番红固绿切片染色快速法不使用石蜡
植物组织切片制作以及注意事项
植物组织石蜡切片的制作以及注意事项1 植物组织石蜡切片的制作方法⑴固定：用50%或70% FAA固定液（50%或70%酒精：甲醛：冰乙酸=16:1:1; 幼嫩材料用50 % FAA；老的材料用70%的FAA），置于4℃固定24 h。
⑵脱水：将固定液倒去，加入50%乙醇，室温静置30 min；重复一次，室温静置20 min。
换成1%番红O溶液(用70%酒精配制)，室温脱水染色过夜。
次日继续脱水，酒精浓度梯度和时间依次为：80% 乙醇1h、95% 乙醇1h、无水乙醇1h、40min（2次）。
⑶透明：1/2无水乙醇+二甲苯混合液1h，纯二甲苯1h、40 min（2次）。
最后加入少量二甲苯（浸没材料即可）和碎蜡，放入38℃温箱中过夜。
⑷浸蜡：将温箱温度调至56℃，计时1h；换成二级蜡1h；三级蜡（3次）各1h、1h、40min（从温度上升到56℃开始计时）。
⑸包埋：将带有材料的液体蜡倒入叠好的纸槽中，迅速放入冰水中使蜡凝固，防止气泡产生，以及凝蜡不匀。
⑹切片：修整蜡块，用Lica RM2126切片机切片，厚度5-10 μm。
⑺贴片: 在载玻片上涂少许粘片剂，将切好的蜡带放入温水中，捞至载玻片上，最后置于37℃恒温箱过夜烤片。
⑻脱蜡及染色：①番红-固绿对染ⅰ脱蜡：二甲苯60min，二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、1%番红室温过夜。
ⅱ染色：80%乙醇5 min，1%固绿（用95%酒精配制）迅速蘸一下，大约10s，直接放到95%乙醇5min 、无水乙醇5min、无水乙醇5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、二甲苯5 min（2次）。
②甲苯胺蓝染色ⅰ脱蜡：二甲苯60 min、二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min、50%乙醇5 min 、30%乙醇5 min、蒸馏水5 min。
改良番红O-固绿软骨染色液操作步骤及染色结果说明
改良番红O-固绿软骨染色液操作步骤及染色结果说明货号：G1371规格：5×50ml/5×100ml有效期：6个月有效产品简介：软骨组织由软骨细胞、软骨基质和纤维组成，软骨组织及其周围的软骨膜构成软骨。
软骨根据基质内所含纤维素成分不同分为透明软骨、弹性软骨、纤维软骨。
软骨染色方法有很多种，例如甲苯胺蓝法、阿利新蓝法、番红O法等。
改良番红0-固绿软骨染色法的染色原理在于嗜碱性的软骨与碱性染料番红O结合呈现红色，嗜酸性的骨和酸性染料固绿结合而成绿色或蓝色，与呈现红色的软骨对比鲜明，从而将软骨组织和骨组织区分开。
番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料，其显示软骨组织是基于阳离子染料与多糖中阴离子基团（硫酸软骨素或硫酸角质素）结合。
番红O着色与阴离子的浓度近似成正比关系，间接反映了基质中蛋白多糖的含量和分布。
当软骨受到损伤时，软骨中的糖蛋白会释放出来，使基质成分分布不均匀，从而导致番红O淡染或不着色。
通过图像分析软件可对番红O染色的软骨基质进行定量分析。
固绿与胶原纤维结合，不宜褪色。
番红O-固绿染色的分化很关键，分化过度易导致切片不着色，分化不足易导致切片着色过深。
产品组成：名称规格5×50ml5×100ml StorageA1:Weigert A液25ml50ml RT避光试剂(A)A2:Weigert B液25ml50ml RT避光临用时，取A1、A2等量混合为Weigert染液，24h后失去染色力，不宜预先配制。
试剂(B):酸性乙醇分化液50ml100ml RT试剂(C):固绿染色液50ml100ml RT避光试剂(D):Safranin O stain50ml100ml RT避光试剂(E):乙酸溶液50ml100ml RT使用说明书1份自备材料：10%福尔马林固定液，脱钙液，蒸馏水，系列乙醇。
操作步骤（仅供参考）：1、标本的处理：10%福尔马林固定、脱钙、石蜡切片。
番红染色原理
番红染色原理番红染是一种常见的染料，它能够被用于染色纺织品、纸张、皮革等材料。
它的染色原理是什么呢？在这篇文档中，我们将详细介绍番红染色的原理及其相关知识。
首先，我们需要了解番红染的化学结构。
番红染是一种有机化合物，其分子结构中含有苯环和酚环。
番红染能够与纤维素材料中的羟基结合，形成氢键或共价键，从而实现染色的目的。
这种结合是非常稳定的，能够使染色效果持久。
其次，我们来谈谈番红染色的原理。
番红染色的过程主要包括渗透、吸附和固定三个阶段。
首先，番红染料需要通过渗透作用进入纤维素材料的内部。
然后，在纤维素材料表面，番红染料会与羟基发生吸附作用，使得染料分子与纤维素材料表面结合紧密。
最后，通过烘干或者其他固定方法，使得染料牢固地固定在纤维素材料上，从而完成染色过程。
在番红染色的过程中，温度、PH值、染料浓度等因素都会对染色效果产生影响。
例如，较高的温度有利于染料分子进入纤维素材料内部，从而提高染色效果。
而不同PH值下，染料与纤维素材料的相互作用也会有所不同，影响染色的结果。
另外，番红染色的原理也与染料分子的结构有关。
番红染料分子中含有许多苯环和酚环，这些结构使得染料分子具有较强的亲水性和亲羟性，从而有利于与纤维素材料发生作用，实现染色的目的。
总的来说，番红染色的原理是通过染料分子与纤维素材料发生作用，实现染色的过程。
这种作用包括渗透、吸附和固定三个阶段，受到温度、PH值、染料浓度等因素的影响。
了解番红染色的原理，有助于我们更好地掌握染色技术，提高染色效果。
希望本文所介绍的番红染色原理能够帮助大家更好地理解染色过程，提高染色技术水平。
番红染色作为一种常见的染色方法，其原理的掌握对于纺织、造纸、皮革等行业都具有重要意义。
通过不断地学习和实践，我们可以更好地应用番红染色技术，为各种材料赋予丰富的色彩。
切片制作方法
切片制作步骤取材与分割→固定→洗涤→脱水→透明→浸蜡和埋蜡→切片→粘片→脱蜡→染色→脱水→透明→封片1、固定液（1）FAA：福尔马林—冰醋酸—酒精50%或70%乙醇90mL+冰醋酸5 mL+福尔马林（37%-40%甲醛）5 mL固定时间最短需10h，一般不低于24h，可兼做保存液幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩。
如材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林；如材料易收缩，可稍增冰醋酸。
久置时可加5 mL甘油，以防止蒸发和材料变硬。
如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果更好：50%乙醇89mL+冰醋酸6 mL+福尔马林（37%-40%甲醛）5 mL（2）卡诺氏固定液：酒精—醋酸—氯仿配方1：纯酒精3+冰醋酸1（3:1）配方2：纯酒精6+冰醋酸1+氯仿3（或纯酒精30 mL +氯仿5 mL +冰醋酸10 mL）一般材料不超过24h，固定根尖和花药只需40-60min，固定后用95%酒精（85%酒精）冲洗，每级20min;如不能立即处理，需转入70%酒精中保存。
2、洗涤：FAA固定液无需洗涤直接脱水。
3、脱水：材料中含水，水与石蜡不能混合，通常由50%、70%、80%、90%、无水乙醇，每次1h，其中无水乙醇需2次。
材料大的需延长脱水时间（一般此后进行预染色）4、透明：常用透明剂为二甲苯和氯仿。
先经乙醇和二甲苯混合液（1/2乙醇+1/2二甲苯），后纯二甲苯（2次），每次1-2h氯仿不宜在染色后透明。
5级进行;1/5氯仿（4/5无水乙醇）→2/5→3/5→4/5→纯氯仿（2次）每级3-4h；最后一次纯氯仿中，放入纯石蜡粉末数次，盖好瓶盖，36℃温箱36h，使材料慢慢浸蜡。
5、浸蜡、包埋：石蜡必须纯净、不含杂质；浸蜡是使石蜡逐渐取代透明剂石蜡:熔点52-56℃，一般50-60℃选用与乙醇和石蜡均能互溶的有机溶剂，如二甲苯，温箱设置高于石蜡熔点2℃25%→50%→75%（石蜡、二甲苯溶液）材料透明好后，换入新的二甲苯，然后加入等体积的碎蜡，40℃温箱，不断加入碎蜡至饱和，然后升温保持3-5h，其间换纯蜡3次，每次约1-2h。
改良番红O-固绿软骨染色液操作步骤及染色结果说明
改良番红O-固绿软骨染色液操作步骤及染色结果说明货号：G1371规格：5×50ml/5×100ml有效期：6个月有效产品简介：软骨组织由软骨细胞、软骨基质和纤维组成，软骨组织及其周围的软骨膜构成软骨。
软骨根据基质内所含纤维素成分不同分为透明软骨、弹性软骨、纤维软骨。
软骨染色方法有很多种，例如甲苯胺蓝法、阿利新蓝法、番红O法等。
改良番红0-固绿软骨染色法的染色原理在于嗜碱性的软骨与碱性染料番红O结合呈现红色，嗜酸性的骨和酸性染料固绿结合而成绿色或蓝色，与呈现红色的软骨对比鲜明，从而将软骨组织和骨组织区分开。
番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料，其显示软骨组织是基于阳离子染料与多糖中阴离子基团（硫酸软骨素或硫酸角质素）结合。
番红O着色与阴离子的浓度近似成正比关系，间接反映了基质中蛋白多糖的含量和分布。
当软骨受到损伤时，软骨中的糖蛋白会释放出来，使基质成分分布不均匀，从而导致番红O淡染或不着色。
通过图像分析软件可对番红O染色的软骨基质进行定量分析。
固绿与胶原纤维结合，不宜褪色。
番红O-固绿染色的分化很关键，分化过度易导致切片不着色，分化不足易导致切片着色过深。
产品组成：名称规格5×50ml5×100ml StorageA1:Weigert A液25ml50ml RT避光试剂(A)A2:Weigert B液25ml50ml RT避光临用时，取A1、A2等量混合为Weigert染液，24h后失去染色力，不宜预先配制。
试剂(B):酸性乙醇分化液50ml100ml RT试剂(C):固绿染色液50ml100ml RT避光试剂(D):Safranin O stain50ml100ml RT避光试剂(E):乙酸溶液50ml100ml RT使用说明书1份自备材料：10%福尔马林固定液，脱钙液，蒸馏水，系列乙醇。
操作步骤（仅供参考）：1、标本的处理：10%福尔马林固定、脱钙、石蜡切片。
番红O-快绿染色
1、0.02%固绿溶液：固绿0.02g，蒸馏水100ml2、0.1%番红O溶液：番红0.1g，蒸馏水100ml3、1%盐酸酒精分化液：弄HCI1份，95%乙醇99份染色1、石蜡切片脱蜡至水2、苏木精染细胞核1-3min，显微镜观察染色情况决定染色时间长短3、自来水充分洗涤，去除残留苏木精。
4、1%盐酸酒精分化15-30s，分化时间视颜色深浅而定。
5、自来水充分洗涤，去除残留染液。
6、0.02%固绿水溶液染色3min，固绿为一种酸性染料，呈碱性细胞质或细胞外基质呈绿色7、1%冰醋酸洗涤切片，去除残留固绿8、0.1%番红O染色3min，番红是一种碱性染料，呈酸性细胞质或细胞外基质呈橙黄/红色。
9、95%乙醇侵洗，洗去残留番红10、95%乙醇、无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。
1、石蜡切片脱蜡至水2、Weigert氏苏木素染色3分钟3、1%盐酸酒精分化4、水洗5、0.2%固绿水溶液内染色5分钟6、水洗7、0.1%番红O水溶液内染色1-2分钟8、水洗9、0.1%醋酸水溶液分化10、水洗11、95%乙醇、无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。
Solutions and Reagents:Weigert's Iron Hematoxylin Solution:Stock Solution A:Hematoxylin ----------------------------- 1 g95% Alcohol ----------------------------- 100 mlStock Solution B:29% Ferric chloride in water ----------- 4 mlDistilled water -------------------------- 95 mlHydrochloric acid, concentrated ---- 1mlWeigert's Iron Hematoxylin Working Solution:Mix equal parts of stock solution A and B. This working solution is stable for about 4 weeks.0.05% Fast Green (FCF) Solution:Fast green, FCF, C.I. 42053 ------------- 0.5 gDistilled water ---------------------------- 1000 ml1% Acetic Acid Solution:Acetic acid, glacial ------------------------- 1 mlDistilled water ------------------------------ 99 ml0.1% Safranin O Solution:Safranin O, C.I. 50240 -------------------- 0.1 gDistilled water ----------------------------- 100 mlProcedure:1. Deparaffinize and hydrate slides to distilled water.2. Stain with Weigert’s iron hematoxylin working solution for 10minutes.3. Wash in running tap water for 10 minutes.4. Stain with fast green (FCF) solution for 5 minutes.5. Rinse quickly with 1% acetic acid solution for no more than 10 –15seconds.6. Stain in 0.1% safranin O solution for 5 minutes.7. Dehydrate and clear with 95% ethyl alcohol, absolute ethyl alcohol,and xylene, using 2 changes each, 2 minutes each.8. Mount using resinous medium.。
实验三 双重染色与永久装片的制作
叶的横切
玉米茎横切
南瓜茎横切
南瓜茎纵切
作业
制作一张合格的双重染色切片，要求薄 （一层细胞）、平整、透明，染色红绿 分明。 简述番红-固绿双重染色的染色原理。
实验三 双重染色与永久 装片的制作
授课教师：郑磊 2008.12.10
实验目的
学习并掌握植物制片的双重染色法 掌握徒手切片制成永久装片的方法
实Hale Waihona Puke 原理番红-固绿对染法，是植物制片中最普遍的一 种二重染色法，其染色程序简单并能清晰地显 示出细胞结构。 番红为碱性染料，能将木质化、角质化、栓质 化的细胞壁，以及细胞核中的染色质、染色体 和花粉外壁等染成红色； 固绿为酸性染料，能使细胞质及纤维素的细胞 壁染成绿色。
实验用具
显微镜、载玻片、盖玻片、单面刀片、 双面刀片、培养皿、毛笔、滴瓶、胶头 滴管、滤纸
实验材料与试剂
实验材料 吊兰茎、蒜苔 试剂 1%番红水溶液、1%固绿酒精溶液
实验方法
徒手切片 将材料切成薄而透明的切片，镜检以选 择较理想的薄片。 染色 将选好的切片置于载玻片中央，加一滴 1%番红水溶液，染色15~20min，用滤 纸吸去染液，再滴蒸馏水洗去浮色。
实验方法
脱水 依次滴少许30% 50% 70% 85% 95%各等级酒精各 10~15s进行脱水，每滴一滴酒 精后用滤纸吸去。 复染 吸去95%酒精后，加一滴1%固 绿酒精溶液，复染5~10s，再滴
实验方法
透明 吸去95%酒精，滴加无水酒 精，然后经1/2无水酒精+1/2二 甲苯 二甲苯（两次）每次 2~3s，使材料完全透明。透明 后保持二甲苯不挥发，盖好盖片， 镜检。 制成永久装片 掀开盖片，滴一滴中性树胶， 再加盖片封片，然后置于
植物组织切片制作以及注意事项
植物组织石蜡切片的制作
1 植物组织石蜡切片的制作方法
⑴固定：用50%或70% FAA固定液,置于4℃固定24 h。
⑵脱水：倒去固定液，蒸馏水洗，加入50%乙醇，室温静置30 min；重复一次，
室温静置20 min。
换成1%番红O溶液(用70%酒精配制)，室温脱水染色过夜。
次日继续脱水酒精浓度梯度和时间依次为：50%2h，80% 乙醇2h、95% 乙醇4h、无水乙醇3h。
⑶透明：1/2无水乙醇+二甲苯混合液1h纯二甲苯2h。
⑷浸蜡：一蜡缸1h，二蜡缸2h，三蜡缸2h。
⑸包埋：按照所要求的面进行包埋。
⑹切片：修整蜡块，用Thermo切片机切片，厚度8-10 μm。
⑺贴片: 在防脱载玻片将切好的蜡带放入温水中，捞至载玻片上，烤片1小时。
⑻脱蜡及染色：
①番红-固绿双染
1、脱蜡：二甲苯（1）10min，二甲苯（2）10 min、二甲苯（3）10 min ，无
水乙醇8 min、、95%乙醇8 min、80%乙醇8 min、70%乙醇8min，蒸馏水洗。
2、番红固绿染色：
苯胺番红约10分钟，95%酒精去浮色，苯胺固绿约2－3分钟，再经95%酒精、无水酒精、1/2无水酒精+1/2二甲苯、二甲苯（两次）各约4—5秒钟。
（9）封片中性树胶封片
结果：厚壁组织、导管、细胞核红色，其余部分为绿色。
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番红固绿染色简化法
----------仅限观察植物苗期主根部导管1目的要求：
由于专业的番红固绿需要使用超薄切片机，其功能繁琐，并十分耗时，其主要包括染色，包埋，切片，脱蜡，复染等多个步骤，这里不再赘述。
若没有切片机，我们往往要四处奔走求人并支付高昂的费用。
经本人亲自实验和总结，采用传统常规染色法，在不使用切片机和钞票的条件下，整理如下流程。
若只作为一般实验的验证，样品的容量不大并不需要长期保存的情况下，不需要超薄切片机，只需使用双层刮胡刀片，显微镜可以观察1毫米左右的切片。
直径最好大于1mm，肉眼可分辨，一般只用于观察主根。
为切片方便，可稍微将根晾干，再进行横切或纵切。
根据对刊用插图(照片)总的要求得出，文稿插图(含照片)的应用以少而精为原则。
凡是能用文字说明的,应尽量不用插图,能用线条图表示的,就不用照片图;能用单色图表示的,就不用彩色图。
即使是线条图也尽量避免搞成大幅的插页图,以便于编排和印刷。
插图的线条必须准确,主次分明,清晰可辨,便于读者理解文字的内容。
若切片够均匀，线条够清晰，也可作为论文插图。
2实验步骤：
2.1实验准备：
2.2材料：目的植物新鲜根部，刮胡刀刀片两片，越锋利越好，但注意安全。
常规染色用品。
2.3试剂：无水酒精，95%酒精，蒸馏水，预先备制的苯胺番红试剂和苯胺固绿试剂（最好放置一段时间，可提前一月配置，效果更好，但不必要），二甲苯和50%体积无水乙醇和50%体积二甲苯混合液。
3实验步骤：
3.1切片：
按照前文介绍方法切片，若视力好，手法稳，可用单个刀片细细切下，要求，横切厚度在1mm左右，并呈透明圆形，确保中心完好。
3.2染色：
1）滴1-2滴无水酒精；
2）吸去无水酒精用95%酒精冲洗，使其平铺于玻片，酒精分散均匀；
3）第1滴蒸馏水与材料上，是材料包裹于水滴中；
4）滴1-2滴苯胺番红试剂，染色1-3min；
5）使用95%酒精冲去浮色并脱水，处理至透明状态，韧皮部分由于富集细胞壁，颜色可以偏红，其余部分为粉色透明状；
6）少量（一小滴）苯胺固绿复染，并迅速吸去，并滴入无水酒精，操作在2s内完成；
7）继续用无水乙醇洗脱至半透明状，以为无集中色斑为佳；
8）各50%体积的无水酒精和二甲苯混合物，1-2滴；
9）滴1-2滴二甲苯透明；
10）擦去材料以外药剂，使玻片清洁，可不使用盖玻片，一定不能使材料山的二甲苯干掉；
11）镜检。
图使用该方法观察到的切片
4实验注意事项：
1刀片尽量锋利，并对齐垂直切下。
切勿将刀片捏握过紧，使其缝隙过小。
2 番红试剂染色时间可适当延长，固绿试剂的染色时间1-2s就将其吸走，迅速滴入无水乙醇。
3 洗脱浮色时将切片中心洗至透明，确保中心部分无染料剩余。
影响观察。
4 镜检前，只吸干切片以外残留的二甲苯，保留材料上的药剂，由于二甲苯的挥发性，在镜灯长时间照射，容易蒸干，影响色泽和透明效果，需及时观察记录。