实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。
如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。
微生物学实验教程
微生物学实验内容实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色实验二 . 细菌的革兰氏染色实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别实验四 . 酵母菌的数量测定实验五 . 酵母菌的大小测定实验六 . 微生物菌落的观察实验实验七 . 霉菌的形态观察实验八 . 培养基的制备与灭菌实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察实验十 . 微生物的纯种分离培养实验一 . 普通光学显微镜的使用一、目的要求1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。
而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。
与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1. 增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。
从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。
2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。
从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α式中α为光线最大入射角的半数。
实验二细菌单染与复染
革兰氏染色
丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 细菌细胞壁的结构
G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质， 故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质， 增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和 碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。 G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽 聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍 保留初染时的紫色。
实验二 细菌简单染色法 革兰氏染色法
一、目的要求
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1．巩固油镜的使用方法； 2．学习微生物涂片、染色基本技术，掌握细 菌的简单染色法； 3．学习、掌握细菌的革兰氏染色法； 4．建立“无菌操作”的概念，学习其技术。
二、实验原理
简单染色法：是利用单一染料对细菌进行 染色的方法，常用碱性染料。只能观察微 生物的大小、形状、和细胞排列状况，但 不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。 复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
革兰氏染色结果及细菌分类
细菌细胞结构
革兰氏染 色阴性
Left: 单菌染色结果 (G+或 G-)
Right: 混合菌染色结果 (G+和 G-)
五、实验结果
文字记录所观察到的革兰氏染色 结果的差别，判断是G－/ G＋。 绘图描述各菌形态（可在一个视 野中）。
六、问题与讨论
1革兰氏染色涂片为何不宜太浓厚？ 实验关键步骤？ 2对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样才能确证你的结论正确？
三、实验材料
变形杆菌、表皮葡萄球菌
载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲 苯、擦镜纸、吸水纸等。 革兰氏染色液一套
细菌单染色及革兰氏染色过程观察
BEIJING SOLARBIO SCIENCE &TECHNOLOGY CO.,LTD细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察1.基本原理（1）简单染色法用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
（2）革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染BEIJING SOLARBIO SCIENCE &TECHNOLOGY CO.,LTD 液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌是微生物中最常见的一类生物，它们广泛存在于自然界的各个角落，包括土壤、水体、空气等。
为了更好地了解细菌的形态和结构，科学家们开展了许多实验，其中包括细菌的简单染色和革兰氏染色。
一、细菌的简单染色实验细菌的简单染色是一种常用的染色方法，通过给细菌染色，可以使其在显微镜下更加清晰可见。
这种染色方法主要使用了一种叫做甲基蓝的染料。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片。
将一根无菌的钢丝棒蘸取一小滴细菌悬液，然后将其均匀地涂抹在玻璃片上。
待涂片干燥后，将其固定在火焰上加热的玻璃柱上，以使细菌附着在玻璃片上。
接下来，将制备好的涂片放入染色盒中，加入适量的甲基蓝染料，浸泡片刻。
然后，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
最后，用纸巾轻轻吸干涂片上的水分，将其放入显微镜下观察。
在显微镜下观察，我们可以清楚地看到细菌的形态和结构。
不同种类的细菌可能会呈现出不同的形状，例如球状、杆状、螺旋状等。
通过简单染色，我们可以更好地观察和研究细菌的特征。
二、革兰氏染色实验革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
这种染色方法主要使用了紫晶染料和碘酒。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片，方法与简单染色相同。
然后，将涂片放入染色盒中，加入适量的紫晶染料，浸泡片刻。
接着，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
接下来，将碘酒滴在涂片上，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
随后，滴入乙醇或酒精醛溶液，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
最后，滴入蓝色染料，浸泡片刻后用蒸馏水冲洗涂片。
在显微镜下观察，我们可以看到细菌的染色效果。
革兰氏阳性菌会呈现紫色或蓝色，而革兰氏阴性菌则呈现红色或粉色。
这是因为革兰氏阳性菌的细胞壁含有较多的胆固醇，可以吸附紫晶染料和碘酒，而革兰氏阴性菌的细胞壁则较薄，无法吸附这些染料。
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色_图文_图文
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？
2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。
2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂
面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的
水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
实验细菌的简单染色与革兰氏染色
掌握简单染色和革兰氏染色的操作方法
简单染色
将细菌涂片或培养物直接与染料混合 ，然后进行观察。操作简单，适用于 初步观察细菌形态。
革兰氏染色
一种特殊的染色方法，通过结晶紫初 染、碘液媒染、酒精脱色和沙黄复染 等步骤，将细菌分为革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌两类。
出版年份：XXXX年
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简单染色方法简便，操作相对容易，但只能显示细菌的形态 和结构，不能提供细菌的种类信息。
革兰氏染色原理
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04
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革兰氏染色是一种常用 的细菌鉴别染色法，通 过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料对细菌进行 染色，能够将细菌分为 革兰氏阳性菌和革兰氏 阴性菌两大类。
革兰氏染色的原理主要 是基于细菌细胞壁的成 分和结构不同，导致对 染料的吸附和着色能力 。
复染
将涂片浸入稀释后的伊 红或沙黄染色液中，染
色一定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除 染色液。
观察
在显微镜下观察染色结 果，判断细菌是革兰氏
阳性还是阴性。
05
实验结果与分析
简单染色结果与分析
染色结果
通过简单染色法，细菌被 染上了不同的颜色，如红 色或紫色。
03
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涂片制备
将细菌均匀涂在载玻片上，晾 干。
染色
将涂片浸入染色液中，染色一 定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除染色液 。
观察
在显微镜下观察染色结果，判 断细菌类型。
革兰氏染色步骤
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涂片制备
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实验二细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察
1.目的要求
（1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。
（2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。
（3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
2.基本原理
（1）简单染色法
用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
（2）革兰氏染色法
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。
3.材料及器材
(1) 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌
(2) 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等
4.方法与步骤
Ⅰ涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。
Ⅱ干燥室温自然干燥。
Ⅲ固定固定时通过火焰2～3次即可。
此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。
Ⅳ染色
（1）简单染色法：
①染色滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。
吕氏碱性美蓝染色1～
2min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约1min。
②水洗倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。
③干燥自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
④镜检涂片干燥后镜检。
（2）革兰氏染色法：
①初染加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。
②媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
③脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。
④复染用番红液染1～2min，水洗。
⑤镜检干燥后，置油镜下观察。
革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
(3) 混合涂片法：
按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
革兰氏染色过程：
5.实验作业
(1)在你所作的革兰氏染色制片
中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各
染成何色？它们是革兰氏阴性菌
还是革兰氏阳性菌？
(2)作革兰氏染色涂片为什么不
能过于浓厚？其染色成败的关键
一步是什么？
当你对一株未知菌进行革兰氏染
色时，怎样能确证你的染色技术
操作正确，结果可靠？。