WB的转膜和染色(优质参考)
WB试验参考
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western 可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。
它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。
一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。
具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。
2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。
这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。
3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。
4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。
5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。
6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。
7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。
8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。
9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。
二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。
1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。
b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。
c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。
2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。
b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。
c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。
3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。
献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）
献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE 电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操作步骤详解（上）》。
下面就跟大家讲讲接下来的步骤。
四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。
对于转印90 kd 以下的蛋白，转膜液都不用加SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037% 的 SDS。
1.在电泳结束前20 min 开始准备转膜所需的东西。
转一张膜需准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1~8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。
切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。
PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。
目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
2.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。
也可取10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。
取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。
之后有两种方法供选择，一是按照marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。
在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF 膜和滤纸，平衡10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。
3.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3 张浸泡过缓冲液的滤纸。
超详细的Western实验步骤及结果分析
超详细的Western实验步骤及结果分析Western实验步骤1. 电泳(Electrophoresis)（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。
一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。
配胶步骤：1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。
2.按比例配分离胶（8ml-10ml）3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。
（如果今日不上样可以放入4°C冰箱）注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。
3.12000r离心5分钟。
（3）上样与电泳1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。
3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。
WB完整步骤
Western blot 步骤：配胶制胶跑胶转移胶（转膜）封闭和孵抗体扫膜一.配胶这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。
SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度）2.浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。
容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，二制胶1.灌入2/3的分离胶后应立即封胶，即压线。
30分钟胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。
30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉过硫酸铵（APS）(10%;w/v)取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。
此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气2.灌积层胶5%（统一）40min说明：可延长，宁长勿短。
WB详细操作步骤
Western blot实验检测蛋白表达，抗体很重要，用到的有一抗、二抗、内参抗体WB步骤1 蛋白样本处理：(1)一部分采用完全变性的方法（加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。
(2) 一部分采用非完全变性的方法（未加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。
2 分离胶浓缩胶配方如下：分离胶的浓度要根据蛋白的大小来决定，如下表所示：SDS-PAGE分离胶浓度（%）最佳分离范围（kD）6 50-1508 30-9010 20-8012 12-6015 10-40不同浓度的分离胶与5%浓缩胶，配方如下：分离胶5%浓缩胶试剂8% 10% 12% 15% 试剂体积去离子水（mL) 5.52 4.8 3.96 2.76 去离子水（mL) 4.0 30%丙烯酰胺（mL) 3.24 3.96 4.8 6.0 30%丙烯酰胺（mL) 1.01.5mol/lTris.cl(PH8.8)（mL) 3.0 3.0 3.0 3.01.0mol/lTris.cl(PH6.8)（mL)1.010%SDS（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%SDS（μL)80.0 10%AP（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%AP（μL)60.0 TEMED（μL)7.2 4.8 4.8 4.8 TEMED（μL)8.0 总体积（mL) 12.0 12.0 12.0 12.0 总体积（mL) 6.03 制胶：加入分离胶溶液至2/3处，加水饱和正丁醇封胶，室温放置40 min后加浓缩胶至顶，插入梳子，静置10 min。
WB步骤
3.打开压片板，撕下保鲜膜铺在压片板上（一边留外面），用小镊子夹起膜Marker表达的一边，在纸上将多余的TBST溶液吸干，按照顺序，写字的一面朝上。
4.用枪头在膜上铺上发光剂，完全覆盖膜，显色1~5min，关上灯，查看膜是否显色，若显色后，用实验纸从膜边缘发光剂（抬起压片板）。
器械：装有超纯水的200ml烧杯装有冰水混合物的200ml烧杯超纯水喷壶实验纸
操作：先将匀桨器的旋转头用超纯水清洗，再用旋转头放入EP管中，将组织推到液体中，打开开关，边搅拌边打碎组织，然后将旋转头用超纯水喷壶冲洗，再放进超纯水中打开开关冲洗旋转头内部，再次用喷壶冲洗，甩干水迹，实验纸擦干旋转头确保冲洗干净，再进行下一个组织。
孵育二抗
1.复温30min。
2.清洗一抗：1XTBST溶液，清洗一次就可。
3.二抗：1:10000，5%脱脂奶粉-TBST稀释，培养皿中摇床40min。
4.清洗二抗：1XTBST溶液清洗5minX5。
制胶片
1.准备：保鲜膜、两个1.5mlEP管，实验纸、大小镊子、手电、枪、枪头、显影剂、定影剂、ECL发光剂
200ul
300ul
80ul
160ul
240ul
TEMED
25ul
40ul
50ul
25ul
35ul
40ul
20ul
35ul
45ul
15ul
30ul
40u60ml
20ml
40ml
60ml
20ml
40ml
60ml
20ml
40ml
60ml
A液、B液、C液是配胶，10%APS、TEMED催化凝胶
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WB的转膜和染色凝胶中蛋白的可视化在现阶段染胶可用于确定蛋白的迁移是否均匀一致。
如果您计划将蛋白转印到膜上，则使用铜染色法，因为考马斯染色不可逆。
考马斯染色仅适用于以下情形：在转膜后染胶检查转膜效率；不需要转膜，只需观察 SDS-PAGE 结果。
考马斯染色切断电源后，分离的蛋白条带就会开始扩散（溶于水溶液）。
为了防止蛋白的扩散，用 40% 蒸馏水、10% 醋酸、50% 甲醇的溶液处理凝胶，就会使大多蛋白沉淀（变得不可溶）。
为了让固定的蛋白可视化，在相同比例的水/醋酸/甲醇混合物中加入质量比 0.25% 的考马斯亮蓝 R-250，然后将凝胶放置溶液中，在振荡器上室温孵育 4 小时至过夜。
接下来将凝胶（保存染料；可重复多次使用）转移到 67.5% 蒸馏水、7.5% 醋酸、25% 甲醇的混合溶液中，放置在振荡器上，洗去多余的染料。
染料不会结合丙烯酰胺，因此会被洗脱（留下干净的凝胶）。
但是，染料会与凝胶中的蛋白紧密结合，显示为深蓝色。
铜染色法用蒸馏水简单冲洗经新鲜凝胶（最多 30 分钟），然后转移至 0.3 M CuCl2溶液染色5–15 分钟。
接下来用去离子水简单清洗凝胶，在暗视野背景下观察。
蛋白在半透明蓝色背景下形成清晰条带。
凝胶可以用 0.1–0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 重复冲洗至完全脱色。
根据转膜仪器制造商的说明，进行转膜。
转膜转膜流程的详细说明可在转膜仪器制造商的网站上找到，根据系统的不同而有所区别。
但是，每种方法的原理都一样。
带电荷的蛋白（SDS 提供）在电场中可以在凝胶中移动，从凝胶转移到膜上，显示蛋白的“印迹”。
早期的方法依赖于扩散；现在在电场中进行印迹是标准方法了。
转膜可以湿转或半干转。
湿转由于膜的干燥而更不容易失败，尤其推荐用于大蛋白转膜。
在两种转膜方法中，膜都放置在凝胶旁边，两者夹在滤纸中间，整个三明治结构夹在固体载体之间，保持凝胶与膜之间的紧密接触。
在湿转中，凝胶和膜紧紧地夹在海绵和滤纸之间（海绵 > 滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸 > 海绵），确保凝胶与膜之间不形成气泡。
三明治结构浸泡在转膜缓冲液中，对其施加电场。
负电荷蛋白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。
湿转的标准缓冲液与跑胶缓冲液所用的都是 1x Tris-甘氨酸缓冲液，但是没有 SDS，并加入了甲醇至终浓度 20%。
对于分子量大于 100 kDa 的蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入终浓度为 0.1% 的 SDS。
在半干法转膜中，三明治由滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸组成，在转膜缓冲液中浸湿，直接放置在正负电极之间。
在转膜中，膜靠近正极、凝胶靠近负极，这很重要。
半干转的转膜缓冲液中 Tris 和甘氨酸的比例不一定与湿转一致，请参考仪器制造商的实验方案。
标准配方是 48 mM Tris、39 mM 甘氨酸、0.04% SDS、20% 甲醇。
有两种类型的膜：硝酸纤维素膜（NC膜）和 PVDF膜，实验效果都很不错。
PVDF 膜要求进行预处理：将膜裁剪为合适的大小，然后在甲醇中浸泡 1–2 分钟。
之后转移膜至冰冷的转膜缓冲液中孵育 5 分钟。
未能在转膜缓冲液中平衡的膜会导致转印时皱缩、条带错位。
小分子和大分子蛋白的转膜转膜缓冲液中 SDS 和甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度会影响转膜效率。
如下调整可以增加转膜效率：大分子蛋白 (>100 kD)对于大分子蛋白，其在凝胶电泳时分离迁移较慢，从凝胶中转膜也很慢。
因此跑胶时应该使用低浓度的凝胶，8%或更低。
由于低浓度的胶易碎，所以操作时需十分小心。
•大分子蛋白易在凝胶里形成沉淀聚集，阻碍转膜。
在转膜缓冲液加入终浓度0.1%的SDS，可以避免出现这种情况。
由于甲醇易使SDS从蛋白上脱落，因此降低甲醇的浓度至10%或更低，可以防止蛋白沉淀。
•降低转膜缓冲液中甲醇的比例也会促使凝胶的肿胀，让大分子蛋白更容易转膜。
•只有使用NC膜时才必需使用甲醇。
如果是PVDF膜，在甲醇激活膜后，转膜缓冲液中可以不加入甲醇。
•选择湿转4°C 过夜，不建议选择半干转。
小分子蛋白 (<100 kD)•SDS 妨碍蛋白与膜的结合，对于小分子蛋白更是如此。
因此小分子蛋白的转膜，转膜缓冲液中可以不加SDS。
••保持甲醇的浓度20%。
•对于500 kD 的蛋白，请参考下列文献的凝胶和缓冲液系统：Bolt MW and Mahoney PA (1997).High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.Anal Biochem, 247, 185–92.更多转膜提示：•使用镊子，避免手指接触膜。
手指上的油和蛋白会阻碍转膜，形成脏的印迹。
•将凝胶和膜夹在滤纸中间后，两者之间的气泡可以通过滚筒、移液管或者15 mL 管滚压三明治结构来去除，或者在装有转膜缓冲液的盘中组装三明治结构，防止气泡形成。
•确保将滤纸和膜的大小剪裁得与凝胶一致。
在半干转中，较大的突出会阻止电流通过膜。
•鸡来源的抗体会结合在PVDF膜上，形成高背景。
改用NC膜可以帮助降低背景染色。
丽春红染色使膜上蛋白可视化要确定转膜的成功，用 TBST 洗膜。
将丽春红母液按照 1:100 稀释。
母液是 2% 的丽春红 S 加入 30% 的三氯乙酸和 30% 的磺基水杨酸制成。
在丽春红染色液中孵育 5 分钟，然后用大量水冲洗直至水清澈、蛋白条带显现。
该膜可以用 TBST 或水重复冲洗至完全脱色。
对于 PVDF 膜，用甲醇重新激活后，再用TBST 清洗。
TBS 10x1 L 溶液；24.23 g Trizma HCl80.06 g NaCl在 800 mL 蒸馏水中溶解用 HCl 将 pH 调至 7.6将体积加至 1 LTBST1 L 溶液；100 mL TBS 10x900 mL 蒸馏水1 mL Tween 20Tween 20 很粘稠，会粘在枪头上。
请确保在 Tris 缓冲液中加入正确的剂量。
使用10% 的溶液比直接加入未稀释的 Tween 20 更容易操作。
膜的封闭封闭膜可以阻碍一抗和/或二抗非特异性的结合到膜上（膜对蛋白有很高的结合能力，因此对抗体也有很高的结合能力）。
通常使用两种封闭溶液：脱脂牛奶或 BSA (Cohn fraction V)。
牛奶相对便宜，但是不推荐用于磷酸化蛋白的研究；牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，可能会导致抗体的非特异性结合，形成高背景。
有些抗体对 BSA 封闭的膜比牛奶封闭的膜信号更强，原因还不清楚。
查看数据表中的应用说明，看其中是否有封闭的具体说明。
配置 5% 的牛奶或BSA 溶液，即在每 100 mL TBS 含 Tween 20 (TBST) 的缓冲液中加入 5 g 牛奶或 BSA。
充分混合并过滤。
不过滤可能会导致斑点，在显影时影响条带。
在摇床上 4°C 孵育 1 小时。
孵育后用 TBST 冲洗 5 秒。
一抗孵育孵育缓冲液以建议稀释度在 TBST 中稀释抗体。
如果数据表没有标明建议稀释度，设计稀释梯度(1:100–1:3000)，并根据结果进行优化。
抗体过量会导致非特异性条带。
某些实验室习惯使用封闭缓冲液，而另一些实验室则使用不含封闭剂的 TBST 来孵育抗体。
您可能会发现抗体缓冲液加或不加封闭剂，不同的抗体，结果也不尽相同，。
如果没有高背景问题，用低浓度(0.5–0.25%)甚至完全不加牛奶或 BSA，有些抗体会产生更强的信号。
孵育时间时间可能从几小时到过夜不等（不超过 18 小时），取决于抗体对蛋白的亲和力和蛋白丰度。
我们建议抗体更高的稀释度、更长的孵育时间，确保特异性结合。
孵育温度最好低温孵育。
如果在封闭缓冲液中孵育过夜，必须在 4°C 孵育，否则会出现污染从而破坏蛋白（尤其是磷酸化基团）。
建议在摇床上孵育，充分均匀覆盖膜，防止结合的不均匀。
二抗孵育用 TBST 清洗膜数次，每次清洗 5 分钟或更长，去除残余一抗。
孵育缓冲液与稀释度以建议的稀释度在 TBST 中稀释抗体。
如果数据表没有推荐的稀释度，设计稀释梯度(1:1,000–1:2,0000)，并根据结果进行优化。
抗体过量会导致非特异条带。
您可以在封闭缓冲液中孵育二抗，但是在降低背景时可能会牺牲特异性信号的强度，这可能是因为封闭蛋白会阻碍抗体目标蛋白的结合。
孵育时间和温度摇床上室温孵育 1–2 小时。
选择哪个偶联物？我们推荐辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联的二抗，不推荐碱性磷酸酶 (ALP) 偶联的二抗，因为其灵敏度较低。
显影方法检测试剂盒对于 HRP 偶联的抗体，通常使用加强的化学发光 (ECL) 试剂盒作为底物。
我们提供不同检测灵敏度的 HRP 底物。
X 射线胶片自动化 X 射线胶片仪，简单易用，被广泛使用。
切记，过曝的胶片不适合进行分析，因为无法确定蛋白的相对量。
且过曝的胶片会显现全黑条带，没有对比，有大量非特异性条带。
数码拍照新一代显影仪内含摄像头，无需暗室。
摄像头检测到膜上的化学发光，将信号转换为数码照片，并利用仪器提供的软件进行快速分析。
现在市场上有一系列机器可以选用。
处于下一代前沿的是不使用 HRP 偶联抗体（即化学发光）的系统。
举个例子，STORM 分析仪检测来自荧光偶联二抗的荧光。
Odyssey 红外成像系统检测红外荧光。