荧光定量PCR引物设计要求
荧光定量PCR引物设计
荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件：beacon Designer有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。
个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高，适当降低反响退火温度，看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。
看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好参正对照最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，〔1〕设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率〔2〕尽量跨越含子，这样可以保证检测有无基因组污染〔3〕两条引物的Tm值不要相差太大〔4〕产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。
.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。
保证在产物Tm80以上〔一般T m=80以下的峰都是引物二聚体〕，对于水稻等GC含量比拟高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。
如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值与参产物的Tm相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。
〔3〕相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大〔当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在一样位置或者比产物峰还高的错配就死了〕，引物的3'端不要有错配。
〔5〕一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右适宜的位置手动搜索有没有适宜和它配对的评分也比拟高的引物，一般5分钟之可以搞定一个基因。
实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。
最好位于编码区5'端的300-400bp 区域，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。
荧光定量引物设计原则
荧光定量引物设计原则 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020引物的具体设计要求：1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。
2. 产物不能形成二级结构（自由能小于mol）。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
5.碱基要随机分布，尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。
假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
值在58-62度之间。
17.引物设计的软件Primer 有专门针对荧光的。
用染料做荧光定量不如探针特异性好，具体操作一下就知道了！可以多定几对引物，免得摸条件浪费时间和金钱！试剂很贵的！荧光定量PCR引物设计原则设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。
设计引用有一些需要注意的基本原理：① 引物长度一般引物长度为18~30碱基。
总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。
实时荧光定量PCR国际化标准(二)2024
实时荧光定量PCR国际化标准（二）引言概述实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高灵敏、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物研究等领域。
为了实现方法和数据的国际标准化，国际上制定了实时荧光定量PCR的国际化标准。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的主要内容。
正文内容一、技术要求1.1 具备规范的实验室条件，包括洁净、无尘、无RNA酶污染的实验环境。
1.2 使用具有良好稳定性、一致性和可追溯性的荧光探针和引物。
1.3 验证实验室使用的仪器设备，确保其精确、重复性和灵敏度符合国际标准。
二、质量控制2.1 建立质量控制体系，包括核酸提取、反转录、荧光探针标记等各个环节的质量控制。
2.2 使用合适的内部参照基因或内质控，用于验证试剂盒、仪器设备和实验操作的稳定性和可靠性。
2.3 建立监控样本和质控品的库存管理系统，确保其有效性和可追溯性。
三、方法标准化3.1 设计标准化的实验操作流程，包括样品制备、反转录、PCR 扩增和数据分析等。
3.2 使用适当的PCR引物和荧光探针，根据模板序列设计合理的引物和探针。
验证其特异性和灵敏度。
3.3 建立标准曲线和基准值体系，用于测定目标基因的定量结果，并进行结果的准确性评估。
四、数据分析和结果解释4.1 使用统一的数据分析软件，对实时荧光定量PCR的原始数据进行操作和分析。
4.2 建立标准化的数据处理流程，包括定量结果的计算、统计学分析和差异性评估。
4.3 结果的解释应基于严谨的科学依据和合理的统计学方法，避免主观性和片面性的评价。
五、结果报告和数据共享5.1 根据实验结果的重要性和可信度，及时撰写实验报告，并以适当的形式进行存档和备份。
5.2 结果报告应明确标注实验过程、方法参数、核心数据和评估结果，以便他人能够验证和复现实验结果。
5.3 鼓励将实验结果和数据共享，提供底层数据和分析工具的访问权限，促进实时荧光定量PCR的进一步发展和应用。
荧光定量PCR引物设计
Novobio Proprietary & Confidential
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围， 则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 2 设计引物
3 qPCR引物特异性验证
1、 进入网页： 2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
The end ! Thank you!
荧光定量PCR引物设计（SYBR@Green）
引物要求： （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。 （5）避开保守区域
1. NCBI Primer blast
选择1 - 无所谓 选择2 - 必须跨不同Exon 选择3 - 可以不跨Exon
勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron （当以基因组DNA为模板时）
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Primer blast
勾选时表示要检测引 物的特异性
填入要比较的物种 （可输入通用名，如 human/mouse/rat/rab bit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
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pcr引物设计的基本要求
pcr引物设计的基本要求
PCR（聚合酶链式反应）引物设计的基本要求如下：
1. 引物长度：PCR引物通常由20至30个碱基对组成，较短的引物可以提高PCR反应的有效性。
2. 引物富含GC碱基：GC碱基对形成的氢键比AT碱基对更强，因此引物中富含GC碱基可以提高PCR引物与模板DNA 的互补性。
3. 引物的熔解温度（Tm）：引物的Tm值应该在50～65°C之间，以确保合适的PCR反应条件。
4. 引物特异性：引物应该具有高度的特异性，能够区别目标序列与其他可能存在的类似序列。
5. 避免互相补合：引物应该避免互相补合，以防止引物之间的非特异性扩增。
6. 引物3'末端应该避免由于引物自身的互补性引起的引物二聚体和剪切子聚合物。
7. 引物的末端应该避免带有互补性，以避免在扩增反应中自身剪切。
以上是PCR引物设计的一些基本要求，不同实验目的下可能还会有其他特殊要求。
荧光定量PCR引物设计要求
荧光定量PCR引物设计要求
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引物设计
荧光定量PCR引物的具体设计要求：
1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。
2. 产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
4.G+C含量在40%~60%之间，45-55%最佳。
5.碱基要随机分布，尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。
假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
16.TM值在58-62度之间。
17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。
用染料做荧光定量不如探针特异性好，具体操作一下就知道了!
可以多定几对引物，免得摸条件浪费时间和金钱!试剂很贵的!。
荧光定量pcr引物设计原理
荧光定量pcr引物设计原理荧光定量PCR（qPCR）引物设计的原理是基于PCR技术和荧光探针技术相结合。
PCR是一种从一小段DNA模板扩增特定DNA序列的技术，而荧光探针则是一种特殊的DNA探针，带有荧光物质，可以用来检测PCR反应过程中特定DNA序列的累积量。
荧光定量PCR的引物设计主要包括前向引物（forward primer）和反向引物（reverse primer）。
这两个引物被设计成具有与目标序列的两个不同区域互补的DNA序列。
在PCR反应中，这两个引物会结合到模板DNA上，并在酶的催化下引发DNA链的扩增。
为了确保引物能够选择性地结合到目标序列，需要注意以下几个原则：1. 引物长度：引物的长度通常在18-25个碱基对之间。
引物过短可能导致非特异性结合，引物过长则可能导致扩增效率降低。
2. GC含量：引物的GC含量通常在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物结合不稳定或影响扩增效率。
3. 互补性：前向引物和反向引物应该在目标序列的不同位点，且二者之间不应有显著的互补性。
否则将导致引物之间的非特异性结合和产生副产物。
4. 特异性：引物应该能够特异性地结合到目标序列，而不结合到其他非目标序列。
为了确保特异性，可以使用计算软件进行序列比对和BLAST分析。
此外，为了进行荧光定量PCR，还需要引入荧光探针。
荧光探针是一种特殊设计的DNA或RNA探针，通常带有一个荧光物质和一个荧光耦合的荧光素（quencher）。
在PCR反应中，荧光探针与目标序列的靶标区域互补结合。
当荧光探针结合到目标序列时，荧光物质和荧光素之间的空间距离会增大，导致荧光物质释放出荧光信号。
这个信号可以被PCR仪器检测到，并用于测量PCR反应过程中目标序列的累积量。
总之，荧光定量PCR引物设计需要考虑引物的长度、GC含量、互补性和特异性。
同时，还需要设计荧光探针来检测目标序列的累积量，以实现定量PCR的功能。
qPCR引物设计
填入要比较的物种 （可输入通用名，如 human/mouse/rat/rab bit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
勾选”show results in a new window”--》点击”Get Primers”
Primer blast – 结果
qPCR引物设计
荧光定量PCR
荧光定量PCR引物设计（SYBR@Green）
引物要求： （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。 （5）避开保守区域
3 qPCR引物特异性验证
1、 进入网页： 2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 1 搜索引物保守序列（与转录组比较）
黄色区域为相对保守序列，设计引物是要尽量避开
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 2 设计引物
1. NCBI Primer blast
NCBI 设计引物网址：
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围， 则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
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荧光定量PCR引物设计要求
荧光定量PCR引物的具体设计要求：
1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。
2. 产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
4.G+C含量在40%~60%之间，45-55%最佳。
5.碱基要随机分布，尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于
9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。
假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
16.TM值在58-62度之间。
17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。
ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAA GTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTT CGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGG CTGGGGC TGACTTTGTGGTC GAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGG TGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAA GGAATACACACCCGAGC TTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGC CAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCAC TCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'
5' GACCACAAAGTCAGCCCCAG3'
ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAA GTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTT CGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGC TGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGG TGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAA GGAATACACACCCGAGC TTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGC CAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGG CTGCCAC TCAAAAGACTGTTG ATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'
5' CAACAGTCTTTTGAGTGGCAG3'
5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3'
5' GCACAGTTGTCA TAAGACCCTCAAC 3'
5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3' 5' GACCCTCAACAATGCCAAACC 3'
5' CAACGAGAAGGAATACACACC 3' 5' ACCCTCAACAA TGCCAAAC 3'
TKGAPDH内参qRT-PCR引物的设计如下：
1.119bp
ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTAT GACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGT GAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGAC TTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCA AAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGT GTCAACGAGAAGGAA TACACACC CGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAG GTCATAAACGACAG GTTTGGCATTGTTGAGGGTCT TATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAA AAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
TKGAPDH-qF 5' GTCAACGAGAAGGAATACACACC3'
TKGAPDH-qR 5' AGACCCTCAACAATGCCAAAC3'
2. 156bp ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTAT GACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGT GAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGAC TTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCA AAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAAGGAA TACACACCCGAGC TTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAG GTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTAT GGCTGCCACTCAA AAGACTGTT GATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
TKGAPDH-QF 5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'
TKGAPDH-QR 5' AACAGTCTTTTGAGTGGCAGCC3'。