GST-Pull-Down原理
GST pulldown实验技术
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
gstpulldown实验流程
gstpulldown实验流程GST pull down是将GST融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上，与溶液中的目的蛋白相结合。
可用来确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用。
先将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上，再将靶蛋白-GST-Beads和细胞裂解液孵育，这样互作蛋白便一起吸附在Beads上。
洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来，即GST pull down产物。
这种互作复合物既可以用WesternBlot检测已知蛋白，也可用质谱鉴定出未知蛋白。
辉骏生物可制备GST融合蛋白，多种GST pulldown蛋白互作方案供客户选择，保证GST融合蛋白沉降技术服务到成功发表文献。
糖代谢异常是癌症的突出特征，作者前期研究发现肝细胞癌(HCC)中的糖原含量降低，并与患者总体生存情况不良相关。
探索HCC中的异常糖代谢机制或许可以为肝细胞癌的治疗提供新的靶点。
>RNA-seq和qPCR等结果显示HCC组织中的GYS2(糖原合成酶2)显著下调，并与患者不良预后相关>细胞和小鼠实验表明GYS2的缺失促进了肝癌细胞增殖和肿瘤生长>GYS2敲除细胞的RNA-seq实验发现p53通路都受到明显抑制>Co-IP和GST pull down证明GYS2通过与p53的直接相互作用发挥肿瘤抑制功能>CO-IP和GST pull down实验发现GYS2、p53和E3泛素连接酶MDM2相互作用形成复合体，GYS2与p53竞争结合MDM2来抑制p53泛素化，稳定p53蛋白水平>荧光素酶和ChIP等实验表明p53蛋白结台GYS2启动子，通过p300介导的乙酰化，在转录水平上抑制GYS2>对HBV阳性肝中的关键致癌蛋白HBx的研究发现,HBx、HDAC1与乙酰化的p53相互作用,共同抑制了GYS2本研究首次报道了HCC组织中糖原含量显著降低，并与不利的患者预后相关，这归因于新发现的HBx/GYS2/p53信号轴。
GST pull-down实验技术
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析
百泰派克生物科技
GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋
白互作分析
GST融合蛋白Pull-down技术也称GST pull-down或GST pull-down融合蛋白沉降
技术，是在GST融合蛋白以及Pull Down技术的基础上发展起来的研究体外蛋白质与蛋白质相互作用的技术，实质上是一种利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）作为亲和
标签进行的Pull-down实验。
该技术利用基因重组技术得到GST标记的融合蛋白，再利用GST对谷胱甘肽（GSH）偶联磁珠的亲和性将带GST标记的融合蛋白与谷胱甘肽偶联磁珠结合，当与融合蛋白有相互作用的靶蛋白通过载有该磁珠的层析柱或与该磁珠混合时，靶蛋白就会与融合蛋白产生吸附而从蛋白混合液中分离出来，通过纯化洗脱就可以得到与融合蛋白相互作用的靶蛋白。
被GST拉下的靶蛋白利用质谱技术进行进一步分析，即GST pull-down结合质谱分析技术，可以实现靶蛋白的定性鉴定和确认，该蛋白可以是已知的也可以是未知的，因此，可以用于验证两种已知蛋白之间可能存在的相互作用以及寻找能与已知的融合蛋白发生相互作用的未知蛋白分子。
百泰派克生物科技基于先进MALDI-TOF质谱系统与LC-MS/MS质谱系统提供专业准
确的GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析服务技术包裹研究体外强烈或者稳定的蛋白质间相互作用，鉴定两种已知的感兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用，寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白，还可用于表征蛋白相互作用的条件，欢迎免费咨询。
gst pull down原理
gst pull down原理Gst Pull Down原理Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。
这种技术可以提高视频的平滑度和流畅度，使观看体验更佳。
本文将详细介绍Gst Pull Down的原理。
一、什么是Gst Pull Down？Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。
在电影制作中，通常使用24帧/秒来拍摄和编辑电影。
但是，在播放时，大多数电视和显示器都以30帧/秒的速度播放视频。
因此，如果直接播放24帧/秒的电影，则会出现画面抖动或不流畅等问题。
二、为什么需要Gst Pull Down？在播放24帧/秒的电影时，由于每个画面之间存在较长时间间隔，因此画面会出现抖动或不流畅等问题。
而将24帧/秒转换为30帧/秒，则可以使画面更加平滑流畅，提高观看体验。
三、Gst Pull Down原理1. 3:2 Pulldown在进行Gst Pull Down时，通常采用3:2 Pulldown方法。
这种方法利用了电影制作中使用的24fps（frames per second）与NTSC （National Television System Committee）制定的30fps之间的差异。
具体来说，将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频，需要将每个电影画面分成两个半画面，然后再将其转换为三个NTSC画面。
2. 操作步骤具体来说，Gst Pull Down的操作步骤如下：（1）将24fps的电影分成两个半画面（Odd Field和Even Field）；（2）将Odd Field插入到第一帧和第二帧之间，形成一个新的NTSC 画面；（3）将Even Field插入到第三帧和第四帧之间，形成另一个新的NTSC画面；（4）重复以上步骤，直到所有24fps电影画面都被转换为30fps视频。
3. 效果通过Gst Pull Down处理后，原本24fps的电影就可以以30fps的速度播放，并且画面更加平滑流畅。
分子生物学常用实验方法原理介绍
分子生物学常用实验方法原理介绍一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA 序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
GST pull down过程
GST pull-downGST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。
其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
GST pull-down技术GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)免疫共沉淀实验由于在非变性实验条件性进行，这样蛋白质之间的天然相互作用得以最大程度的保留，因此可以比较真实的反应蛋白质之间的相互作用。
但也基于此点，免疫共沉淀并不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的，因为通过目的蛋白抗体共沉淀下来的是一个蛋白复合物，而不仅仅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。
而GST-Pull down实验可以通过体外实验条件，去除其它蛋白的影响，从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。
GST亲和层析和GST Pull-down方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH （Glutathione）亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
拉下实验（Pull-down assay）拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。
GST-pull-down实验原理与步骤
GST pull down实验原理与步骤GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。
此方法操作方便，简单易行。
GST pull down实验原理GST pull down的主要原理是利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合。
简单来说，我们假定a蛋白和b 蛋白可能存在互作，将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST 的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定时间，然后洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。
通过Western blot检测结果，我们可以看到GST-a蛋白和b蛋白所对应的条带，即表明了a蛋白和b蛋白因发生相互作用而被GST-a pull down（GST对照只显示一个条带）。
GST pull down实验步骤一、GST-a融合蛋白的制备1．GST-a融合蛋白的表达(1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中；(2)挑取单克隆到含有5ml LB培养基（加入5ul氨苄）的10ml试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜；(3)将培养菌液转移到含有500ml LB（含500ul氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200rpm培养数小时；(4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm 条件下培养10-16h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）；(5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50ml离心管中，4℃4000rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中；(6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10min后弃去上清，再按每10ml菌液沉淀1ml PBS 的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中；(7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。
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分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解
GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。
GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记)，再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育，以使蛋白结合。
GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。
蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。
GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。
GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间
新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。
这两种实验的设计和实施都有所不同。
GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法，基本原理是这样的：假定A蛋白和B 蛋白可能有相互作用，我们就将其中一个蛋白比如A蛋白融合GST标签，然后将GST-A和B以及能特异结合GST的Sephrose 4B beads 孵育一定时间，然后充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，然后进行放射自显影（如果两个蛋白通过体外翻译并且S35标记的话），就可以看见GST-A和B分别对应的条带，表明GST-A和B因相互作用而被GST-A pull down，如果没有相互作用，就只有GST-A相对应的一条带。
我们实验室就是这么做的，当然也有细菌表达GST-A蛋白，而B蛋白通过细胞裂解液中得到，电泳后直接western blot检测。
1、首先你的目的是“要检测这两种蛋白是否与寄主细胞之间存在相互作用”，也即是说要寻找这两种蛋白的相互作用蛋白---在寄主细胞表面，也就是说你要寻找的相互作用蛋白是膜蛋白，对吗？pulldown似乎不是达到你目的的最佳办法，因为你首先要提膜蛋白。
而膜蛋白一般都疏水，量少，好像难以pulldown----缓冲液系统不适合。
我想，你真正的目的是检测寄主细胞表面是否有你这两个蛋白的受体或配体，细胞ELISA应该可以胜任这个目的。
其他方法你可以在查查看？
2、如何保证你融合蛋白（细胞提取物）的尽可能大的活性，只有一条：快速、低温纯化。
即，要保证你纯化过程尽量低温，时间尽量短，得到蛋白后立刻冻纯-70。
当然，你还是有必要做下你蛋白活性到底丧失有多快。
3、如果你还是执意要做pulldown，最好还是直接买珠子，试剂盒太贵了，不划算。