各种动物骨髓单个核细胞分离液试剂盒
各种动物骨髓单个核细胞分离液试剂盒
规格：200mL/kit
保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。
无菌开封后，保存于室温。
试剂盒组成：
各种动物骨髓单个核细胞分离液200mL
全血及组织稀释液200mL
细胞洗涤液200mL
单个核细胞分离方法
制备骨髓的单细胞悬液：
1.取一支适当的离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（分离液最少不得少于3mL，总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果）。
2.小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上，注意保持两液面界面清晰。
（可以使用巴氏德吸管吸取单细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。
）
3.室温，500~900g，离心20~30min。
（根据骨髓单细胞悬液的量确定离心条件，单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件可以自行摸索，以达到最佳分离
效果）。
4.离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。
第一层为稀释液层；第
二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细
胞层。
5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层至另一洁净的15mL
离心管中，向离心管中加入10ml细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心
10min。
6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。
7.重复步骤7
分层示意图
8.弃上清，细胞重悬备用。
骨髓单细胞悬液的制备方法
小动物骨髓的采集：
1.处死动物，无菌提取股骨和胫骨，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔（注意尽可能少的剪走骨髓腔）。
2.取1ml的无菌注射器，吸取少量的含有10%标准胎牛血清的稀释液或者是含有血清的培养基，冲洗骨髓腔以获得骨髓。
3.最终制备成2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。
大动物骨髓的采集：
大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法：先将动物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮肤，然后估计好皮肤到骨髓的距离，把骨髓穿刺针的长度固定好。
操作人员用左手把穿刺点周围的皮肤绷紧，右手将穿刺针在穿刺点垂直刺入，轻轻左右旋转将穿刺针钻入，当穿刺针进入骨髓腔时常有落空感。
连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时即停止抽吸。
用含10%标准胎牛血清的稀释液调整细胞浓度为2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。
常用的骨髓穿刺点：
股骨：穿刺部位在股骨内侧面,靠下端的凹面处；
胸骨：穿刺部位是胸骨体与胸骨柄连接处；
肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各点的中点；
胫骨：穿刺部位是股骨内侧、靠下端的凹面处。
如果穿刺采用的是肋骨，穿刺结束后要用胶布封贴穿刺孔，防止发生气胸。
注意事项：
A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。
B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。
4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。
C.待分离的组织要求新鲜，避免冷冻和冷藏。
D.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁影响分离效果。
E.如果要进一步对分离的细胞进行培养，那在制备单细胞悬液和分离过程中，注意无菌操作，避免微生物污染。
参考文献：
1.Boyum A.Separation of leucocytes from blood and bone marrow.Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1968;97:7.
2.Ting A,Morris PJ.A technique for lymphocyte preparation from stored heparinized blood.Vox Sang.1971Jun;20(6):561-
3.
3.Boyum A.Separation of Blood Leucocytes,Granulocytes and Lymphocytes Tissue Antigens.1974; 4(4):269-7
4.
4.Weisbart RH,Webb WF,Bluestone R,Goldberg LS.A simplified method for lymphocyte separation. Vox Sang.1972;23(5):478-80.。
实验项目一猪骨髓间充质干细胞的分离和培养
猪骨髓间充质干细胞的培养与分离实验准备：器材：手术刀片，手术刀柄，剪刀，镊子，弯钳，5ml灭菌注射器，7号注射针头，10ml离心管，离心机，100mm培养皿，75ml培养瓶试剂：低糖DMEM（含有10%FBS,75μg/ml青霉素，50μg/ml硫酸链霉素）1000iu/ml青链霉素的PBS（生理盐水）(装入灭菌的洗瓶中)无血清低糖DMEM.2%台盼蓝染液材料采集：一，胎猪骨髓采集：【1】 1，无菌条件下从猪子宫内取出胎儿置入到保温瓶中，加入含有青链霉素的PBS或生理盐水中，立即送回实验室。
2，在无菌操作下取下左右股骨，除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3-4次用灭菌生理盐水冲洗干净，在超净工作台内剥离肌肉和骨膜，得到完整的股骨。
立即用含有1.0ml DMEM+3000iu/ml肝素的注射器冲骨髓腔，迅速换上5号的针头将冲出的骨髓血轻轻吹打，再加入等量培养液（DMEM+10%FBS）稀释，然后以1:4比例缓慢加入到Percoll分离液（1.073g/ml）的表面，1000r/min 30min,小心吸取乳白色的有核细胞层。
目前用于分离MSCs的方法主要有密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和贴壁筛选法。
密度梯度离心法目前主要包括利用percoll分离液分离MSCs和利用淋巴细胞分离液分离MSCs两种。
Percoll密度梯度离心法根据细胞密度不同将细胞分为数层，因此得到的MSCs纯度较高，但是操作繁琐，而淋巴细胞密度梯度离心法虽得到的MSCs不及percoll密度梯度离心法得到的细胞纯度高，但是操作简单，且获得的MSCs增殖活性较强。
【13】来自:胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离取2-3月龄猪胎儿，在无菌操作下取下左右股骨，用含1000iu/ml青链霉素的PBS浸泡30min,除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3-4遍；用吸有4ml а-MEM细胞培养液的一次性无菌5ml注射器刺入处理好的股骨的一端，冲出骨髓，然后用7号针头轻轻吹吸数次，使冲出的骨髓尽可能分散为单个细胞，100目滤沙过滤；1000rpm/min,离心5min,用а-MEM细胞培养液制成细胞悬液，计数后，调整有核细胞的密度为1-2x107/ml.,然后接种培养。
EasyPure Genomic DNA Kit 01
EasyPureTM Genomic DNA Kit
Material Mammalian Cell Mammalian Tissues Mouse Tail E.coli Cells Yeast Cells
Amount 1-5×106 cell
≤25 mg
0.5 cm sections ≤2×109 cell ≤5×107 cell
试剂盒内容
Components Lysis Buffer 2 (LB2) Binding Buffer 2 (BB2) Clean Buffer 2 (CB2) Wash Buffer 2 (WB2) Elution Buffer (EB) RNase A (20 mg/ml) Proteinase K (20 mg/ml) 10% SDS Spin Column with Collection Tubes
EE101-01 (50 rxns) 10 ml 12 ml 55 ml 12 ml 25 ml 1 ml 1 ml 2 mns) 40 ml 45 ml 2×110 ml
2×22 ml 90 ml 4 ml 4 ml 8 ml 200个
特点
● 提取速度快，提取量高。 ● 最少的RNA污染。 ● 基因组DNA大小20-50 kb。 ● 高质量的DNA、下游酶切、PCR、Southern 杂交等实验可靠稳定。 操作步骤
使用前加不同体积100%乙醇到WB2。
50 rxns (48 ml)
200 rxns (2×88 ml) 所有离心均在室温下进行。
Ficoll实验最佳条件确定
Eppendorf离心机Ficoll分离骨髓单个核细胞离心条件探索实验流程图实验目的：本实验拟建立使用eppendorf离心机进行小鼠单个核细胞Ficoll分离时的最佳离心条件。
实验材料与方法：1、实验材料:C57小鼠（购自？？？）2、实验试剂：Hank’s液：自配类标准胎牛血清：民海生物公司，批号：200610093、实验仪器超净台：北京东联哈尔滨仪器制造有限公司；苏州净化设备有限公司，SW-CJ-1FD型；倒置显微镜：美国Beckman Coulter Altra；离心机：eppendorf AG 22331 Hamburg玻璃滴管手术器械移液枪 Tip头参与人员Xxx Xxx Xxx观察指标1、不同离心条件下Ficoll分离单个核细胞的产率；2、确定eppendorf离心机做Ficoll分离时的最佳离心条件。
实验步骤1、收集骨髓细胞使用70％的乙醇清洁工作区及仪器颈部脱臼处死小鼠用70%乙醇浸湿小鼠，用来灭菌和降低污染可能。
无菌分离股胫骨、脾脏，并将它们放入冰上含有2％胎牛血清的HBSS培养基（HF）中。
将骨髓细胞和脾脏细胞分别稀释到25ml。
第一次细胞计数：得到细胞浓度，并根据细胞浓度和细胞体积计算细胞的总数。
2、细胞分装将骨髓细胞和脾脏细胞分别分装到6个15ml离心管中，每管8ml。
3、Ficoll密度梯度离心将细胞悬液室温下加在5mlFicoll溶液上方每次取1管骨髓细胞和1管脾脏细胞，室温无级离心。
条件分别设置为：1100转、1200转、1300转。
每次15min。
每次离心升降均为无档。
将分离到的单核细胞（中间层）与上层Ficoll（试管中剩余2.5mlFicoll）转入15ml离心管中第二次细胞计数：得到细胞浓度，并根据细胞浓度和细胞体积计算细胞的总数。
然后与第一次细胞计数相比较，计算细胞损失率（细胞回收率）。
4、洗涤以下步骤均处冰上用10mlHBSS培养基（HF）洗涤细胞，并在4度400g离心5min（1800rpm，20min），用10mlHF重复洗涤一次(1600rpm,15min) 注意这两次离心降速均为无档降速用1mlHF将细胞悬起第三次细胞计数：然后与第一次、第二次细胞计数相比较，计算细胞损失率（细胞回收率），以及细胞总的损失率（细胞总的回收率）。
间充质干细胞和单个核细胞异种移植治疗小鼠肝损伤的研究
首 次换液 ， 以后 每隔 ２— ３ｄ换液 １ ， 次 去除悬浮生长的 细胞 。待贴壁细胞 生长 占瓶底 面积 的 ８ ％ ～ ０ ０ ９ ％时 ，
用 ０ ２ ％胰酶／ ．２ Ｄ Ａ（ ： ） ．５ ０ ０ ％Ｅ Ｔ １ １ 消化 并 以 １ ２比例 ：
传代 。取生长 良好 、 形态 上呈 较为 均一梭 形 的第 ３代 培养细胞 ， 消化 后配 成 １×１ － Ｌ 的单 细胞 悬 液 ， ０ ｍ 加入 ＦＴ ＩＣ标记 的 Ｃ ４ Ｄ ４抗 体 、 Ｄ ０抗 体和 Ｐ Ｃ９ Ｅ标记 的 Ｃ４ Ｄ ５抗 体 染 色 ， 流 式 细 胞 仪 检 测 ， 取 表 型 为 以 选
ＭＳ ｓＣ ４ 、 Ｄ ０均表达 阳性 ， Ｃ ４ Ｃ Ｄ ４ Ｃ ９ 而 Ｄ ５表 达阴性 ； ２个细胞移植组在 Ｔ ～ 时点 Ａ Ｔ和 Ａ Ｔ浓度差异 有统计 ｌ Ｌ Ｓ
学意义 （ ０ ０ ） 与肝损伤 对照组比较 ， Ｃ 移植 组 Ａ＿ 和 Ａ Ｔ浓度在 Ｔ 一Ｂ 时点均 降低 ；ＭＳ ｓ Ｐ＜ ． １ ； ＭＳ ｓ Ｉ Ｔ Ｉ Ｓ １ Ｃ 移植 组肝 损
目前 ， 治疗肝 损伤引起 的肝纤 维化及 各种终 末期
肝 病主要 方法有肝 脏移植 、 肝细胞 移植 和干细胞 移植
ＭＮ ｓ细胞 悬液 按 ４ ｍ
等， 但都 面临供体来源 困难 和免疫排 斥等 问题 。为此 ， 人们一直努力 寻求一种 理想 的生物人 工肝或新 型种子 细胞。研究显示 ， 具有 多 向分 化潜 能 的问充 质干 细胞 （ Ｃ） ＭＳ ｓ 有体外 易获得 、 源可靠 、 疫原 性很 弱且 异 来 免 体移植不 易发生免疫排斥 等优 点 Ｊ异体 Ｍ Ｃ 有望 ， Ｓｓ 成 为一种新 型的种 子细胞 ， 为治疗 各种终末 期肝病 提 供新策 略。 自２０ ０ ９年 １ 至 ２ １ 月 ０ ０年 ２月 ， 研究拟 比 本 较大 鼠骨髓 ＭＳ ｓ Ｃ 和单 个核 细胞 （ Ｃ ） 四氯化 碳 ＭＮ ｓ 在 （ Ｃ 诱 导性小 鼠肝损 伤治疗 中的作用 。 ＣＩ ）
小鼠外周血单个核细胞分离、纯化
小鼠外周血单个核细胞分离、纯化徐太哲;李丽;王长山【摘要】目的:探讨小鼠外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,提高细胞获得率与纯度,以便后续分子生物学实验.方法:小鼠摘除眼球取血,设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化,分别采用EDTA-K2、肝素、枸橼酸钠抗凝,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度,计数存活率.结果:Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85％,细胞获得率最高可达80％以上,活细胞百分率在92％以上.结论:Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC,对后续分子生物学实验无影响.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2016(039)004【总页数】3页(P10-11,13)【关键词】小鼠;Ficoll密度梯度离心;PBMC【作者】徐太哲;李丽;王长山【作者单位】佳木斯市红十字医院,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007【正文语种】中文【中图分类】R446.11+3外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)包括淋巴细胞和单核细胞。
是免疫系统的重要组成，是研究免疫老化和衰老的主要依据。
研究T、B淋巴细胞首要分离外周血单个核细胞，主要的分离方法是Ficoll-hypaque密度梯度离心法，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异，而得以分离[1]。
离心后，单个核细胞因与分离液密度相当，集中在血浆层和分层液的界面上，呈白雾层，吸取该层细胞经洗涤离心即获得PBMC。
PBMC分离是分子生物学试验常用的技术，其效果直接影响PCR等后续试验结果。
实验对象小鼠因体重小，体内血液量少，Ficoll密度梯度离心法正适用这样少量血液的分离，本文探讨小鼠外周血单个核细胞的分离最佳条件。
1.1 材料与分组BALB/c小鼠18只，5～6月龄，体重23～25g，雌雄不限；小鼠外周血单核细胞分离液试剂(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)。
多发性骨髓瘤骨髓单个核细胞分泌VEGF的临床研究
３ ９例 ＭＭ患者 ， 中男 ２ ， １ ， 其 ９例 女 ０例 年龄 ５ ～ ７岁 ， ０７ 平均 （３±８ 岁 ， Ⅱ、 ６ ） Ｉ、 Ⅲ期 患者分别 为 １ 、 、３例 ， ０６２ 诊断 、 分期
及疗效判断均按文献【 标准 。收集本 院创 伤骨科 、 ｌ 】 心外科 手
术切除的 １ ２例非恶性肿瘤及非血液病患者髂骨及肋骨标本
（ ０７０ ．６收稿 ２０ ．７１ ２０ ．１０ ０ ７１．５修 回） 孙东建 ） （ 文编辑 本
ｃｌｎｚ ｇｓａｎ ｒｔ ｍ ｆ ｔ 【． ｕｌ ｅ ｉｔ，０４，６ ｏｏｉｎ ｔ ｉｓｉ ｐｅｅ ｉ ａ ｓ Ｊ Ｔ ｒ Ｐ ｄａｒ２０ ４ ｉ ｒ ｎ ｒ ｎｎ 】 【Ｊ
（ ）２ ５Ｅ Ｆ水平差别 有统计学意义 （ Ｆ＝４２ ， ． Ｐ＜０ ５ ， ９ ． ）部 ０ 分缓解 组低于进 步组及无 效组 ， 差异有统 计学 意义 （ ｑ分别 为 ３９ ． ０和 ３ ９ Ｐ＜０ ）进步组又低 于无效 组 ， ． ， ９ ． ， ５ ０ 差异亦有统 计学意义（ 口＝４１ ， ．３Ｐ＜０ ５ 。 ． ） ０ 表 ２ ＭＭ 患者骨髓单个核细胞 Ｖ ＧＦ分 Ｅ 泌■治 疗前 后变化 （ ｇ ， ±ｓ ｎ／ 面 ） Ｌ
公司 。
２ 初诊 ＭＭ患者骨髓单个 核细胞 Ｖ Ｇ ． ２ Ｅ Ｆ水平 与疗 效的关
系 见表 ２ 。无 论是无 效 、 步还是部 分缓解 患者 ， 进 治疗 后 Ｖ Ｇ Ｅ Ｆ水平均低于治疗前 （ ＜００ ） 均 ．１ 。不同疗效的 ＭＭ患者
１ ． 骨髓单个核 细胞 （ ＭＭＮ 分离和培 养 ．２ ２ Ｂ ｃ）
２１ 初诊 ＭＭ 患者骨髓 单个 核细胞 Ｖ Ｇ ． Ｅ Ｆ分 泌水平 ＭＭ 患者骨髓单个核细胞 Ｖ Ｇ Ｅ Ｆ的分泌水平为 （３ ． ５ ８ ６±１８１ ） ４ １． ７ １９ ９ ９年 １ 月一２ ｏ ｏ ６年 １ ２月于我 院初诊 的 ｎ／ ， 照组为 （６ ．８±２ ．３ ｎ／ ， 者显著 高于后者 （ ＝ ｇＬ 对 １ ０ ４ ９６ ）ｇＬ 前 ￡ ３５４ Ｐ＜０ １ 。各期患者 Ｖ Ｇ ． ， ０ ． ） ０ Ｅ Ｆ分泌水平差异有统计学意 义 ， Ｅ Ｆ分泌水平随着疾病进展而升 高 ， Ｖ Ｇ 见表 １ 。 表１ ＭＭ 患者 骨髓 单个核细胞 Ｖ Ｆ ＥＧ 分泌 ■与疾病分期关 系 １１ 一般 资料 ．
骨髓单个核细胞分离液试剂盒使用说明
骨髓单个核细胞分离液试剂盒使用说明规格：4×200mL/kit保存：18-25℃保存，有效期2年。
骨髓单个核细胞分离液试剂盒易感染细菌，需无菌条件下操作。
无菌条件下操作，启封后置于常温保存。
如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
试剂盒内容：动物骨髓单个核细胞分离液200mL样本稀释液200mL清洗液200mLF液200mL一、各种动物骨髓细胞的采集方法1.大鼠、小鼠骨髓的采集：用颈椎脱臼法处死动物,剥离出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的F液，冲洗出胸骨或股骨中全部骨髓液，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清。
沉淀以F液重复洗涤一次后用全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/mL），备用。
2.大动物骨髓的采集：A．骨髓穿刺点定位（1）胸骨：穿刺部位在胸骨中线,胸骨体与胸骨柄连接处,或选胸骨上1/3部。
（2）胫骨：穿刺部位在胫骨内侧,胫骨上端的下方1厘米处。
（3）肋骨：穿刺部位在第5～7肋骨各自的中点上。
（4）髁骨：穿刺部位在髁前上棘后2～3厘米的髁嵴。
（5）股骨：穿刺部位在股骨内侧面,靠下端的凹面处。
B．骨髓穿刺方法（1）实验动物按要求固定，穿刺部位去毛、消毒、麻醉，要求局部麻醉范围直达骨膜，也可作全麻。
（2）操作人员带消毒手套，确定穿刺点，估计从皮肤到骨髓的距离并依此固定骨髓穿刺针长度。
左手拇、食指绷紧穿刺点周围皮肤，右手持穿刺针在穿刺点垂直进针，小弧度左右旋转钻入，当有落空感时表示针尖已进入骨髓腔。
用左手固定穿刺针，右手抽出针芯，连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时立即停止抽吸，收集骨髓细胞加入4-5mL F液混匀，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/mL），备用。
（3）左手压住穿刺点周围皮肤，迅速拔出穿刺针，用棉球压迫数分钟。
单抗制备实验报告
一、实验背景单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，由单个B细胞克隆产生。
单抗在生物医学研究、疾病诊断、治疗药物研发等领域具有广泛的应用。
本实验旨在通过细胞融合技术制备小鼠单克隆抗体，并对其特异性、亲和力和效价进行鉴定。
二、实验材料1. 实验动物：雌性小鼠，体重18-22g。
2. 试剂与耗材：淋巴细胞分离液、Ficoll、RPMI-1640培养基、胎牛血清、链霉素、青霉素、聚乙二醇（PEG）、小鼠抗小鼠IgG-FITC、兔抗小鼠IgG-HRP、ELISA 试剂盒、抗体稀释液、抗体亲和层析柱等。
3. 仪器：超净工作台、显微镜、酶标仪、离心机、冰箱、培养箱等。
三、实验方法1. 动物免疫（1）选择雌性小鼠，将其随机分为两组，每组10只。
（2）对实验组小鼠进行免疫，每次免疫剂量为1mg抗原，间隔2周进行第2次免疫。
（3）对照组小鼠仅给予生理盐水注射。
2. 细胞分离与培养（1）免疫后第3周，处死实验组小鼠，无菌操作取出脾脏。
（2）将脾脏剪碎，加入Ficoll分层液，进行细胞分离。
（3）收集单个核细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次，计数。
（4）将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行混合，加入PEG进行细胞融合。
（5）将融合后的细胞进行培养，选择杂交瘤细胞。
3. 单抗制备（1）将杂交瘤细胞进行扩大培养，收集培养上清。
（2）用ELISA试剂盒检测培养上清中的抗体效价，筛选出高亲和力抗体。
（3）将高亲和力抗体进行亲和层析纯化。
4. 单抗鉴定（1）用小鼠抗小鼠IgG-FITC和兔抗小鼠IgG-HRP进行Western blot检测，鉴定单抗的特异性。
（2）用ELISA试剂盒检测单抗的效价。
（3）用抗体亲和层析柱对单抗进行亲和力测定。
四、实验结果1. 动物免疫实验组小鼠在免疫过程中未出现明显异常，免疫成功。
2. 细胞分离与培养成功分离出脾细胞和骨髓瘤细胞，细胞融合率为90%。
骨髓间充质干细胞培养
废液缸 PBS 或 N.S.冲洗 N.S.冲洗 5ml PBS 5%trypsin+EDTA 0.125~0.25ml 血清200 血清200 ul 混合液
25 cm2
显微镜观察3~5 显微镜观察3~5 min 废液缸 PBS 或 N.S.
废液缸Biblioteka 工作液离心机 1200rpm× 1200rpm×10min
离心机 1200rpm× 1200rpm×10min 6ml (25 cm2) 12~18ml (75 cm2)
废液缸
废液缸
工作液
离心机 1200rpm× 1200rpm×10min 培养瓶
去除悬浮液
废液缸
PBS 或 N.S.冲洗 N.S.冲洗
工作液
换液
废液缸(半量) 废液缸(半量)
工作液
消化传代
人骨髓源间充质干细胞 分离培养技术
24~48h
取骨髓
72h
分离单个核细胞
80%
去除悬浮液 存
换
液
消化传代
冻
分离单个核细胞
淋巴细胞分层液 骨髓样本(缓慢) 骨髓样本(缓慢) (经ＰＢＳ稀释３～４倍) 经ＰＢＳ稀释３～４倍) 单个核细胞 PBS
离心机 离心管 1400rpm× 1400rpm×30min (慢) (慢 PBS 或 N.S. 或 D-HANKS
废液缸
离心机 1200rpm× 1200rpm×10min
离心机 1200rpm× 1200rpm×10min
离心机 1200rpm× 1200rpm×10min
废液缸
1ml 冻存液
冻存管
注意：
• 多份样本应提前标注； • 放入CO2孵箱前应松瓶口，并注意孵箱内水 放入CO
动物源性基因组DNA提取试剂盒说明书
动物源性基因组DNA提取试剂盒说明书试剂盒简介本试剂盒可用于多种动物源性基因组DNA的提取，将处理好的样品通过裂解后加入到纯化柱内高速离心，核酸可以特异性结合在吸附柱内，通过洗涤液处理可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，获取高纯度、质量稳定的DNA。
试剂盒用途本试剂盒适用于饲料、多种动物细胞和动物组织等样品的动物源性基因组DNA提取与纯化。
试剂盒组成（50T/Kit）注：请自备无水乙醇（分析纯）储存条件及有效期蛋白酶K于-20 ℃保存，其余组分均室温保存。
有效期一年。
注意事项1.当缓冲液DA、DB及洗液1于低温保存时，可能会有沉淀析出，将试剂瓶于室温下放置一段时间，使析出物充分溶解并混匀即可。
2.缓冲液DA、DB及洗液1中含有胍盐，与次氯酸钠、漂白液（粉）以及酸性液体混合会产生毒性气体，切记不能将两类液体倒在一起。
3.如样本脂类含量过高，影响操作，可在操作步骤1结束后用等体积氯仿抽提一次，避免脂类对后面操作的影响。
4.所有离心步骤室温下进行即可。
5.为了避免外源DNA酶或细菌降解DNA提取物，操作时请戴口罩和手套。
准备工作13 ml洗液1浓缩液加入17 ml无水乙醇；7ml洗液2浓缩液加入23 ml无水乙醇。
操作步骤1. 样品处理1.1 饲料：将饲料充分研磨粉碎后，称取50 mg样本加入到1.5 ml洁净的离心管中，加入300μl缓冲液DA、20 μl蛋白酶K溶液。
振荡混匀后56 ℃水浴1 h，每隔10~15 min取出颠倒混匀一次。
1.2 动物细胞或组织：剪取不超过50 mg样本加入到1.5 ml洁净的离心管中，用研磨棒充分研磨，加入300 μl缓冲液DA、20 μl蛋白酶K溶液。
振荡混匀后56 ℃水浴1 h，每隔10~15 min取出颠倒混匀。
2. 向处理好的样品加入400 μl的缓冲液DB，振荡混匀后70 ℃水浴10 min后，12 000 rpm离心3 min。
取400 μl上清液到新的1.5 ml洁净的离心管中。