免疫荧光双染
免疫荧光双标操作方法及注意事项之欧阳引擎创编
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫荧光染色(多标)步骤
免疫荧光染色(多标)步骤一、免疫荧光染色的多标技术简介免疫荧光染色的多标技术是通过同时使用多个荧光染料，标记不同的抗体，从而实现对多个目标分子的检测。
该技术广泛应用于生物医学研究、免疫组化和细胞生物学等领域，可以提供更全面的信息和更准确的结果。
二、免疫荧光染色的多标步骤免疫荧光染色的多标步骤主要包括标本处理、抗原修复、非特异性结合阻断、一级抗体处理、荧光二抗处理和显微镜观察等。
1. 标本处理将待检样品制备成组织切片或细胞涂片，并固定在载玻片上。
可以使用多种组织固定剂，如乙醛、甲醛等。
固定后，需进行脱水、透明化处理，以便后续步骤的进行。
2. 抗原修复组织样本经过固定处理后，可能导致抗原的空间结构发生改变，影响后续的抗原-抗体结合。
因此，需要进行抗原修复处理，如热解、酶解等方法，以恢复抗原的免疫原性。
3. 非特异性结合阻断为减少假阳性结果的产生，需要对标本进行非特异性结合阻断。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、鱼胶蛋白等，与标本中的非特异性结合位点结合，阻断后续试剂的非特异性结合。
4. 一级抗体处理将标本与一级抗体一起孵育，使一级抗体与目标抗原结合。
一级抗体通常是由小鼠、兔子等动物制备的，可以识别与特定抗原结合的抗体。
一级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
5. 荧光二抗处理将与一级抗体不同动物来源的荧光标记的二级抗体与标本一起孵育。
荧光二抗能与一级抗体特异性结合，从而实现对目标抗原的荧光标记。
不同荧光染料的荧光二抗可以同时使用，以实现多标的目的。
6. 显微镜观察将处理好的标本放置在显微镜下观察，可使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备进行观察。
通过不同的荧光染料，可以同时检测多个目标分子的位置和表达水平。
三、免疫荧光染色的多标技术应用免疫荧光染色的多标技术广泛应用于生物医学研究中，如疾病诊断、蛋白质定位和分析、细胞信号通路研究等。
通过同时检测多个目标分子，可以提供更全面的信息，有助于深入了解生物过程的机制。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项免疫荧光双标技术（Immunofluorescence Double Staining Technique）是一种常用于生物医学研究中的实验技术，通过检测特定抗原和抗体的结合情况，可以对细胞或组织中的蛋白质进行定位和表达研究。
在进行免疫荧光双标实验时，为了确保实验结果的准确性和可靠性，有几个操作要点和注意事项需要特别关注和遵守。
一、试剂准备在开始实验之前，需要准备好以下试剂：1. 抗体：根据实验需要选择适当的一抗和二抗。
一抗用于识别待检测的抗原，二抗则与一抗结合形成免疫复合物，发出荧光信号。
2. 样品：包括细胞、组织等待检测的样品。
3. 荧光染色试剂：根据实验需要选择适当的荧光染色试剂。
常用的有荧光染料如荧光素、多聚荧光素等。
4. 细胞或组织培养基：提供细胞或组织的生长和营养。
二、标本处理1. 样品固定：使用适当的固定液对细胞或组织样品进行固定，一般常用的固定液有乙醛或甲醛。
2. 膜通透：使用适当的溶液对固定后的样品进行膜通透处理，常用的膜通透液有Triton X-100等。
三、抗体反应1. 一抗孵育：将适当稀释的一抗添加到样品中，充分反应一段时间，使一抗与待检测的抗原结合。
2. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的一抗。
3. 二抗孵育：将适当稀释的二抗添加到样品中，与已结合的一抗形成免疫复合物。
4. 再次洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的二抗。
四、荧光染色和观察1. 加入荧光染色试剂：将所选的荧光染色试剂加入样品中，使其与免疫复合物结合。
2. 温度和时间控制：根据荧光染色试剂的要求，控制反应温度和时间，确保荧光信号的强度和稳定性。
3. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的荧光染色试剂。
4. 观察和分析：使用荧光显微镜观察样品，记录和分析荧光信号的分布和强度。
注意事项：1. 试剂保存：保持试剂的储存条件和有效期，使用前检查试剂的颜色和透明度，避免使用已失效的试剂。
免疫荧光共染色
免疫荧光共染色免疫荧光共染色的基本原理是利用特异性抗体与目标分子结合，并通过荧光染料标记抗体，从而实现目标分子在细胞或组织中的可视化。
这种技术可以用于检测和定位细胞内的特定蛋白质、细胞器、细胞结构以及染色体等。
通过观察标记物的分布情况，可以了解细胞的结构特征、各种细胞结构之间的相互关系，以及细胞功能的变化等。
在免疫荧光共染色实验中，首先需要选择合适的抗体和荧光染料。
抗体的选择要根据目标分子的特异性来确定，而荧光染料则要具有较强的荧光信号和稳定的性质，以确保实验结果的准确性和可靠性。
实验的步骤主要包括样本的制备、抗体的孵育、荧光染料的标记、显微镜观察和图像分析等。
首先，需要将细胞或组织样本固定在载玻片上，并进行透明化处理以提高荧光信号的透过性。
然后，使用特异性抗体孵育样本，使抗体与目标分子结合。
接下来，将荧光染料标记在抗体上，形成荧光标记的抗体。
最后，使用荧光显微镜观察样本，并通过图像分析软件进行图像处理和数据分析。
通过免疫荧光共染色技术，可以在细胞或组织中同时检测和定位多个目标分子。
例如，在细胞内同时标记细胞核和细胞骨架蛋白，可以观察到它们在细胞内的分布情况以及相互关系。
这种技术还可以用于研究细胞分化、细胞凋亡、细胞周期等生物学过程，以及疾病诊断和治疗的研究。
免疫荧光共染色技术具有许多优点。
首先，它可以同时检测多个目标分子，提高实验效率和减少样本使用量。
其次，由于抗体的高度特异性，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
此外，荧光染料的荧光信号强度高，可以提供清晰的图像，便于观察和分析。
最后，免疫荧光共染色技术不需要显微切片和染色过程，相比传统的染色方法，操作更简便，时间更短。
然而，免疫荧光共染色技术也存在一些局限性。
首先，选择合适的抗体和荧光染料是关键，不同的抗体和染料可能存在交叉反应或互相干扰的问题。
其次，染色效果可能受到样本处理、染色条件和荧光显微镜的影响，需要进行严格的控制和优化。
此外，荧光信号的自发衰减和光照条件的变化也可能影响实验结果的准确性。
免疫荧光双标原理
免疫荧光双标原理免疫荧光双标原理是一种生物分子标记技术，主要用于分析和检测细胞和组织中的蛋白质等分子。
该技术结合了免疫学和生物荧光学的原理，基于细胞或组织中特定分子与特异性抗体结合的反应，将其标记荧光染料，从而实现对细胞或组织中分子的探测和定位。
免疫荧光双标原理的基本步骤包括抗体标记、标本制备、光学检测和数据分析等几个方面，下面将逐一介绍。
1. 抗体标记抗体标记是免疫荧光双标技术中最关键的一个环节。
通常采用的方法是将荧光染料与抗体分子关联，制成荧光标记的免疫调控试剂盒。
这些试剂通常被称为“荧光标记抗体”，标记染料有多种不同的荧光颜色，以适应不同的检测需求。
标记抗体的荧光染料通常是有机染料或金属螯合剂，如罗丹明（Rodamine）、荧光素（Fluorescein）和荧光钴（Fluorescent Co）等。
2. 标本制备标本制备是免疫荧光双标技术中的一个关键步骤，它决定了标本质量的好坏。
通常先将标本切片或离心，然后用甲醛或其他交联剂固定细胞和组织样品，使其保持原来的形态，并同时固定荧光抗体标记。
之后，需要将细胞膜孔洞或核孔进行透射和渗透，以使标记分子能够穿过细胞膜，进入细胞内部或核内。
这样，形成的免疫荧光双标标本就可以被用于后续的检测和分析。
3. 光学检测光学检测是免疫荧光双标技术中的另一关键步骤。
它利用激光束或正常的光源激发标记染料产生荧光，从而实现对标本分子的检测和分析。
光学检测通常基于荧光显微镜、光谱仪或光电显微镜等设备，这些设备可以直接观察和记录样品中的荧光信号，获取图像信息和/或光谱数据。
4. 数据分析数据分析是免疫荧光双标技术中的最后一个步骤。
它涉及对荧光信号数据的处理和解释，以提取有用的生物学信息。
数据分析通常基于计算机软件，可以将荧光信号转化为图像、数字和/或图形表示，以实现对标本中分子数量、定位和相关性的计算和分析。
总之，免疫荧光双标技术是一种高灵敏度、高精度、高通量的生物分子探测和定位技术，已广泛应用于细胞和分子生物学研究、临床诊断和药物研发等领域。
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测特定抗原在细胞或组织中的表达和定位。
以下是免疫荧光染色的基本步骤：
1. 取得标本：获取需要检测的组织或细胞样本，可以是固定的组织切片或涂片，或者是固定的细胞。
2. 抗原解发：如果样本中的抗原被掩盖或结合得过于紧密，需要进行抗原解发。
可以使用酶解方法或热解方法来解发抗原。
3. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合抑制剂，如动物血清、牛血清白蛋白或BSA，来阻止未特异性抗体结合到样本上。
4. 抗体染色：加入特异性一抗，即针对目标抗原的初级抗体。
留样本在4°C或室温下与一抗孵育一段时间，充分结合。
5. 洗涤：用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合的初
级抗体。
6. 加入荧光标记的二抗：使用经荧光标记的二抗，即反应在初级抗体上的特异性抗体。
留样本在4°C或室温下与二抗孵育
一段时间，充分结合。
7. 洗涤：再次用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合
的二抗。
8. 盖玻片和封片：将样本转移到载玻片上并加盖玻片，可以加入抗褪色剂来保护荧光信号。
9. 观察与记录：使用荧光显微镜观察标本，并记录所观察到的荧光信号的位置和强度。
以上是免疫荧光染色的基本步骤，具体步骤可能会因实验目的和设备的不同而有所变化。
胚胎脑片免疫荧光组织化学双重漂染技术在神经元发生研究中的应用
胚胎脑片免疫荧光组织化学双重漂染技术在神经元发生研究中的应用敖然;吴美延;赵慧;周莉;陈爱军【摘要】Objective To establish the double immunofluorescent staining technique for the embryonic brain slices to objectively observe the proliferation, differentiation and migration of neural progenitor cells in rat embryo brains. Methods Rat embryos of 14 days (E14) were fixed by perfusion. The brains were taken and embedded in low-melting agarose, then sliced with a vibratome, stained by double immunofluorescence and observed by using confocal laser scanning microscopy. Results Vimentin and choline acetyltransferase (ChAT) double positive cells showed yellow fluorescence their bodies located in the ventricle zone (VZ) , and the radial long processes in the subventricle zone (SVZ). Only ChAT positive cells with red fluorescence were found in the cortex plate of dorsal telencephalon. Conclusion The morphology and identity of neural progenitor cells and neuroblasts are identified by using the technique , and their relationship can be analyzed by double immunofluorescent staining.%目的为更客观地观察胚胎脑神经祖细胞的增殖、分化和迁移,建立胚胎脑片免疫荧光组织化学双重漂染技术.方法灌流固定,取胚胎14天(E14)大鼠脑,低熔点琼脂糖包埋,振动切片机连续冠状切片,免疫荧光组织化学双重漂染,激光扫描共聚焦显微镜下观察.结果波形蛋白(Vimentin )和乙酰胆碱转移酶(ChAT)双阳性细胞呈黄色荧光,胞体位于脑室区,长突起呈放射状.ChAT 阳性细胞呈红色荧光,除胞体位于脑室区,长突起呈放射状伸展外,可见皮层板区也有阳性细胞集聚.结论此项技术可直接观察到胚胎脑神经祖细胞和成神经细胞的完整形态,并通过免疫荧光组织化学方法鉴定其表型,从而阐明相互之间的关系.【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2011(020)001【总页数】5页(P80-84)【关键词】胚胎脑片;免疫荧光组织化学;神经元发生【作者】敖然;吴美延;赵慧;周莉;陈爱军【作者单位】吉林大学白求恩医学院组织学与胚胎学系,长春,130021;吉林大学白求恩医学院组织学与胚胎学系,长春,130021;吉林大学白求恩医学院组织学与胚胎学系,长春,130021;吉林大学白求恩医学院组织学与胚胎学系,长春,130021;吉林大学白求恩医学院组织学与胚胎学系,长春,130021【正文语种】中文【中图分类】R329在研究胚胎端脑神经元发生时,为证实神经元的来源、迁移和归宿,常常需要通过免疫组织化学技术鉴别神经元类型,有时还需检测两种标志性蛋白共存于同一种细胞质内。
免疫荧光染色方法
免疫荧光染色方法免疫荧光染色方法是一种广泛应用于生物学研究领域的技术，可以用于检测和定位特定抗原分子在细胞或组织中的分布和表达情况。
该方法利用抗体与特定抗原结合，并利用荧光染料标记抗体，通过显微镜观察荧光信号来确定抗原的位置和表达量。
免疫荧光染色方法具有高灵敏度、高分辨率和广泛的应用范围，因此在细胞生物学、分子生物学、免疫学等领域得到了广泛应用。
首先，需要固定样品以保持细胞或组织的形态和结构。
常用的固定剂包括乙醛、甲醛和氯酸等，可以在细胞或组织中形成交联结构，固定抗原。
固定剂的选择应根据具体实验目的和样品类型来确定。
接下来，渗透化步骤是为了提高抗体与抗原的结合效率，并使抗体能够穿透细胞或组织进行染色。
常用的渗透剂包括甲醇、乙醇、Triton X-100等。
渗透化的时间和条件需根据样品的特性和实验要求来确定。
最后，通过荧光检测来观察和分析抗原在样品中的分布和表达情况。
荧光检测通常利用荧光显微镜来观察光信号。
在荧光染色中，主要有两种常用荧光染料，一种是荧光素和异硫氰酸荧光素（FITC），另一种是罗丹明（Rhodamine）。
这些染料在特定波长下能产生荧光，并且可以选择性地与抗体结合，形成荧光复合物。
通过荧光显微镜观察这些标记的复合物，可以确定抗原在样品中的位置和表达量。
除了基本的免疫荧光染色方法，还有一些其他的变种方法可供选择，例如间接免疫荧光染色、多重免疫荧光染色、双标记荧光染色等。
这些方法可以进一步提高检测的敏感性和分辨率，并提供更多的信息。
总的来说，免疫荧光染色方法是一种重要的生物学研究工具，可以用于检测和分析抗原的表达和定位。
随着技术的不断发展，免疫荧光染色方法在细胞和分子生物学研究中的应用前景将更加广阔。
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免疫荧光双染
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法（double immu nofluoresce nee labeli ng method）也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤
1、？冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固
定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），
在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，
37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、？破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育
20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1?
（TdT）? 和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、?BSA封闭:将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，
每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、？加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，
切片平放于湿盒内4 °孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、？加二
抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min 。
8、？DAPI复染细胞核：切片用PBS( PH7.4)洗涤3次，每次5min。
去除PBS
后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS (PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次
5min 。
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
10、?镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
(紫
外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，
发射波长515-555?nm；CY3 红光激发波长510-560，发射波长590nm)
石蜡切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤
1、?石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 15- 20min-二甲苯
n 15- 20min-无水乙醇I 10min-无水乙醇n 10min-95%酒精5min-90%酒精
5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗(冬天脱蜡时间稍微延长) 。
2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)，
在圈内滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释)覆盖组织，
37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5min 。
3、?破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育
20min，将玻片置于PBS( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1?(TdT)?
和试剂2(dUTP)按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，
37C恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、？BSA封闭:将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，
每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温圭寸闭30min。
6、？加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切
片平放于湿盒内4 °孵育过夜。
(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
7、？加二抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次
5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育
50min。
8、？DAPI复染细胞核：切片用PBS (PH7.4)洗涤3次，每次5min。
去除PBS
后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS (PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次
5min。
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
10、?镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
(紫
外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm; CY3红光激发波长510-560,发射波长590nm)
1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4C保存4h,时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：
(1)阳性对照：阳性血清+荧光标记物; ⑵阴性对照：阴性血清+荧光标记物;
(3)荧光标记物对照：PBS荧光标记物。