血小板 抗原抗体检测
血小板免疫荧光步骤
血小板免疫荧光步骤
血小板免疫荧光是一种用于检测血小板表面抗原的实验方法，通常用于诊断自身免疫性血小板减少性紫癜（ITP）等疾病。
下面是血小板免疫荧光的一般步骤：
1. 样本准备，首先需要采集患者的血液样本，通常是静脉血。
采集后应立即进行处理，以避免血小板的活性丢失。
2. 血小板分离，将血液样本离心，分离出血小板。
这通常涉及到多次离心和去除其他细胞成分的步骤，确保最终得到纯净的血小板样本。
3. 标记抗体，选择与目标抗原特异性结合的荧光标记抗体。
这些抗体可以是单克隆或多克隆抗体，用于识别血小板表面的特定抗原。
4. 反应，将标记抗体加入已分离的血小板样本中，使其与目标抗原结合。
这通常需要在适当的温度和时间下进行反应。
5. 洗涤，反应后需要对样本进行洗涤，以去除未结合的抗体和
其他杂质。
6. 检测，将样本置于荧光显微镜下观察，或者使用流式细胞仪
等设备进行荧光检测。
通过荧光信号的强度和分布，可以判断血小
板表面抗原的表达情况。
7. 数据分析，最后需要对荧光检测的数据进行分析和解释，根
据结果判断患者是否存在血小板表面抗原的异常表达，从而辅助临
床诊断和治疗决策。
总的来说，血小板免疫荧光的步骤包括样本准备、血小板分离、标记抗体、反应、洗涤、检测和数据分析等环节，这些步骤需要严
格控制和操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
血小板抗原抗体检测与血小板输注的临床应用
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血小 板 抗 原 抗 体 检 测 与 血 小 板 输 注 的临 床 应 用
蒋利星 （ 西壮 族 自治 区桂 林 市 中心血 站 ５ １ ０ ） 广 ４ ０ １
抗 体 （ Ａ） 包 括 ＩＧ、ｇ ＩＡ 其 中一 项 出 现 阳 性 ， 为 血 小 Ｐ ， ｇ ＩＭ、ｇ 即
板 抗 体 检 测 阳 性 ， 且 其 量 往 往 与 外 周 血 的 血 小 板 数 量 呈 负 而
相关 。
人类 血 小 板 抗 原 系 统 有 多 种 ， Ｐ Ａ、 Ｏ、 ａ Ｙｕ 、 ｒ 如 １ Ｋ Ｂ Ｋ、 ｋ Ｂ 等 ， 中 Ｐ Ａ 系 统 是 最 常 见 的 引 起 新 生 儿 免 疫 性 血 小 板 减 少 其 １ 症 （ Ｉ ） 血 小 板 减 少 性 紫 癜 （ Ｉ 的 抗 原 系 统 ［ 。 有 研 ＮＡ ＴＰ 和 ＰＰ） １ ］ 究发 现 ， １ 等 位基 因 之 一 的 Ｐ Ａ ＰＡ １ ２基 因 与 血 栓 形 成 有 关 Ｌ 。 ２ ］
一பைடு நூலகம்
血小 板 表 面具 有 复 杂 的血 型抗 原 ， 些 抗 原 是 由遗 传 因素 决 定 这
的 。通 常 将 血 小 板 血 型 抗 原 分 为 两 大 类 ， 一类 是 存 在 于 血 小 板 膜结 构 糖 蛋 白上 的特 异 性 抗 原 ， 即人 类 血 小 板 抗 原 （ Ａ） 另 ＨＰ ；
缺 陷 患 者 的 出 血 ， 年 来 在 Ｉ 上 的使 用 日益 普 及 。但 是 部 分 近 临床 患 者 在 多 次输 注 血 小板 后 可 产 生 血 小 板 相 关 抗 体 ， 致 血 小 板 导
血小板抗体检查及配血操作规程
【口的】Capture-?®是设计用来检测血小板IgG抗体的固相系统。
可为血小板输注无效患者进行血小板配血。
【适用范圉】血小板输注无效患者血小板输注前配血【检测原理】Capture-P是一个固相抗体检测系统，是曲Rachel等人4、Juji等人5和Sh让毗&等人6发表的检测过程改良而来。
患者或供体血小板首先结合于聚苯乙烯微孔表面。
然后用它们来捕获患者或供体血浆中的血小板抗体。
血清在结合有血小板的微孔中进行简短孵育，使抗体与血小板结合（如果抗体存在）。
把微孔中游离的IgG 冲洗掉，并加入结合抗IgG指示红细胞。
进行离心，这样会使指示红细胞与结合于固定的血小板上的抗体接触。
阳性检测中，在指示红细胞和结合血小板抗体间形成了抗免疫球蛋口G桥联，从而阻止了指示红细胞向微孔底部的移动。
作为这种桥联的结果，指示红细胞会形成一个汇合单层从而覆盖固定的血小板。
相反，如果是阴性检测，当不存在血小板抗原-抗体反应时，指示红细胞的移动就不会被阻止，就会被离心到微孔底部，进而形成紧密圧缩、清晰的细胞扣。
可以使用事先经过冲洗和保存的血小板，这个步骤是可以选择的。
使用血小板冲洗和储存洛液洗涤血小板，使之不含污染性血浆蛋口和非血小板细胞成分，这样的血小板可以用来制备Capture-P检测微孔的单分子层。
【主要组成成份】Capture-P检测微孔板：1X8微带板，坚硕U型底部，表面覆盖特异性血小板粘合剂。
每个微带板可以进行8个单独的检测。
这些微带板保存于一个可重复性密封的铝箔袋中，铝箔袋中含有干燥剂和湿度计。
微带板可以单使用，也可以多个使用。
未使用的微带板.干燥剂和湿度计要立即谨慎重新密封于铝箔袋中，以免暴露于湿气中使粘合剂失效。
Capture检测微孔的辅助试剂：（另行购买）Capture LISS：低离子强度溶液，含有甘氨酸、漠甲酚紫染料和防腐剂叠氮化钠（0. 1%）* OCapture-P指示红细胞：结合有兔抗人IgG抗体的红细胞悬液。
血小板抗体检测意义
血小板抗体检测意义因血小板抗体引起的临床问题和疾病已引起全社会的严重关注，成为临床亟待解决的问题。
血小板抗体检测（或筛选）包括白细胞特异性和组织相容性抗体和血小板特异性和组织相容性抗体。
白细胞、血小板抗体是引起临床非溶血性发热性输血反应的最主要原因，非溶血性发热性输血反应是临床很常见的输血不良反应，文献报道输注红细胞为2～6％，输注血小板为20~30%，多次输血患者高达27％～63％，而非溶血性发热性输血反应与血小板抗体密切相关,是影响临床安全输血的严重因素。
血小板抗体的检测对于预防和减少非溶血性发热性输血反应非常有意义.（一）输注红细胞悬液：1。
血小板抗体检测阳性患者的非溶血性发热反应明显高于血小板抗体检测阴性患者；血小板抗体检测阳性患者经干预后非溶血性发热反应明显下降。
2。
干预措施：1）建议使用去白的红细胞（血库型或床旁型白细胞滤器）2)建议使用洗涤的红细胞3)使用药物（二）输注血浆：1）输血性急性肺损伤（transfusion related acute lung injury，TRALI)：文献报道，输血后发生的一系列严重呼吸窘迫病，其80%病例输入的血液中含有血小抗体。
研究已经证实：血小板抗体是引起TRALI的重要因素之一.上海市血液中心杨颖教授认为中国免疫性TRALI发病虽少，但严重型较多。
2）不同国家TRALI发生\死亡率UK SHOT 德国丹麦法国加拿大1996-2003 1995 –2002 1999 –2002 1994 –19982000 –2003例数139 101 6 34 21发生率％7 3 7 0-15 0-5死亡率％9 NR NR 20 9 检测患者、供者血液的血小板抗体是可行的、必要的，目的是进一步保证输血安全。
（三）输注血小板临床血小板输注无效发生率为30％～70％,其中免疫因素引起的血小板输注无效约为20%。
血小板抗体是临床引起免疫性血小板输注无效的最主要原因，文献报道20～80％多次输血的患者出现免疫性血小板输注无效，血小板输注无效会导致昂贵的血液和医疗资源的极大浪费,同时给患者造成较大的经济损失和身体损害。
血小板抗体检测 宣传
血小板抗体检测项目（固相凝集法）一、基本原理：血小板抗体检测是检测患者血清中是否存在针对血小板的免疫性抗体，包括三类：1.ABO血型系统和HLA系统产生的血小板相关抗体，2.血小板特异性抗原（HPA）产生的特异性抗体，3.药物所致的血小板抗体二、血小板抗体检测的临床应用(一)在临床辅助诊断中的作用1、特发性血小板减少性紫癜（ITP）：ITP的临床症状很重要，但仍为排除性诊断。
如结合血小板抗体检测，则对ITP的确诊有重要价值。
2、血液系统疾病辅助诊断：对白血病、再生障碍性贫血、骨髓异常增生综合症、溶血性贫血、新生儿血小板减少症有辅助诊断意义。
3、孕期流产风险评估：血小板抗体筛查可对孕期流产风险做出评估，尤其适用于有多次妊娠史、习惯性流产史以及不孕不育情况查因。
（二）在临床输血治疗中的应用1、预防红细胞输注中非溶血性发热反应：血小板抗体阳性患者输注红细胞悬液后发生非溶血性发热反应明显高于阴性者，对于血小板抗体阳性采取干预措施后非溶血性发热反应明显降低，极大提高了输血的安全性。
2、预防血小板输注无效：血小板抗体是引起免疫性血小板输注无效最重要的原因，特别是多次输血后出现的血小板输注无效。
检测血小板抗体对提高血小板治疗效率和保证输血安全有重要意义。
三、血小板抗体检查的筛查对象1、血液肿瘤科病人：评价患者体内血小板抗体水平，辅助诊断血液系统疾病：如白血病、再障、溶血性贫血、血小板减少性疾病、骨髓异常增生综合症。
2、需治疗性输注血小板患者：特别是需多次输注血小板患者，建议提前筛查血小板抗体，防止血小板输注无效。
3、妇产科孕检：评价孕期流产风险，尤其适用于有多次流产史患者查因。
四、血小板抗体在临床病例中的验证。
血小板抗体(固相凝集法)检测标准操作规程
1目的为规范血小板抗体检测操作，保证检测的有效性及临床用血的安全性，依据《输血实验室管理规程》4.19.4条款的要求制定本规程。
2适用范围适用于医疗机构输血科（血库）进行血小板抗体检测。
3职责医疗机构输血科(血库)技术人员负责血小板抗体的检测。
4原理微孔板反应孔中包被有抗血小板单克隆抗体（针对血小板表面糖蛋白IIb/IIIa、Ib/V/IX），血小板悬液经离心洗涤后可在反应孔底部表面形成血小板单层。
加入受检血清或血浆，在孔中经过孵育后，若该血清或血浆中含有血小板抗体，则该抗体和反应孔中的血小板单层结合，未结合的成分通过洗涤被去除。
加入抗IgG及IgG致敏红细胞（指示红细胞），经离心后指示红细胞通过抗IgG的桥连与血小板单层上的血小板抗体结合，因此阳性反应为指示红细胞黏附在反应孔底部表面，而阴性反应为指示红细胞在离心力的作用下聚集于反应孔底部中央。
5设备与材料5.1材料血小板抗体检测试剂盒（固相凝集法）、血小板抗体筛检细胞（冻干粉）、血小板抗体检测用指示红细胞（固相凝集法）。
5.2设备平板离心机、血型血清学专用离心机、电热恒温水浴箱。
6检测环境室温应控制在18-25℃，湿度应控制在30%-70%。
7操作步骤7.1血标本采集及处理7.1.1检测样本准备7.1.1.1采集患者静脉血2ml，乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）或枸橼酸钠抗凝，经3000rpm离心5分钟，分离出血浆进行检测。
7.1.1.2如果患者血标本为如果患者血标本为不抗凝血，经3000rpm离心5-10分钟，取上清进行检测。
7.1.1.3如果患者血标本为血浆（血清），3000转离心5-10分钟。
7.1.2血标本处理样本4℃可保存7天。
若需长期保存，应离心后分离血清或血浆，－20摄氏度冻存。
7.2平衡室温取出血小板抗体检测试剂盒（固相凝集法）、血小板抗体检测用指示红细胞（固相凝集法）、血小板抗体筛检细胞（冻干粉）放在室温中平衡至室温。
7.3制备血小板悬液7.3.1商品化的冻干血小板稀释后直接使用。
医院检验中心血小板抗体测定PAIgGPAIgMPAIgA操作规程
医院检验中心血小板抗体测定（PAIgG，PAIgM，PAIgA）操作规程
（1）试剂
1）鼠抗人IgG多抗 cat NO 0279 蒸馏水复溶后分装，每支50ul，置-30℃贮存
2）鼠抗人IgM多抗 cat NO 0285 同上3）鼠抗人IgA多抗 cat NO 0278 同上4）FITC羊抗鼠荧光单抗 cat NO 0279 按说明书复溶，置-30℃贮存
（2）方法
血小板固定：取富含血小板的血浆0.4ml加1mlTEN缓冲液中。
再取上述稀释血浆0.4ml加等量2%的多聚
甲醛，室温固定15分钟。
洗涤：在已固定的血小板试管中加2mlTEN缓冲液，3000转/分，离心5分钟，洗涤2次。
弃上清液，加TEN
缓冲液0.4ml。
测定：测定管中分别加入IgG、IgM、IgA单抗50ul，将固定血小板50ul分别加入测定管和对照管。
室温
20分钟，用2mlTEN 3000转/分离心5分钟洗涤一
次后，再加0.6mlTEN。
上机：用各自的阴性对照。
阴性对照值在1.0左右，计数1万个血小板。
( 3 ) 参考范围
PAIgG 6.3-20.3%
PAIgM 2.6-14.5%。
血小板抗体常用的检测方法
血小板抗体常用的检测方法
嘿，咱今儿就来唠唠血小板抗体常用的检测方法。
你说这血小板抗体啊，就像是身体里的小调皮鬼，得把它们给找出来才行呢！
先来说说这酶联免疫吸附试验吧，这就好比是个超级侦探，能把那些隐藏的血小板抗体给揪出来。
它通过一些巧妙的反应和检测，让抗体无处可逃。
你想想，就像是在一个大迷宫里，这个试验就是那个能找到正确路径的指南。
还有这固相红细胞吸附试验呢，它就像是个精准的捕捉器。
血小板抗体一旦出现，它就能紧紧抓住，绝不放手。
就好像是个厉害的猎人，等着猎物上钩呢。
淋巴细胞毒试验也不能小瞧呀！它能像个敏锐的检察官一样，仔细检查每一个可能有问题的地方，不放过任何一个可疑的血小板抗体。
这可真是厉害得很呢！
流式细胞术呢，就像是个高科技的扫描仪，快速又准确地扫描着，把那些血小板抗体都给识别出来。
它可真是个厉害的角色呀！
咱再想想，要是没有这些检测方法，那得有多麻烦呀！医生们就像是在黑暗中摸索，不知道该往哪里走。
但有了这些方法，就像是点亮了一盏盏明灯，指引着前进的方向。
你说这些检测方法是不是很重要？它们就像是身体的卫士，守护着我们的健康。
我们得感谢那些发明和完善这些方法的科学家们，是他们让我们能更好地了解自己的身体。
所以呀，可别小看了这些血小板抗体常用的检测方法，它们可是在背后默默为我们的健康努力着呢！这就是关于血小板抗体常用检测方法的事儿，咱可得记住啦！。
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自身 抗体
被动同种异体免疫 性血小板减少症
移植相关同种异体 免疫性血小板减少 症
自发性血小板减少 症
继发于母体自发性 血小板减少症
HLA / HPA 抗 体
HPA1b(78%), HPA5b(19%) HPA-2,3,4(3%),HPA-15,HPA-9bw, AntiCD36 HLA-I抗体50~80% 17~25%(日本人为 HPA-2b), HPA-15, anti-CD36 HPA-1a,HPA-1b,HPA-2b,HPA-3a,HPA3b,HPA-15, anti-CD36 HPA-1a,HPA-5b
血小板抗原抗体
广州医科大学附属第五医院 输血科
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目录
血小板抗原 血小板抗体 抗体检测及交叉配血
血小板相关疾病
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血小板抗原
❖ 血小板抗原泛指存在于血小板膜的能够刺激机体产生抗体, 并能与之结合的血小板膜蛋白质和糖分子.
❖ 血小板相关抗原: 红细胞血型抗原：ABO、Lewis和P系统抗原等，无RH抗原 白细胞抗原：HLA抗原
筛选基因型相容的供者 避免血小板抗体的产生
采取预防和治疗措施 避免流产、出血等
减少血小板输注无效 避免紫癜、出血和死亡
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血小板抗原定型
HPA-1 HPA-2 HPA-3 HPA-4 HPA-5 HPA-15 a ba ba b a b ab a b
阳性对照条带 等位基因条带
1bb
2ab
3bb
4aa 5aa 15aa
❖ 血小板特异性抗原（human platelet antigen，HPA）
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血小板抗原
血型抗原：ABO、Lewis和P系统抗原等，无RH抗原 ❖ 来源：血小板表面的A、B抗原来源主要有两个：大部分是血小板本身所
固有（从巨核细胞分化而来）；小部分是从血浆吸附而来。如体外将O 型血小板和A或B型血清温育，血小板就会带上A或B抗原。 ❖ 不同个体间血小板膜ABH抗原量存在差异; ❖ 同一个体的每一个血小板抗原量差别非常大，由此可以解释有些人输入 ABH不相容血液后,一部分输入的血小板迅速被破坏,而另外的血小板其 生命力不受影响.
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血小板相关疾病
临床上由于血小板血型抗原引起的血小板减少 症主要有5种：
1. 血小板输注无效（PTR） 2. 输血后紫癜（PTP） 3. 新生儿同种免疫血小板减少症（FMAIT/NAIT） 4. 被动免疫血小板减少症（PAT）
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血小板抗体检测 血清学
❖ ELISA法(酶联免疫试验) ❖ 血小板抗原单抗特异性固相化法(MAIPA) ❖ 固相血小板免疫血清学试验(SPISA) ❖ 简易致敏红细胞血小板血清学试验(SEPSA) ❖ 流式细胞仪 ❖ 改良抗原俘获(ELISA) ❖ 免疫荧光试验
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简易致敏红细胞血小板血清学试验 SEPSA
❖ 主要位于人血小板膜的一大类抗原,称之为血小板 特异性抗原
❖ 高频率抗原以“a”表示，低频率抗原以“b”表示
❖ 人血小板同种抗原（HPA）自1959年被发现以来， 迄今已经检出24个抗原，其中HPA-1，-2，-3，-4 ，-5，-6,-15被血小板命名委员会（PNC）列入抗 原系统，包含14个对偶抗原，而HPA-7-14，-16,-
血小板谱细胞 （三人份O型混合血小板）
50μl/孔
50g,5min离心 洗涤3次
患者血清/血浆 50μl/孔
阳性 水浴 洗30涤m5i次n
反应板 （已包被血小板单抗）
血小板单层
阴性
指示红细胞 （人IgG致敏红细胞）
抗人IgG 各50μl/孔
200g,5min离 心
200g,5min离 心
阳性反应
阴性反应
HPA-1a,HPA-3,HPA-5b
其它抗体 抗GPⅡb/Ⅲa抗体
极少数为ABO抗体 少数为抗GPIa/IIa抗 体
多数位于GPⅡb/Ⅲa GPIb/IX/V，少数位 于 GPIV/V 和 GPIa/IIa
同上
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抗体检测及交叉配血
抗原定型
血小板相容性检测 抗体检测
交叉配型
建立血小板供者库
诊断血小板免疫性疾病 筛查血小板相容性供者
❖ GPⅡb（CD41）是跨膜蛋白，细胞外116 kD的重链，通过 二硫键与22 kD的轻链共价结合。GPⅡb上携带 HPA-3和 HPA-9bw；
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血小板抗体
抗体 分类
疾病
同 种 格兰茨ห้องสมุดไป่ตู้血小板功 抗 体 能不全病
同种 异 体抗 体
新生儿同种异体免 疫性血小板减少症
血小板输注无效症
血小板输血后紫癜
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简易致敏红细胞血小板血清学试验 SEPSA
▪ 直接测定法
血小板表面结合血小板抗体的测定
▪ 间接测定法
血清内抗血小板抗体的测定
▪ 交叉配血试验
选择配合的血小板供体
▪ 质量控制
阴阳性对照
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ELISA法(酶联免疫试验)
单克隆抗体免疫固定血小板抗原方法（MAIPA）：该法先制备羊抗鼠IgG包被 的多孔板，另外，将鼠抗人血小板糖蛋白单克隆抗体和带有抗体的血小板共 同孵育，再将孵育后的复合物加入多孔板，孵育，洗涤，最后加入酶联羊抗 人抗体和酶反应底物后显色，定量测定血小板抗体。
17因为对偶抗原未检出而未达到系统命名标准。
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血小板抗原
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血小板抗原
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血小板抗原
❖ 24个抗原主要分布在糖蛋白GPⅡb，GPⅢa，GPⅠb，GPⅠa 以及CD109上 ；
❖ GPⅢa（CD61）携带9种HPA抗原，分别为HPA-1，HPA-4， HPA-6bw，HPA-7bw，HPA-8bw，HPA-10bw，HPA-11bw， HPA-14bw，HPA-16bw
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血小板抗原
❖ 白细胞抗原：HLA抗原 ❖ 血小板存具有HLA-Ⅰ类抗原类抗原，主要是HLA-A
和HLA-B位点的抗原（少量表达的HLA-C抗原）。 ❖ HLA-Ⅰ类分子为血小板的固有蛋白，少量从血浆中
吸附。血小板HLA抗原的免疫原性比白细胞弱。
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血小板抗原
❖血小板特异性抗原（human platelet antigen， HPA）
血清学定型
➢ 即用已知特异性抗体检测血小板血型抗原
➢ 缺点：特异性抗体来源困难
---人血清中血小板抗体通常为多特异性
---单克隆抗体匮乏，目前国际上仅有HPA-1a单抗，
无其它HPA单抗。
基因定型
➢ 限制性片段长度多态性分析（RFLP）
➢ 序列特异性寡核苷酸聚合酶链反应(PCR-SSO)
➢ 序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)