实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化
荧光定量PCR原理与实验流程
林天时 王秋泉 Field Application Scientist 400 820 8982 / 800 820 8982 - 2 - 3 cnmcbsupport@
Life Technologies™ Proprietary | 1
实时荧光定量PCR技术原理
•ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 3 4 5 6 Proprietary | 54 Life Technologies™ Dye Examples FAM™, SYBR®, SYTO®9 (MeltDoctor™), Fluorescein, SYPRO® Orange VIC®, JOE™, TET™, HEX™ NED™, BODIPY® TMR-X，TAMRA™ ROX™, Texas Red® LIZ™ Alexa Fluor®, Joda-4 Excitation Wave Lenthgh 455~485nm 510~530nm 540~550nm 570~590nm 630~650nm 650~670nm Emission Wave Lenthgh ~520nm ~550nm ~580nm ~620nm ~680nm ~710nm
455~485nm
•7500实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 3 4 5
Life Technologies™ Proprietary | 52
Dye Examples FAM™, SYBR® VIC®, JOE™ NED™, Cy3，TAMRA™ ROX™, Texas Red® CY5 Dye™
定量PCR如何工作?
• PCR反应液加入了 各种类型的荧光标记物
一个PCR循环
实时荧光定量PCR技术
千里之行，始于足下。
Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。
染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。
荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。
目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。
二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。
2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。
3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。
4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。
三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。
荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。
实时荧光定量PCR国际化标准(二)2024
实时荧光定量PCR国际化标准（二）引言概述实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高灵敏、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物研究等领域。
为了实现方法和数据的国际标准化，国际上制定了实时荧光定量PCR的国际化标准。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的主要内容。
正文内容一、技术要求1.1 具备规范的实验室条件，包括洁净、无尘、无RNA酶污染的实验环境。
1.2 使用具有良好稳定性、一致性和可追溯性的荧光探针和引物。
1.3 验证实验室使用的仪器设备，确保其精确、重复性和灵敏度符合国际标准。
二、质量控制2.1 建立质量控制体系，包括核酸提取、反转录、荧光探针标记等各个环节的质量控制。
2.2 使用合适的内部参照基因或内质控，用于验证试剂盒、仪器设备和实验操作的稳定性和可靠性。
2.3 建立监控样本和质控品的库存管理系统，确保其有效性和可追溯性。
三、方法标准化3.1 设计标准化的实验操作流程，包括样品制备、反转录、PCR 扩增和数据分析等。
3.2 使用适当的PCR引物和荧光探针，根据模板序列设计合理的引物和探针。
验证其特异性和灵敏度。
3.3 建立标准曲线和基准值体系，用于测定目标基因的定量结果，并进行结果的准确性评估。
四、数据分析和结果解释4.1 使用统一的数据分析软件，对实时荧光定量PCR的原始数据进行操作和分析。
4.2 建立标准化的数据处理流程，包括定量结果的计算、统计学分析和差异性评估。
4.3 结果的解释应基于严谨的科学依据和合理的统计学方法，避免主观性和片面性的评价。
五、结果报告和数据共享5.1 根据实验结果的重要性和可信度，及时撰写实验报告，并以适当的形式进行存档和备份。
5.2 结果报告应明确标注实验过程、方法参数、核心数据和评估结果，以便他人能够验证和复现实验结果。
5.3 鼓励将实验结果和数据共享，提供底层数据和分析工具的访问权限，促进实时荧光定量PCR的进一步发展和应用。
荧光定量PCR技术
03
结果重复性差
可能原因包括实验操作不规范、仪器 故障等。解决方案包括规范实验操作 、定期维护和校准仪器等。
05
荧光定量PCR技术在生物医学 研究中的应用
基因表达水平检测
绝对定量
通过标准曲线对未知模板进行定量分析，确 定基因的表达量。
相对定量
比较不同样本间基因表达的差异，常用于研究基因 在不同组织、不同发育阶段或不同处理条件下的表 达模式。
光信号的特性，实现对PCR产物的实时监测。
02
第二代荧光定量PCR技术
引入了特异性更高的荧光探针（如TaqMan探针），提高了检测的准确
性和特异性。
03
第三代荧光定量PCR技术
在第二代技术的基础上，进一步改进了荧光探针的设计，引入了多种荧
光基团和猝灭基团，实现了多重荧光定量PCR检测。
应用领域及意义
研究微生物与环境因素的相互作用
荧光定量PCR技术可用于研究微生物与环境因素（如温度、pH值、营养物质等）的相互 作用，揭示微生物在环境中的适应机制和生态功能。
食品安全领域应用
检测食品中的病原微生物
荧光定量PCR技术可用于快速、灵敏地检测食品中的病原微生物，如沙门氏菌、大肠杆菌等，保 障食品安全。
评估食品中的转基因成分
重复性原则
设计合理的实验重复和对照，以验证结果的 稳定性和可靠性。
定量准确性原则
选择合适的荧光定量方法和标准曲线，确保 目标序列的准确定量。
样品准备与DNA提取方法
样品准备
收集待测样品，如组织、细 胞、血液等，并进行适当的 处理，如研磨、裂解等，以
释放DNA。
DNA提取方法
根据样品类型和实验需求选 择合适的DNA提取方法，如 酚氯仿抽提法、试剂盒法等 ，以获得高质量的DNA模板
定量PCR反应体系优化及实验实例
定量PCR反应体系优化及实验实例定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于精确测量靶标DNA 或RNA分子在样本中的相对和绝对数量的技术。
在进行定量PCR反应时，有几个关键因素需要优化，包括引物和探针的选择和设计、PCR反应体系的优化以及PCR程序的设置。
下面将介绍如何优化定量PCR反应体系，并给出一个实验实例。
1.反应体系组分的优化：-模板DNA或RNA的浓度：根据样本中目标分子的预期含量来确定合适的模板浓度。
通常情况下，应在反应开始时进行浓度递减实验，并在样本的线性范围内选择最佳浓度。
-引物和探针的浓度：引物和探针的浓度也需要优化，以确保在合适的浓度范围内扩增特定的靶标。
通常情况下，可以选择不同的引物和探针浓度进行实验，并选择产生最佳信号的浓度。
- 酶的浓度：比如Taq DNA聚合酶的浓度也需要进行优化，确保反应酶活性处于最佳状态。
通过实验，可以确定在不同酶浓度下扩增产物的线性范围。
2.反应条件的优化：-引物和探针的退火温度：引物和探针的退火温度是非常重要的，它们直接影响特异性和效率。
合适的退火温度可以提高PCR产物的特异性，避免非特异性扩增。
-延伸时间：合适的延伸时间可以确保反应中的扩增产物达到最大的量，但时间过长可能会导致非特异性扩增或降低效率。
通过递增延伸时间进行优化可以找到最佳时间。
- Annealing时间：引物的退火时间也需要进行优化。
合适的退火时间可以确保引物结合到模板的特定位点，并在此过程中提高特异性。
下面是一个实例，用于定量PCR分析一个基因在不同组织中的表达水平：1.实验目的：测量特定基因在肝脏和肺组织中的表达水平。
2.实验步骤：-收集肝脏和肺组织样本，提取总RNA。
-利用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
-设计引物和探针：根据目标基因序列，设计特异性的引物和探针。
-优化PCR反应体系：-测试不同模板浓度，并选择产生最佳信号的浓度。
-优化引物和探针的浓度。
实时荧光定量pcr标准曲线
实时荧光定量pcr标准曲线实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）是一种用于检测DNA 或RNA的定量分析技术，其基本原理是利用DNA或RNA在PCR过程中产生的荧光信号来实时监测目标序列的扩增情况。
实时荧光定量PCR标准曲线是评估PCR反应效率和定量分析的重要工具，下面将介绍实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法及其在定量分析中的应用。
1. 实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法。
实时荧光定量PCR标准曲线的构建需要使用一系列已知浓度的模板DNA或RNA标准品，通过对这些标准品进行系列稀释，得到一系列浓度不同的标准曲线点。
在PCR反应中，利用这些标准曲线点进行定量分析，可以得到PCR反应的效率和灵敏度。
首先，选择合适的模板DNA或RNA标准品，可以是纯化的基因片段、合成的基因片段或者已知浓度的cDNA。
然后，对标准品进行系列稀释，通常选择10倍稀释系列，以得到一系列浓度不同的标准曲线点。
接下来，进行实时荧光定量PCR反应，利用这些标准曲线点进行定量分析，得到PCR反应的效率和灵敏度。
2. 实时荧光定量PCR标准曲线在定量分析中的应用。
实时荧光定量PCR标准曲线在定量分析中起着至关重要的作用。
首先，通过标准曲线可以评估PCR反应的效率，即每个循环的扩增倍数，从而判断PCR反应的质量和稳定性。
其次，利用标准曲线可以进行定量分析，计算待测样品中目标基因的相对或绝对含量，从而实现对目标基因的定量检测。
在实际操作中，构建实时荧光定量PCR标准曲线需要严格控制实验条件，确保反应体系的稳定性和准确性。
此外，选择合适的荧光探针和引物对于实时荧光定量PCR的准确性和灵敏度也至关重要。
总之，实时荧光定量PCR标准曲线是实时荧光定量PCR技术中的重要工具，其构建和应用对于PCR反应的效率评估和目标基因的定量分析具有重要意义。
在实际应用中，科研人员需要充分理解实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法和应用原理，以确保实验结果的准确性和可靠性。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40μgRNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE 中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。
可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。
2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。
3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。
4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。
5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。
6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。
注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。
7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。
8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。
9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。
根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。
10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。
11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。
常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。
12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。
13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。
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实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化
实时荧光定量PCR以其精确、快速、方便，越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。
但是定量PCR是对精确性要求很高的实验，不仅要求在实验前有比较完整的实验设计方案，而且实验的条件对实验结果的影响也非常大。
这些都是很多老师与学生非常关心的问题，下面分别从这两个方面来对定量PCR实验做一些阐述。
定量PCR实验步骤（以m RNA为例）：
1.设计实验方案：例如对样品、实验组和对照组的一个实验流程设计
2.引物和探针的设计和合成
3.抽提RNA，测定提取的RNA的浓度
4.反转录PCR
5.定量PCR
6.数据分析
在进行定量PCR实验的过程中，PCR的扩增效率是一个非常重要的影响因素，因为定量PCR原理的理论方程是基于扩增效率最大值1，因此高的扩增效率能保证定量PCR实验的精确性及重复性，影响PCR扩增效率主要有以下几个方面：1，扩增子的长度；2，扩增子的GC含量；3，扩增子、引物和探针的二级结构；4，PCR反应各组分的浓度；5，RNA或者c DNA的纯度。
进行定量PCR实验时，必须设计好引物和探针，除了能获得高的扩增效率外，对PCR扩增的特异性、消除DNA的扩增及提高扩增的灵敏度都有很大的影响。
下图就是使用不同的引物和探针对18S RNA进行定量PCR的荧光曲线图（反应条件和模板都相同）。
引物设计原则：
1.上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。
所以引物的选取也要非常的保守。
2.上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
3.确保引物中GC含量在30-80%。
应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G 碱基出现。
引物的3’端最好不为G或/和C。
引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
4.避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。
5．跨外显子设计引物，用于区别或消除DNA的扩增。
探针设计的基本原则：
1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm 值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
3. 确保探针中GC含量在30-80%。
4. 避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基
5. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基。
7. 避免探针与引物之间形成二级结构。
8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm 值应相近。
实时定量PCR体系的优化
1.基本参数的优化：
1）MgCl2的浓度：在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossingpoint)值（指PCR达到指数扩增期时，产生一定的荧光高于背景并为仪器所识别时的循环数），较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。
所以对其的浓度选择应慎重。
一般来说，对以DNA或c DNA为模板的PCR反应，应选择2－5mM浓度的MgCl2，对以m RNA为模板的RT－PCR而言，则应选择的浓度为4－8mM。
2）模板的浓度：如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。
一般而言，使Cp位于15－30个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Cp小于15则应选择较低的模板深度。
对于Cp值的确定，经验上是SYBRGreenI探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。
2.使用SYBRGreenI测定DNA时的条件优化：
1）MgCl2的浓度：大多数引物－模板对其的要求是2－4mM。
2）模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。
DNA 在50ng-5pg之间选择，质粒DNA在106拷贝数左右。
3）引物的浓度：引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。
对于大多数PCR反应，0.3uM是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在0.1－1.0uM之间进行选择，直至达到满意的结果。
4）退火温度：首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃内进行选择。
一般的，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的Tm值有一定的差距。
3.用SYBRGreenI进行一步法RT－PCR的条件优化：
1）MgCl2的浓度：不同的靶分子选用不同的浓度，通常是在4－8mM之间选择。
2）模板的浓度：RT－PCR实验既可以选用总RNA，又可以选用m RNA，其浓度应在1pg-1ug之间选择。
对于低模板浓度，可以增加适量的MS2或用alternative RNA作为载体进行测定。
3）对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。
4.杂交探针测定DNA
1）MgCl2的浓度：在2－4mM的基础上加0.5－1.0mM，但是不要超过2.0mM。
2）杂交探针的浓度：初次实验每个探针用0.2uM，如果信号强度达不到要求，可以增加至0.4uM。
3）对照设置：每一引物都要设阴性对照，每一探针都要设阴性对照。
每次实验都要设阳性对照。
4）其它的条件同SYBRGreenI。
5.用杂交探针进行实时定量RT－PCR：
1）MgCl2的浓度：在4－8mM之间进行选择。
2）杂交探针的浓度：初实验用0.2uM，如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。
3）模板浓度设置：优化的扩增须进行一系列稀释度的实验，在条件有困难的情况下，至少要进行两个稀释度的测定。
选用1pg-1ug的总RNA或是m RNA，若是模板的浓度过小（小于10ng/ul），则可加入MS2或alternative RNA作为载体。
4）对照设置：每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。
6.关于杂交探针的评价：在使用杂交探针进行实验时，必须注意防止探针－引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。
引物－探针二聚体的形成，主要是因为探针可与引物的3’末端杂交，其形成以后，会致使此二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，导致反应的效率下降。
探针其本身能同目的基因相
结合，且其解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应，为了防止发生这种现象，通常是将其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是没有磷酸化，就会产生目的基因的副产品，从而干扰实验结果。
鉴于以上这两点，所以应对探针精心设计，并将其末端完全磷酸化。