，1992)一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率的大小，比值高则大，则反之。
二、材料、仪器设备及试剂试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）三、实验步骤称取剪碎的新鲜样品0.2～0.3g，加乙醇10ml，提取直至无绿色为止。
把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。
四、实验结果按计算丙酮法（Arnon法）【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的计算】叶绿素a的含量（mg/g）=（12.71⨯OD663 – 2.59⨯OD645）V/1000*W叶绿素b的含量（mg/g）=(22.88OD645 – 4.67OD663) V/1000*W 叶绿素a、b的总含量（mg/g）=(8.04⨯OD663 +20.29⨯OD645) V/1000*W 按Inskeep公式叶绿素a的含量（mg/g）=（12.63⨯OD663 – 2.52⨯OD645）V/1000*W叶绿素b的含量（mg/g）=(20.47OD645 – 4.73OD663) V/1000*W叶绿素a、b的总含量（mg/g）=(7.90⨯OD663 + 17.95⨯OD645) V/1000*W注：1、叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用率【1】比如阳生植物叶绿素a和叶绿素b的比值较大【2】阴生植物叶绿素a和叶绿素b的比值较小2、丙酮-------熔点:-94℃；沸点:56.48℃；是一种无色透明液体，有特殊的辛辣气味易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有机溶剂.下一步实验方法比较【1】95%乙醇直接提取（√）【2】95%乙醇加热提取（冯瑞云，1985）【3】无水酒精和80%丙酮等体积混合提取实验二、不良环境对植物细胞膜的伤害（(张宪政，1992)）一、原理植物组织在受到各种不利的环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。
逆境胁迫对植物生理生化指标的影响
从实验数据的计算结果对比能够知道Pro、MDA、 的积累在干旱条件下均比正常条件下的高，即逆境胁迫对植物影响上述几项生理生化指标的增加。
1.结合旱生植物的抗旱机制，抗旱植物应具有下列特征：
（1）发达的根系，可吸收土壤深层的水分，在干旱时保证充足的水分供应；
（2）灵敏的气孔调节能力和特殊的气孔结构，如气孔内陷，发达的角质层，减少蒸腾失水；
【2】张志良、瞿伟菁.植物生理学实验指导:第3版[M].北京:高等教育出版社,2003.
【3】潘瑞炽主编.植物生理学（第五版）.北京：高教出版社，2004.
【4】潘瑞炽主编.植物生理学（第五版）.北京：高教出版社，2004.
二．实验报告
1．实验现象及结果
（1）结果记录表：
条件
重量
体积
OD值
现象
Pro
/(μmol/L)=6.45 -0.56
式中， 为可溶性糖的浓度； 为MDA的浓度
（3）逆境胁迫与 的积累
①记录 提取及测定时的现象
②测定OD410计算： content = /ε.L.W× × (mmol.g-1FW)
4．参考文献
【1】李合生主编.《植物生理学学习指导与题解》.武汉：华中科技大学出版社，2003
③计算： content = /ε.L.W× × (mmol.g-1FW)
2.试验注意事项：
①研磨要充分，注意材料不要溅出，用提取液洗研钵时要尽量充分；
②正确离心并且正确取舍液体或沉淀；
③ 的积累测定时，实验组添加的试剂是5% 对照组使用的试剂是20% 取（由于5% 是使用 配制而成的）；
3．实验数据处理方法
（3）逆境胁迫与 的积累
① 提取：分别取0.5 g实验组和对照组→加入3ml50mMPBS (pH=6.8，内含1mM HA)和少许石英砂→充分研磨→用2mlPBS洗研钵→5000 rpm离心10 min→上清液定容至5ml。
植物生理学实验
叶绿素的卟啉环
叶绿素分子头部的金属卟啉环中心均为Mg2+。 在弱酸作用下，叶绿素分子中的镁可被H + 取
代而形成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则可形 成绿色的铜代叶绿素。 铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常 用此法制做植物的原色标本。
（三）叶绿素的光学性质
叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定 的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
二、植物生理学实验的目录
实验一 种子生活力的快速测定--------------------------4学时 实验二 小蓝子法测定植物的呼吸速率-------------------4学时 实验三 叶绿素a、b含量的测定---------------------------4学时 实验四 植物抗逆性的鉴定（电导仪法、丙二醛含量的测定、植物
实验一 植物种子生活力的快速测定 (TTC法、染料染色法)
[实验步骤]
一、氯化三苯四氮唑法（TTC法） 1、原理
凡是生活细胞，就有新陈代谢。渗入生活细胞的无色的TTC能被脱氢辅酶（NADH2或NADPH2）上 的氢还原成红色产物（TTF），肉眼可辨。 2、材料：玉米、小麦（吸胀种子） 3、方法：100粒种子，沿中心线纵切为二，做如下处理： 100半粒
4、叶绿素提取液荧光现象观察
➢ 取试管3： ➢ 从与入射光垂直的方向观
察； ➢ 再在透射光方向观察叶绿
体色素溶液的颜色； ➢ 记录叶绿素体色素溶液颜
色有何不同 ，分析原因。
5、铜代叶绿素反应
向试管4中逐滴加入浓盐酸，并不断摇匀，至颜色变化， 观察并记录现象；
向变色后的叶绿素溶液中加入少量醋酸铜，并在酒精灯上 缓缓加热，观察并记录颜色的变化。
[实验结果分析]
逆境胁迫对植物生理生化代谢的影响
逆境胁迫对植物生理生化代谢的影响20093391 魏晓明农学0901摘要：对植物产生伤害的环境称为逆境，又称胁迫。
常见的逆境有寒冷、干旱、高温、盐渍等。
逆境会伤害植物，严重时会导致植物死亡。
逆境对植物的伤害主要表现在细胞脱水、膜系统受破坏，酶活性受影响，从而导致细胞代谢紊乱。
有些植物在长期的适应过程中形成了各种各样抵抗或适应逆境的本领，在生理上，以形成胁迫蛋白、增加渗透调节物质（如脯氨酸含量）、提高保护酶活性等方式提高细胞对各种逆境的抵抗能力。
关键词：逆境胁迫,抗逆性，相对电导率，脯氨酸，丙二醛，样品，细胞膜透性，过氧化物酶活性，叶绿素，可溶性糖。
前言：植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。
当植物遭受逆境伤害时，细胞膜受到不同程度的破坏，膜的透性增加，选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗。
膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、作物品种的抗性等因素有关。
因此，质膜透性的测定常可作为逆境伤害的一个生理指标，广泛应用在植物抗性生理研究中。
当质膜的选择透性被破坏时细胞内电解质外渗，其中包括盐类、有机酸等，这些物质进入环境介质中，如果环境介质是蒸馏水，那么这些物质的外渗会使蒸馏水的导电性增加，表现在电导率的增加上。
植物受伤害愈严重，外渗的物质越多，介质导电性也就越强，测得的电导率就越高（不同抗性品种就会显示出抗性上的差异）。
在植物胁迫处理过程中，叶绿素含量会下降，可以把叶绿素含量下降看作是胁迫发展中由功能性影响到器质性伤害的一个中间过程。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，他与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，他的活性不断变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以糖含量作为重要指标。
植物为了适应逆境条件，如干旱、低温，也会主动积累一些可溶性糖，降低渗透势和冰点，以适应外界环境条件的变化。
抗氧化酶测定实验方法
植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定一、原理植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。
MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。
因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。
丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。
二酮)，其最大吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。
二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。
不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。
UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1)D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。
植物生理学实验：实验五 丙二醛含量测定
实验原理
丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（ TBA）反应产生红棕色的三甲基复合物（3,5,5´-三 甲基恶唑2,4-二酮），该物质的吸光系数为 155mmol/(L·cm)，在532 nm处有最大吸收峰， 并且在600nm处有最小光吸收。
O
O
OH
HN 2
+
S NO H
硫代巴比妥酸
OO
100 OC
HN
N
H
H
丙二醛
HS
N H
O HO
N H
S
3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮
（三甲川）
实验原理
可溶性糖对此反应有干扰，为消除这种干扰可使用以 下公式算出MDA浓度（μmol/L），并进一步算出单 位质量组织中MDA含量（μmol/g）。
C（μmol/L）=6.45（A532-A600）-0.56A450 A450、A532和A600分别表示在三种波长处的吸光度值
1. 取0.5g叶片材料，加2mL5%TCA研磨后将匀浆转入离 心管，再用3mL5%TCA洗涤研钵后转入离心管。将匀 浆在3000r/min下离心10min。
2. 取上清液2mL，加0.67%TBA2mL，混合后在100℃水 浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。
3. 分别测定上清液在450nm，532nm和600nm处的吸光 度值（以0.67 %硫代巴比妥酸溶液为空白），按公式 计算MDA浓度
实验目的；实验材料、仪器设备与试剂
目的：学习和掌握丙二醛法测定植物叶片中过氧化脂质 含量的原理和方法。
仪器 分光光度计、离心机、电炉； 研钵、天平、试管架、离管、移液管、滤纸等。
试剂 5%三氯乙酸（TCA）；0.67%硫代巴比妥酸（用 10%TCA配制）；石英砂。
(完整版)逆境生理指标的测定
逆境生理指标的测定要求：选三个指标一、植物组织中超氧物歧化酶活性的测定催化下列反应： 2 +2H + → H 2O 2 + O 2 反应产物H 2O 2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
因此SOD 有保护生物体免受活性氧伤害的能力。
已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
原理本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有可被氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 ， 可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，蓝色化合物在560nm 处有最大吸收，而SOD 可清除 从而抑制了蓝色化合物的形成。
因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
试剂0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399g Met 用磷酸缓冲液定容至100ml ；750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存； 100μmol/L EDTA-Na 2溶液：取0.03721g EDTA -Na 2用磷酸缓冲液定容至100ml ；20μmol/L 核黄素溶液：取0.00753g 核黄素用磷酸缓冲液定容至1000ml 避光保存(当天配制)。
方法1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加1ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml 。
取2~3ml 于10000rpm 下离心10分钟，上清液即为SOD 粗提液。
2、显色反应 取5ml 试管（或指形管，要求透明度好）7支，3支试管为测定管，另4支为对照管，按表1加入各溶液。
混匀后将1支对照管置暗处，其他各管置于4000lx 日光灯下反应20min （要求各管受光情况一致，反应室的温度高时反应时间可以缩短，温度低时反应时间可适当延长(温度范围30~37℃)。
植物生理学实验课程
《植物生理学实验》课程大纲一、课程概述课程名称（中文）：植物生理学实验（英文）：Plant Physiology Experiments课程编号：18241054课程学分：0.8课程总学时：24课程性质：专业基础课前修课程：植物学、生物化学、植物生理学二、课程内容简介植物生理学是农林院校各相关专业的重要学科基础课，是学习相关后续课程的必要前提，也是进行农业科学研究和指导农业生产的重要手段和依据。
本实验课程紧密结合理论课学习内容，加深学生对理论知识的理解。
掌握植物生理学的实验技术、基本原理以及研究过程对了解植物生理学的基本理论是非常重要的。
本大纲体现了植物生理学最实用的技术方法。
实验内容上和农业生产实践相结合，加强学生服务三农的能力。
实验手段和方法上，注重传统、经典技术理论与现代新兴技术的结合，提高学生对新技术、新知识的理解和应用能力。
三、实验目标与要求植物生理学实验的基本目标旨在培养各专业、各层次学生有关植物生理学方面的基本研究方法和技能，包括基本操作技能的训练、独立工作能力的培养、实事求是的科学工作态度和严谨的工作作风的建立。
开设植物生理学实验课程，不仅可以使学生加深对植物生理学基本原理、基础知识的理解，而且对培养学生分析问题、解决问题的能力和严谨的科学态度以及提高科研能力等都具有十分重要的作用。
要求学生实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期结果，操作关键步骤及注意事项；实验时要严肃认真专心操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果；及时将实验结果如实记录下来；实验结束后，根据实验结果进行科学分析，完成实验报告。
四、学时分配植物生理学实验课学时分配实验项目名称学时实验类别备注植物组织水势的测定3学时验证性叶绿体色素的提取及定量测定3学时验证性植物的溶液培养及缺素症状观察3学时验证性植物呼吸强度的测定3学时设计性红外CO2分析仪法测定植物呼吸速率3学时设计性选修植物生长物质生理效应的测定3学时验证性植物种子生活力的快速测定3学时验证性1果实、蔬菜中有机酸含量测定3学时设计性植物抗逆性的鉴定3学时设计性改良半叶法测定植物的光合速率6学时综合性选修植物生理综合演示实验3学时综合、设计性演示合计36学时注：本实验课程总计0.8学分，合24学时，安排8次实验，其中验证性实验占62.5%，综合性、设计性实验占37.5%。
植物生物学实验(植物生理)教案
植物生物学实验(植物生理)教案实验一多酚氧化酶活性测定（3学时）一、实验目的：掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性二、实验原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。
醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，通过分光光度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。
三、器材与试剂低温离心机、s22pc分光光度计、儿茶酚、pH 7.2磷酸缓冲液四、实验内容：1．称取马铃薯0.5克，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，少许PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液。
4℃ 4000rpm离心15分钟，上清液即为粗酶液。
2．在试管中，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚以及1mL 粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。
3．A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录5次。
4．计算酶活力。
按下式计算 PPO活性＝U/min gFWA值增加0.001定义为一个酶活力单位。
五、实验报告：计算所测材料的PPO活性。
选择A值变化均匀的三组数值求平均值。
实验二植物耐盐生理指标测定（9学时）一、实验目的：1、了解盐胁迫的机理以及植物的耐盐机制2、了解植物盐处理的方法3、掌握植物体内脯氨酸含量测定的原理和方法4、掌握过氧化物酶活性的测定原理和方法5、掌握丙二醛含量的测定方法6、掌握基本的数据统计方法二、实验原理植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势, 维持植物体内的水分平衡, 保证植物的正常生长。
脯氨酸本身是一种水溶性最大的氨基酸，它可以防止原生质体的水分散失，在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织保持水分。
用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
实验五逆境对植物的伤害(电导率法)
六、思考题
植物抗逆性与细胞膜透性有何关系?用电
导仪法定量测定细胞膜透性变化为什么 要用纯NaCl做标准曲线 ?
逆境对植物的伤害-电导仪法
逆境对植物的伤害-电导仪法
二、实验材料、仪器与设备
1 实验材料: 植物叶片 2 实验仪器：电导仪，电子天平， 真空干燥器，抽气机， 恒温水浴锅，打孔器 3 实验试剂：NaCl 溶液
逆境对植物的伤害-电导仪法
二、实验设备-电导仪
逆境对植物的伤害-电导仪法
三、实验步骤
1.取大小一致的功能叶片，蒸馏水洗净，擦干。
2.避免叶片大脉，打孔器打取20个圆片放入干
净小烧杯，在向其中加入20ml蒸馏水。
3.用抽气机抽气7～8min以抽出细胞间隙中的空
气。重新缓缓放入空气，水即被压入组织中而
使叶下沉。
逆境对植物的伤害-电导仪法
三、实验步骤
4.将抽过气的小烧杯取出，放在实验桌上静置 20min，然后用玻璃棒轻轻搅动叶片，在 20～25℃恒温下，用电导仪测定溶液电导率。
处理电导率-对照电导率 伤害率=──────────────×100% 对照电导率
逆境对植物的伤害-电导仪法
五、注意事项
1.整个过程中，叶片接触的用具必须绝对 洁净（全部器皿要洗净），也不要用手直 接接触叶片，以免污染。 2.各处理和对照的待测液的体积要一样。 3.测定后电极要清洗干净。
逆境对植物的伤害-电导仪法
5.测过电导率之后，再放入100℃沸水浴中
15min，以杀死植物组织，取出放入自来水
冷却10min，在20～25℃恒温下测其煮沸电 导率。
逆境对植物的伤害-电导仪法
实验设备-电导仪的使用