生物技术药物的免疫毒性和免疫原性
生物药物安全性评价
生物药物安全性评价生物药物是基于生物技术的药物，主要包括蛋白质药物、基因治疗药物和细胞治疗药物等。
这些药物具有高度的特异性和活性，可以治疗多种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病等。
然而，与传统的化学药物相比，生物药物的安全性评价更为复杂，需要考虑许多因素。
本文将对生物药物安全性评价的相关内容进行分析和总结。
1. 生物药物安全性评价的主要内容生物药物安全性评价涉及许多方面，主要包括以下几个方面：1.1 毒性研究毒性研究是生物药物安全性评价的重要组成部分。
它主要评估药物在体内的毒性及其对组织和器官的影响。
包括急性毒性、慢性毒性、致突变性、致癌性等。
在毒性研究中，需要进行的实验包括体内实验和体外实验。
体内实验包括常规的动物实验，例如小鼠、大鼠、猴子等。
而体外实验一般采用细胞实验或人血清。
1.2 免疫原性评价免疫原性评价是生物药物安全性评价的另一个重要方面。
药物在体内可能会引起免疫反应，包括过敏反应、免疫抗原性和免疫抑制作用等。
在免疫原性评价中，首先需要对药物进行免疫学检测。
免疫学检测包括抗体检测和细胞免疫检测。
通过检测抗体水平或细胞免疫反应，可以评估药物的免疫原性。
1.3 稳定性评价稳定性评价是生物药物安全性评价的另一方面。
由于生物药物具有活性，因此需要考虑药物的稳定性。
包括温度、离子强度、pH值等等因素的影响。
药物在运输和储存过程中，需要考虑温度和湿度等因素的影响。
稳定性评价包括物理稳定性和化学稳定性。
物理稳定性评价主要考虑药物的杂质含量、颗粒度和输液过滤性。
化学稳定性评价主要考虑药物分解和降解等。
1.4 药代动力学和药效学评价药代动力学和药效学也是生物药物安全性评价的重要方面。
药代动力学评价主要关注药物在体内的药代动力学行为。
药效学评价主要考虑药物的治疗效果和其与体内靶点的相互作用。
药代动力学评价主要包括药物的吸收、分布、代谢和排泄等方面。
这些方面对药物治疗效果、毒性和免疫原性都有着重要影响。
药物的免疫原性分析方法浅析
药物的免疫原性分析方法浅析摘要：药物的免疫原性评价是临床安全性评价的重要组成部分，药物引起的抗体反应会影响药动学、药效或毒性反应。
ADA的产生会缩短或延长药物半衰期，改变药物在体内的生物分布。
免疫原性的分析在复杂的血清基质中进行，涉及到多学科多领域。
分析方法及检测水平也存在不一致的情况，需要规范实验操作，提高检测的有效性。
免疫原性评价是药物开发阶段中安全与疗效评价的需要，也是申报提交的关键要素。
开发有效的免疫原性检测方法意义重大。
关键词：免疫原性，MRD，方法学验证正文免疫原性通常是指治疗性蛋白和/或代谢物诱发其自身或相关蛋白的免疫应答或免疫相关事件的能力。
一般分子量越大免疫反应越强。
分子量低于4000时一般不具有免疫原性，在4000到10000之间时具有弱免疫原性，分子量大于10000时具有强免疫原性。
但是也有例外要根据物质的结构决定。
免疫原性分析必须在临床前和临床阶段均开展。
具有免疫原性的物质可能诱发机体产生有害的免疫反应，甚至威胁生命。
免疫原性评价需要有效特异的检测方法。
在临床前便需要确定检测方式，在方法的设计、开发和验证中需要严格控制各环节。
临床前和临床中样本的检测需使用经过严格验证的方法进行检验。
目前应用较广泛的是平台主要包括ELISA、ECL、RIA和SPR。
检测方法一般为夹心法、间接法或直接法。
免疫原性方法学的开发要考虑多种因素，主要包括反应模式的选择、包被抗原浓度的选择、包被条件的选择、封闭条件的选择、样品稀释液的选择、最小稀释度（MRD）的选择、酶稀释液的选择、显色液时间的选择以及各条件的孵育时间及温度的选择。
每个反应步骤都会影响方法的性能。
阳性抗体的质量直接影响方法的灵敏度。
阳性抗体需要稀释在与待检样本一致的空白动物血清中。
由于基质的复杂性，在很大程度上会增加检测背景，需要优化各反应条件将背景降低。
对于背景的高低无确定的要求，但是背景越低越好，太高的背景也会影响检测灵敏度。
开发过程中要优先考虑灵敏度和耐药性，其次为精密度、选择性、特异性、稳定性。
免疫原性及其在药物研发中的应用
免疫原性及其在药物研发中的应用免疫原性，指的是一种物质引起人体免疫系统的反应。
在药物研发中，了解一种化合物的免疫原性是非常重要的。
因为高度免疫原性可能导致不良反应，甚至危及生命。
本文将探讨免疫原性及其在药物研发中的应用。
一、免疫原性的定义及机制免疫原性指的是一种物质能够激发人体免疫系统产生的免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫反应。
人体免疫系统中存在一些特殊的细胞，如T细胞和B细胞，它们能够识别和攻击免疫原性分子。
而免疫原性分子可以是各种生物分子，包括蛋白质、多肽、糖等。
免疫原性的机制是通过抗原递呈细胞将抗原分子呈现给T细胞，激活T细胞后再产生抗体或激活其他免疫细胞，最终引起免疫反应。
不同的抗原会被不同的抗原递呈细胞处理，进而激活不同的T细胞，从而诱导不同类型的免疫反应。
二、免疫原性与药物研发在药物研发中，免疫原性是一个重要的评价指标。
过高的免疫原性会导致药物的不良反应和副作用，甚至会危及患者的生命。
因此，在药物研发的早期阶段，就需要对药物的免疫原性进行评估。
药物的免疫原性评估可以通过体外和体内实验来进行。
体外实验主要包括体外免疫原性试验和各种体外细胞毒性试验。
体外免疫原性试验包括T细胞识别试验、淋巴细胞增殖试验等，可以检测药物对人类T细胞的影响。
各种体外细胞毒性试验则可以评估药物对人类细胞的毒性。
体内实验则包括小鼠、大鼠和猴子等动物实验。
通过体内实验，可以评估药物的免疫原性和安全性，并且可以观察到药物对动物免疫系统的影响，从而预测其在人体内的效果。
然而，动物实验也存在一些限制，例如动物模型与人体免疫系统的差异等。
三、药物研发中的免疫原性管理在药物研发过程中，要对免疫原性进行有效的管理，以确保药物的安全性和有效性。
下面是一些管理策略：1. 设计合适的药物分子结构。
药物分子的结构对其免疫原性有很大影响。
化学家可以设计出较低免疫原性的分子结构，从而降低药物的免疫原性。
2. 选择合适的动物模型。
在药物研发的早期阶段，需要选择合适的动物模型进行实验。
生物技术制药期末复习
名词解释1.Cassette mutagenesis:盒式突变（cassette mutagenesis)，又称片段取代法（DNA fragment replacement)，利用目标基因序列中适当限制酶切位点，插入各种合适的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定DNA片段2.DNA shuffling:DNA改组(DNA shuffling)将DNA拆散后重排, 一种模仿自然进化的体外DNA重组的新技术. 这种方法不仅可以对一种基因人为进化, 而且可以将具有结构同源性的几种基因进行重组, 共同进化出一种新的蛋白质. 在实验室中把DNA改组与有效的筛选方法结合起来可为多领域的应用快速进化基因.3. Yeast centromeric plasmid：酵母着丝粒载体，一种在YRp质粒结构基础上增加了一段来自酵母染色体着丝粒DNA片段的载体4.yeast artificial chromosome酵母人工染色体型载体，具有酵母染色体的主要构件包括酵母染色体自主复制序列(ARS)、着丝粒序列(CEN)和端粒序列(TEL)。
5. Inclusion Bodies6. Refolding：7.Interferon：干扰素是由多种细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白8.Interleukin:白细胞介素(interleukin，IL),简称白介素:是由多种细胞分泌的一类具有免疫调节活性的细胞因子。
这类物质主要是由白细胞合成，且主要介导白细胞间的相互作用。
一类低相对分子量的蛋白多肽，通常由一个或几个基因表达合成9. Antisense technology：反义技术(antisense technology)是采用反义核酸分子(人工合成或生物合成的DNA或RNA，它们能与DNA、RNA互补)抑制、封闭或破坏与疾病发生相关的靶基因表达的一种手段10.siRNA :RNAi是一个依赖ATP的过程，在此过程中，dsRNA (外源或内生)首先被降解为具3’端有2～3nt突出、长21～23bp 的小分子双链RNA，这种RNA称为小干扰RNA(siRNA)。
生物类似药研发与评价技术指导原则(试行)
生物类似药研发与评价技术指导原则(试行)生物类似药的研发与评价技术指导原则（试行）近年来，生物药快速发展并在治疗一些疾病方面显示出明显的临床优势。
随着原研生物药专利到期及生物技术的不断发展，生物类似药的研发有助于提高生物药的可及性和降低价格，满足群众用药需求。
为规范生物类似药的研发与评价，推动生物医药行业的健康发展，制定本指导原则。
生物类似药的研发与评价应当遵循本指导原则，并应符合国家药品管理相关规定的要求。
本指导原则所述生物类似药是指在质量、安全性和有效性方面与已获准注册的参照药具有相似性的治疗用生物制品。
生物类似药候选药物的氨基酸序列原则上应与参照药相同。
对研发过程中采用不同于参照药所用的宿主细胞、表达体系等的，需进行充分研究。
本指导原则适用于结构和功能明确的治疗用重组蛋白质制品。
对聚乙二醇等修饰的产品及抗体偶联药物类产品等，应慎重考虑。
本指导原则所述参照药是指已获批准注册的，在生物类似药研发过程中与之进行比对试验研究用的产品，包括生产用的或由成品中提取的活性成分，通常为原研产品。
研发过程中各阶段所使用的参照药，应尽可能使用相同产地来源的产品。
临床比对试验研究用的参照药，应在我国批准注册。
对比对试验研究需使用活性成分的，可以采用适宜方法分离，但需考虑并分析这些方法对活性成分的结构和功能等质量特性的影响。
按生物类似药批准的产品原则上不可用作参照药。
生物类似药研发是以比对试验研究证明其与参照药的相似性为基础，支持其安全、有效和质量可控。
每一阶段的每一个比对试验研究，均应与参照药同时进行，并设立相似性的评价方法和标准。
研发可采用逐步递进的顺序，分阶段证明候选药与参照药的相似性。
根据比对试验研究结果设计后续比对试验研究的内容。
对前一阶段比对试验研究结果存在不确定因素的，在后续研究阶段还必须选择敏感的技术和方法设计有针对性的比对试验进行研究，并评价对产品的影响。
生物类似药的研发和评价应当遵循一致性原则。
生物技术制药重点及名词解释
生物技术制药第一章绪论★生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类✦按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)✦按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰（RNAi）药物、基因治疗药物✦按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG）化多肽或蛋白质药物★生物技术药物的特性✦理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差✦药理学作用特性:活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性✦生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染✦质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定（原液、半成品及成品检定等等)第二章基因工程制药蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性（一般不进行常规的遗传毒性实验）；药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法:构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰（降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节♦上游阶段:制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞♦下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞➢酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端➢1U核酸内切酶的酶活性:指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量➢影响限制性内切酶反应的因素：♦DNA样品的纯度：♦DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。
盘点生物技术药物研发的几大特点
盘点⽣物技术药物研发的⼏⼤特点当前，⽣物技术药物已经成为了全球炙⼿可热的新药研发领域，2019年全球销售Top10的药品中，7个即为⽣物技术药物。
近年来，⽣物技术药物在全球在研药物整体中的⽐例逐年上升，有数据显⽰，预计到2022年，全球⽣物技术药物市场将达3260亿美元。
⽣物技术药物美迪西全球众多国家纷纷重点投⼊于⽣物技术药物的研发，美迪西⽣物药临床前研究业务板块拥有成熟的技术平台及丰富的成功案例。
公司陆续建成了抗体药物⼀站式研发外包产业化平台、⽣物技术药物⾮⼈灵长类安全评价专业技术服务平台、⾮⼈灵长类动物实验研究技术服务平台、同位素代谢研究专业技术服务平台等⽤于⽣物技术药物研发的技术平台，可以快速⾼质量开发⽣物技术药物。
应⽤上述技术平台，公司在抗体药物偶联物（ADC）及疫苗、激素、多肽、单抗等⽣物药领域具有丰富的临床前研究经验，且相应研究数据资料成功通过了药物监管部门的临床试验申请。
⽬前⽣物技术药物是具有巨⼤投资价值的医药细分领域，⽣物技术药物⽆疑是当前和未来⼀段时间制药⾏业的热门领域。
然⽽⽣物药与传统的⼩分⼦化药相⽐各⽅⾯更具复杂性。
类型多样，形式复杂随着⽣物技术药物发展的⽇新⽉异，⽣物技术药物越来越呈现多样化的趋势，除了抗体类药物、重组蛋⽩药物、多肽药物、核酸药物等分⼦类型的药物外，还有近⼏年炙⼿可热的CAR-T、溶瘤病毒等细胞基因治疗类药物等。
抗体药物不仅只有传统的单抗药物，还有抗体⽚段药物以及双特异性抗体药物，甚⾄还有多特异性抗体药物，双或多特异性抗体的靶点多样，关键结构的组成形式也复杂多变；如重组蛋⽩药物有着不同的重组融合形式，还可以有不同的药物修饰形式，不同形式的修饰也会引起药物的吸收代谢与功效等的不同；细胞基因治疗药物近年的研发热潮风靡全球，除了以CAR-T形式出现以外，还在此基础上出现CAR-NK、TCR-T等形式的药物，不仅溶瘤病毒成为了热点，⽽且溶瘤菌也成为了重要的创新药物形式，可谓形式复杂多变。
生物医学材料的体外和体内评价
生物医学材料的体外和体内评价生物医学材料是指应用于医学领域的各种材料，如生物可降解材料、生物非降解材料和配有功能模块的生物材料等。
医疗器械、坐垫、牙齿修复剂、人造器官和组织以及医学诊断试剂都与生物医学材料有关。
这些材料在体内或体外的使用需要进行评价，以确保其安全可靠，本文将对其体外和体内评价进行探讨。
体外评价生物医学材料的首要评价是体外评价。
体外评价是通过一系列实验手段，评估材料的基本性能、血液相容性、细胞毒性、抗微生物性、强度、尺寸稳定性、生物附着性和免疫原性等方面的性能。
基本性能：主要评估生物材料的形态、组织形态、材料表面形貌和化学成分等方面的基本性能。
血液相容性：血液相容性是衡量生物材料血液接触时对血液组织的兼容性能力，主要包括血小板覆盖率、血液免疫反应、溶血反应等观测指标。
细胞毒性：通过体外试验，通常采用细胞生长、细胞毒性和细胞增殖等指标，评估材料的细胞毒性和生物兼容性。
抗微生物性：微生物感染是生物材料在体内最常见的困扰之一。
在体外评价中，可以使用多种方法和技术，比如盘溶区域法、病原菌抑制区域法等，评估材料的抗菌能力和抗微生物能力。
强度和尺寸稳定性：这一方面主要衡量材料在应力下的变形强度和尺寸稳定性，以确保其在应用过程中的稳定性和安全性。
生物附着性：生物附着性评估材料表面对生物组织的附着特性，比如细胞黏合力等。
免疫原性：生物材料在体内引起不良反应的原因之一是其免疫原性。
在体外评价中通过一系列实验手段评估材料的免疫原性，主要包括静态胚胎致死试验、L1210细胞毒性试验和淋巴细胞转化试验等。
体内评价体内评价是评估生物材料真正作用的重要方法，在体内试验过程中，需要能够在体内模拟仿真实际病情和实际操作环境，评估生物材料的作用和效果，因此对体内评价系统的开发是至关重要的。
体内评价主要对生物材料的可降解性、降解产物、抗菌性能、生物相容性、生物附着性、炎症反应程度和再生能力等方面进行评估。
可降解性：生物材料的可降解性影响其应用范围和使用环境，体内评价中通过在实验生物体中观察材料的降解情况和降解后的产物，评估材料的可降解性和降解产物对生物组织的影响。
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(4) 适应症:如用于抗HIV药物
(5) 药理作用：常对免疫系统有影响
常规的免疫毒性检测结果
—引流淋巴组织检查
Ａ
Ｂ
图 猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后回肠粘膜下集合淋巴小结 Ａ：对照组，Ｂ：高剂量组
抗感染或抗肿瘤发生（整体，必要时）
注：GPMT与人一致性约70%，LLNA约72%
额外的免疫毒性试验方法
• 免疫表型检测 常用流式细胞仪检测，检测表达水平和比例
Surface marker
sIg+
Thy 1.2+ or CD3+ CD4+CD8CD8+CD4CD8+CD4+
PanB cells
Pan T cells、 T Helper/delayed-type hypersensitivity cells T Suppressor-cytotoxic cells Immature T cells
• 但在规范及指导原则方面，缺乏共识，实验方法也不统一
免疫毒性研究内容一
• 常规的免疫毒性指标包括：
白细胞总数及其分类计数 球蛋白和白/球比值 补体水平 淋巴器官/组织的大体解剖 胸腺和脾脏的器官重量 免疫病理：胸腺、脾脏、引流淋巴组织
免疫毒性研究内容二
• 额外的免疫毒性试验（additional studies），如
分子结构，蛋白质＞多糖＞核酸＞类脂 宿主因素、免疫方式
免疫原性研究意义
• 免疫原性影响重复给药毒性试验结果的分 析：中和药物活性、改变药物的清除、半 衰期和组织分布 （neutralize drug activity and alter drug clearance, plasma half-life, and tissue distribution） • 建立免疫分析方法，供临床试验应用
免疫功能检测
—分泌IFNγ细胞
图
猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后外周血p24特异性的分泌IFN－γ的淋巴细胞数量
免疫细胞表型检测
—CD22阳性比例
16
CD22 %
14 12 10 8 6 4 2 0 Control 25mg/kg 75mg/kg 225mg/kg 12周 恢复期4周
阳 性 细 胞 比 例 （ ）
• 免疫毒性
是指受试品引起免疫抑制或增强、过敏反应或自 身免疫反应，可能与药理活性相关（如抗排斥药 物）或不相关（如部分抗肿瘤药物）。 • 免疫原性
指药物刺激机体形成特异性抗体或致敏淋巴细胞 的性质。
研究意义
• 意义重大：如 免疫抑制，感染↑，肿瘤↑ 免疫增强，放大自身免疫反应或过敏反应。
免疫原性，是药物本身具有的性质，有免疫原性不一定导 致毒性，但可以影响对药物毒性、毒代或药效的客观评价。
免疫毒性靶器官的分析线索
• 靶分子在免疫器官或组织的分布
• 受试品或其代谢产物的分布
• 相关指标的变化
—常规免疫指标、细胞因子变化等。
免疫毒性机制推测
• 受体或药靶直接引起的毒性反应（on-target)
—如干扰素引起骨髓抑制 • 受体或药靶介导的间接毒性反应
—如rhIL-12能诱导干扰素的分泌
• 常规阶梯或分层或标准试验组合不一定合理，需个
体化
额外的免疫毒性试验方法
• 免疫功能检测
Macrophage/Neutrophil NK TDAR CTL Cytokines 荧光标记的胶珠观察 phagocytosis等 反映天然免疫功能 SRBC or 钥孔血蓝蛋白 (KLH），用ELISA等 51Cr释放法，ELISPOT法 ELISA法及胞内细胞因子检 测
常规的免疫毒性检测
—免疫抑制/增强
• 全血细胞变化、白细胞变化或淋巴细胞变化等。 • 免疫器官重量改变或组织学检查显示相关器官或 组织细胞密度变化 • 血清免疫球蛋白变化 • 用药组感染发生率升高 • 用药组肿瘤发生率增多(除遗传毒性、激素效应或 肝酶诱导外)
额外的免疫毒性试验内容
• 免疫功能检测
生物技术药物的免疫毒性和免疫原性 研究
生物技术药物
• 生物技术药物 包括体内诊断、治疗与预防用途； 来源于细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞
蛋白质、多肽及其衍生物、核酸
如细胞因子、生长因子、融合蛋白、酶、激素、单抗、载 体等
• 特殊性
结构、生产工艺、保存条件、同源性、作用靶点明确等固 有的特点
免疫毒性/免疫原性
图食蟹猴静脉注射SM03源自合抗体后CD22标记阳性细胞率的变化
免疫细胞表型检测
—CD4/CD8比例
1.8 1.6 1.4 1.2
CD4/CD8
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 对照组 低剂量 中剂量 高剂量
比 例
图 猕猴iv 4周 LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例
免疫毒性试验结果分析
• 非特异机制
—如rhTNK-tPA引起肝细胞剂量依赖性的脂肪变 性。
免疫原性研究内容
• 免疫原性(immunogenicity)
指诱导宿主产生免疫应答的能力，具有这种能力的物质称 为免疫原(immunogen）。产生特异性抗体或致敏淋巴细 胞能力。
• 影响因素
分子大小，10 000，5 000～10 000，1000 ～5000
如T细胞依赖的抗体反应、NK细胞活性、 CTL活性、细胞因子表达、巨噬细胞/中性 粒细胞功能、皮肤超敏反应、宿主抵抗力 研究） • 免疫表型检测 依据免疫学理论和具体靶分子种类
额外的免疫毒性试验方案
• 增设卫星组、增加免疫学指标或改变给药方案等。
• 发育免疫毒性：在成年动物中发现免疫抑制作用后， 需要评价发育免疫毒性作用，如观察母代暴露于药 物后仔代的淋巴系统、血液系统、细胞因子等，两 种以上功能检测等。不仅是免疫抑制！
额外的免疫毒性试验方法
• 免疫功能检测
hypersensitivity 目前预测IV型变态反应
autoimmunity
host resistance
Buehler试验、豚鼠最大化试验 （GPMT）、小鼠耳肿胀试验、小鼠局部 淋巴结试验(LLNA) PLNA（报告抗原TNP-Ficoll、TNPOvalbumin）
• • • • • • • • • • 统计学意义与生物学意义（尤其单一指标） 变化程度 与剂量/暴露关系 与拟用临床剂量的关系 疗程关系 涉及动物种属数量和受影响的终点 可能继发于其他因素 (e.g., stress,） 可能的细胞靶点和（或）作用机制 引起这些变化的剂量与产生其他毒性的剂量关系 可逆性