荧光定量PCR引物设计
荧光定量引物设计原则
荧光定量引物设计原则 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020引物的具体设计要求：1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。
2. 产物不能形成二级结构（自由能小于mol）。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
5.碱基要随机分布，尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。
假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
值在58-62度之间。
17.引物设计的软件Primer 有专门针对荧光的。
用染料做荧光定量不如探针特异性好，具体操作一下就知道了！可以多定几对引物，免得摸条件浪费时间和金钱！试剂很贵的！荧光定量PCR引物设计原则设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。
设计引用有一些需要注意的基本原理：① 引物长度一般引物长度为18~30碱基。
总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。
荧光定量PCR引物设计
Novobio Proprietary & Confidential
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围， 则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 2 设计引物
3 qPCR引物特异性验证
1、 进入网页： 2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
The end ! Thank you!
荧光定量PCR引物设计（SYBR@Green）
引物要求： （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。 （5）避开保守区域
1. NCBI Primer blast
选择1 - 无所谓 选择2 - 必须跨不同Exon 选择3 - 可以不跨Exon
勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron （当以基因组DNA为模板时）
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Primer blast
勾选时表示要检测引 物的特异性
填入要比较的物种 （可输入通用名，如 human/mouse/rat/rab bit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
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荧光定量PCR操作流程
荧光定量PCR操作流程1.目的基因引物的合成设计合成200-300bp目的基因片段的引物，利用primer 5.0引物设计工具或者手工合成，引物合成过程中注意上下游的Tm值要相似、GC碱基在上下游的引物里均匀、引物与模板序列紧密互补、引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构等事项。
2 总RNA提取（1）准备研钵（灭菌）、离心管（1.5ML），枪头、手套（一次性）、异丙醇、乙醇，三氯甲烷2）取适量家蚕组织，加液氮充分研磨；匀浆加1ml RNAiso Plus后匀浆；3）室温放置5min （可在-70℃下保存1个月）4）加0.2ml氯仿（chloroform），振荡混匀，室温放置5分钟；5）12000g，15min，4℃；6）取上清（约0.6ml），加与上清等体积异丙醇，室温放置10分钟；7）12000g，10min，4℃；8）取沉淀（RNA呈胶状沉淀），加1ml 75%乙醇（可在-20℃保存1年）洗涤；9）12000g，5min，4℃；10）取沉淀，室温干燥10min；11）溶解于DEPC处理水中12）-80℃保存，尽快使用，或在8）保存。
3 反转录（TOYOBO试剂盒）Nuclease-free water up to 10ul5ⅹRT buffer 2ulRT Enzyme Mix 0.5ulPrimer Mix 0.5ulRNA 0.5-1ug4定量PCR反应（本实验室7300系统）SYBR 10ulForward Primer 1ulReverse Primer 1ulROXⅠ 0.4ulc DNA模板2ul一个模板重复三次以尽量减小误差；每个模板都要设内参。
内参是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。
而后按照试剂盒说明操作流程设定仪器参数即可。
荧光定量pcr引物设计原理
荧光定量pcr引物设计原理荧光定量PCR（qPCR）引物设计的原理是基于PCR技术和荧光探针技术相结合。
PCR是一种从一小段DNA模板扩增特定DNA序列的技术，而荧光探针则是一种特殊的DNA探针，带有荧光物质，可以用来检测PCR反应过程中特定DNA序列的累积量。
荧光定量PCR的引物设计主要包括前向引物（forward primer）和反向引物（reverse primer）。
这两个引物被设计成具有与目标序列的两个不同区域互补的DNA序列。
在PCR反应中，这两个引物会结合到模板DNA上，并在酶的催化下引发DNA链的扩增。
为了确保引物能够选择性地结合到目标序列，需要注意以下几个原则：1. 引物长度：引物的长度通常在18-25个碱基对之间。
引物过短可能导致非特异性结合，引物过长则可能导致扩增效率降低。
2. GC含量：引物的GC含量通常在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物结合不稳定或影响扩增效率。
3. 互补性：前向引物和反向引物应该在目标序列的不同位点，且二者之间不应有显著的互补性。
否则将导致引物之间的非特异性结合和产生副产物。
4. 特异性：引物应该能够特异性地结合到目标序列，而不结合到其他非目标序列。
为了确保特异性，可以使用计算软件进行序列比对和BLAST分析。
此外，为了进行荧光定量PCR，还需要引入荧光探针。
荧光探针是一种特殊设计的DNA或RNA探针，通常带有一个荧光物质和一个荧光耦合的荧光素（quencher）。
在PCR反应中，荧光探针与目标序列的靶标区域互补结合。
当荧光探针结合到目标序列时，荧光物质和荧光素之间的空间距离会增大，导致荧光物质释放出荧光信号。
这个信号可以被PCR仪器检测到，并用于测量PCR反应过程中目标序列的累积量。
总之，荧光定量PCR引物设计需要考虑引物的长度、GC含量、互补性和特异性。
同时，还需要设计荧光探针来检测目标序列的累积量，以实现定量PCR的功能。
qPCR引物设计
填入要比较的物种 （可输入通用名，如 human/mouse/rat/rab bit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
勾选”show results in a new window”--》点击”Get Primers”
Primer blast – 结果
qPCR引物设计
荧光定量PCR
荧光定量PCR引物设计（SYBR@Green）
引物要求： （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。 （5）避开保守区域
3 qPCR引物特异性验证
1、 进入网页： 2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 1 搜索引物保守序列（与转录组比较）
黄色区域为相对保守序列，设计引物是要尽量避开
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 2 设计引物
1. NCBI Primer blast
NCBI 设计引物网址：
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围， 则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
定量PCR引物探针设计原则
定量PCR引物探针设计原则定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于测量DNA分子数量的技术。
在进行定量PCR实验时，合理设计引物和探针非常重要，下面将探讨一些定量PCR引物和探针设计的原则。
1.引物设计原则：1.1引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致非特异性扩增，而过长的引物可能导致扩增效率降低。
1.2引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，过高或过低的GC含量都可能导致非特异性扩增。
1.3引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间，可以通过计算引物序列的碱基组成和长度来预测引物的Tm值。
1.4引物的特异性：引物的特异性是设计引物时最关键的考虑因素之一、引物的特异性可以通过检查与该引物匹配的靶标序列在基因组或转录组中的唯一性来评估。
可以使用生物信息学工具，如BLAST（基本局部序列比对）来分析引物的特异性。
此外，还可以使用引物的3'末端碱基序列的特异性来提高引物的特异性。
2.探针设计原则：2.1探针的长度：探针的长度一般在20-30个碱基对之间。
2.2探针的熔解温度（Tm）：与引物类似，探针的Tm值也应在50-60摄氏度之间。
2.3探针的特异性：与引物一样，探针的特异性也是设计探针时需要考虑的重要因素。
探针的特异性可以通过生物信息学工具来分析，如BLAST。
此外，还可以设计探针的3'末端碱基序列来提高其特异性。
2.4探针的化学修饰：在实验中，通常使用荧光标记的探针来实现定量PCR。
探针可以通过荧光基团，如FAM、VIC、HEX等进行标记。
此外，还可以在探针的两端引入磷酸酯键或磷酸二酯键等化学修饰，以提高探针的稳定性和特异性。
总结起来，定量PCR引物和探针的设计需要考虑引物长度、GC含量、熔解温度和特异性等因素。
在设计引物和探针时，可以使用生物信息学工具来分析其特异性，并通过化学修饰来提高其稳定性和特异性。
qPCR引物设计
荧光实时定量PCR引物设计I．靶的选择和试验设计1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb), 相对物种较多PrimerBank (/primerbank/index.html) 人，鼠Real Time PCR Primer Sets () 人，mouse，rat如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer()B.DIY的软件Primer ExpressC.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys )的服务方案,详细周到D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序:/products/probe_design.asp您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR 引物设计简介DNA引物长度:15-25 个碱基GC含量:50%左右如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:<10 kcal/mol.没有连续的G/C.引物探针的保存一般遵循以下原则:正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。
2.输入靶序列，用BLASTn在/blast进行比对3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。
荧光pcr引物设计要求
荧光PCR引物设计要求主要包括以下几个方面：
引物长度：一般为15-30碱基之间，具体取决于所使用的聚合酶和上下游引物的相对位置。
引物特异性：引物应具有特异性，能够特异性的扩增目的基因，避免与基因组DNA或cDNA中的其他序列发生非特异性结合。
引物GC含量：引物的GC含量应适当，一般在40%-60%之间，以保持PCR反应的稳定性。
引物3’端：引物的3’端不应是连续的嘌呤或嘧啶，以避免引物自扩增和增加PCR产物。
引物间互补性：引物之间不应存在互补序列，以避免引物二聚体的形成。
引物位置：上游引物应位于目的基因的保守区内，下游引物应位于目的基因的变异区内，以保证PCR产物的大小合适。
引物温度：上下游引物的Tm值应接近，以使复性温度最佳。
一般而言，PCR产物大小为85-300bp。
引物修饰：根据需要，可以对引物进行修饰，如荧光标记、生物素标记等，以提高PCR 检测的灵敏度和特异性。
避免使用密码子简并性高的区域：引物设计的区域应尽量避开密码子具有较高简并性的区域，以免影响PCR产物特异性。
总的来说，荧光PCR引物设计需要综合考虑以上因素，以达到最佳的扩增效果。
同时，还需要通过实验验证引物的特异性、灵敏度和重复性等指标，以确保荧光PCR检测的准确性和可靠性。
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荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件beacon Designer 有时一对100分的引物扩增效率特别低换了一对貌似很烂的引物结果溶解曲线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。
个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高适当降低反应退火温度看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。
看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解反转录过程是否完整设好内参正对照最后所有这些都满足还是没扩增出来重新设计引物吧1设计的时候尽量靠近基因的3端这样能最大限度地保证扩增效率2尽量跨越内含子这样可以保证检测有无基因组污染3两条引物的Tm值不要相差太大4产物长度保证在80200bp之间最长300 bp。
.如果想同时检测很多对基因的变化最好设计的时候记录下产物的Tm值这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。
保证在产物Tm80以上一般Tm80以下的峰都是引物二聚体对于水稻等GC含量比较高的基因组产物Tm不要高于94个人观点。
如果同时检测很多对基因的表达量变化我会尽量调整所有产物的Tm值与内参产物的Tm相差不太大这样方便实验操作和最后的分析。
3相对错配来说我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大当然也别错配得太邪门了非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了引物的3端不要有错配。
5一般我们用Primer Premier设计软件我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物找到一条评分是100的再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的引物一般5分钟之内可以搞定一个基因。
实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。
最好位于编码区5端的300-400bp区域内可以用DNAMANAlignment软件看看结果。
2、不能形成2级结构。
3、引物长度一般在17-25bp之间上下游引物不能相差太大。
4、GC含量在40-60之间45-55最佳。
5、碱基要随机分布尽量均匀。
6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8、引物5�6�7端可以修饰。
9、3�6�8端不可修饰而且要避开ATGC rich的区域避开T/C A/G连续结构2-3个。
10、引物3端要避开密码子的第三位。
11、引物整体设计自由能分布5端大于3�6�7端。
12、定量产物长度80-150bp最好最长是300bp。
实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR 反应中引入了一种荧光化学物质随着PCR 反应的进行PCR 反应产物不断累计荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环收集一个荧光强度信号这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化从而得到一条荧光扩增曲线。
广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型1外参法终产物分析。
所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。
这种类型没有对样本进行质控监测易出现假阴假阳结果没有监测扩增效率定量不准。
2内参法终产物分析。
所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。
这种类型对样本进行质控监测排除假阴结果但是定量不准。
3外标法过程监测。
这种类型监测扩增效率阳性样本定量准但是无法排除假阴结果。
4内参法过程监测。
由于样本与阳性参照在一个容器内反应用同样的Taq酶和反应参与物存在竞争性抑制起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应所以定量不准。
5外标法过程监测内对照。
这种类型监测扩增效率阳性样本定量准同时排除假阴结果。
这种类型是应该提倡的。
在国家没有出台阴阳判定标准时所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝一个病毒。
从理论上说只要有一个拷贝数样本就算阳性一个拷贝数都没有才算阴性。
所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR 反应中引入了一种荧光化学物质随着PCR 反应的进行PCR 反应产物不断累计荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环收集一个荧光强度信号这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化从而得到一条荧光扩增曲线。
PCR过程的监测有多种检测模式。
最常用的有三种检测模式1R Green I 检测模式。
温度循环为94—55—72°C三步法只有引物无探针荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。
通过对特定方向的强荧光检测获得信号这种试剂检测模式易产生非特异信号且本底光较大。
2解探针模式TaqmanHydrolysis Probe 。
温度循环为94—60°C二步法不仅有引物还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。
在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。
当Taq酶在60°C延伸扩增链时遇到探针利用Taq酶5—3外切酶活性将探针水解成单个碱基单个碱基之间距离较远第一个染料的能量无法传给第二个染料只好通过发射特征光子回到稳定态通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。
这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性但是由于利用了Taq酶5—3外切酶活性一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标没有同时给Taq酶5—3外切酶活性定标不同批号试剂之间会给定量带来差异。
另外对探针的熔点温度Tm仅要求其高于60°C这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐而且无法做质控检测。
3杂交探针Hybridization Probes模式。
温度循环为94—55—72°C三步法有引物二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间在一个探针3碱基上结合一个荧光染料在另一个探针5碱基上结合第二个荧光染料。
在55°C时两个探针都刚好接合在模板上第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。
这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关探针的浓度始终保持不变因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。
另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。
RT-qPCR是由三个步骤组成: 1.反转录:依赖反转录酶将RNA 反转录成cDNDA 2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA 3.检测:实时检测和定量扩增的产物. RT-qRCR影响分析可靠性关键点Key porint: 1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计 2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观如果不合理的分析从分析结果中会得到混淆的错误结果因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性最大化可重复性而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析 1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品 2.整个组织样本显微切割样本单个细胞组培细胞 3.总RNA或者mRNA 4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略 5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7.多类型的检测化学方法反应的条件热循环仪的分析以及汇报方式。
8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理内参的使用归一化的方法质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度重复性。
RNA 质量评价现在RNA 定量的程序很多。
最近EMBO qPCR coursehttp://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28 比较了用Ribogreen Agilent BioAnalyser spectrophotometerNanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。
结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。
所以用不同的方法进行定量是不明智的。
因此我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。
RNA 质量RNA 质量主要包括RNA的纯度没有蛋白质和DNA的污染以及完整性。
传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。
Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。
Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱通过图谱来反应RNA 的量和完整性其完整性通过完整性系数RIN来反应。
样品的RINs在10-4之间。
10代表完整的RNA4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100准确定反应mRNA的完整性因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。
这里推荐一种方法采用GAPDH的3�6�85�6�8分析法。
我们使用oligo dT进行逆转录然后对逆转录的cDNA 用multiplex荧光定量评价。
设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。
探针设计的位点分别位于3�6�85�6�8以及中部。
扩增产物的之间的比值反应RNA 的完整性。
如果3�6�85�6�8的比值在1反应较高度完整性如果高于5说明降解。
QRT-PCR 抑制物的组成QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物盐离子尿素血红素heparin以及IgG. 是否有抑制物的评价体系1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测 2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况 3.用细菌检测临床样品的抑制4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况反转录反应系统 1.RT和PCR单一酶系统 2.RT和PCR分离的酶系统3.RNA逆转录引物的选择引物主要有三种1.随机引物随机引物特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果建议使用15nt 的随机引物. 2.oligo-dT只能用于mRNA完整的样品特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3�6�8UTR 的区域比较困难 3.特异引物最特异最灵敏的方法。
特别RNA量足够情况下建议使用此法。
PCR 优化PCR优化主要有1.引物的浓度2.建议使用SYBR Green I和EvaGreen进行扩增和溶解曲线的测试笔者建议的操作流程: 一靶的选择和试验设计 1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物探针以及反应条件. RTPrimerDBhttp://medgen.ugent.be/rtprimerdb 相对物种较多PrimerBank /primerbank/index.html 人鼠Real Time PCR Primer Sets 人mouserat 如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考以下的设计方案仅供参考: A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer B.DIY的软件Primer Express C.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果或者获得到设计方案的备选数目不够的话可以选择Sigma-Genosys 的服务方案详细周到 D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: /products/probe_design.asp.您可以挑选其中的4-6对引物进行试验选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR 引物设计简介DNA引物长度:15-25 个碱基GC含量:50左右如果引物的与AT区域富集结合可以考虑用LNA替换几个碱基较少引物的长度以及避免引物次级结构和3�6�8端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争分之内杂交倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率降低因此我们选择引物二聚体的△G为负值即:。