复旦生物制药的讲义-发酵罐及灭菌方法汇总.
生物反应与设备—发酵罐的操作(生物制药设备课件)
项目二 发酵罐操作技术
项目二 发酵罐操作技术
温度传感器 培养基灭菌和发酵过程温度的检测范围是0～150℃
热电偶
温度传感器
半导体热敏电阻
泡塔式发酵罐的高径比约为7左右，罐内安装有筛板和 空气分布器，降液管具有液封的作用。
压缩空气由罐底导入，经空气分布器后穿过筛板气孔， 逐板上升。发酵液充满塔体。在空气泡上升的过程中，密度 小的含气发酵液也随之上升，上升后的发酵液释放空气泡， 密度增大，在密度差和重力作用下又沿降液管下降，从而形 成循环。空气泡的上升和发酵液的循环流动，产生气液混合 效果，促进了氧气的溶解。
溶氧电极
项目二 发酵罐操作技术
原电池电极在测量之前无需预热就可对溶液中的溶解氧 浓度改变作出快速响应，系统只需40～50秒就可以达到实 际读数的95％。
极谱溶氧电极采用金、铂等金属和Ag/AgCl 构成 的电解池系统，需要在电极两端加上一恒定的极化电 压。当氧分子渗透过隔膜后，在阴极被还原，从阳 极到阴极的电流与电解液中溶解氧的浓度成正比。
项目二 发酵罐操作技术
任务
自吸式发酵罐
项目二 发酵罐操作技术
发酵罐是微生物大量生长繁殖的场所，是一类重
要的生物反应器。
发酵罐
好氧式发酵罐 厌氧式发酵罐 氧气
通氧气 不需要通入
机械搅拌通风发酵罐
好氧发酵罐
气升式发酵罐 自吸式发酵罐 鼓泡塔式发酵罐
项目二 发酵罐操作技术
自吸式发酵罐
不需要压缩空气，利用特 殊的机械搅拌吸气装置或液 体喷射吸气装置，将无菌空 气吸入罐中，同时实现发酵 液的混合与溶氧传质。
发酵罐的灭菌方法
发酵罐的灭菌方法一、蒸汽灭菌法。
这可是个超级常用的办法呢。
就是把蒸汽通到发酵罐里，高温的蒸汽到处乱窜，那些细菌啥的就受不了啦。
就像是一群小怪兽，被蒸汽这个超级英雄给打得屁滚尿流。
蒸汽温度高呀，能把发酵罐的各个角落都照顾到，不管是罐壁上的，还是各种管道里藏着的细菌，统统都消灭掉。
不过呢，这个过程得小心点，要控制好蒸汽的压力和温度哦，不然发酵罐可能会闹小脾气，比如说被压力搞得变形之类的。
二、化学灭菌法。
这个方法也挺有趣的。
就是用一些化学药剂来杀菌。
比如说过氧化氢呀，它就像一个小小的清洁卫士，跑到发酵罐里到处消毒。
但是呢，用化学药剂灭菌后，得把这些药剂的残留处理好。
要是残留太多，就像是在发酵罐里留了个小隐患，可能会影响到后面发酵的东西呢。
就好比你打扫房间，用了清洁剂，但是不把清洁剂残留擦干净，总会有点小麻烦。
三、干热灭菌法。
干热灭菌就像是给发酵罐来一场干蒸桑拿。
把发酵罐放到高温的环境里，没有水分的那种热哦。
这种方法对于一些不怕干热的东西很有效。
不过呢，它的缺点就是花费的时间可能会长一点。
就像你慢慢烤一个东西，得等好久才能熟透一样。
而且这种方法对于一些比较大的发酵罐，可能效果就没有蒸汽灭菌那么好了，毕竟热传递没有那么快嘛。
四、过滤除菌法。
这个方法很巧妙哦。
它是让空气或者其他东西通过一些特殊的过滤器，这些过滤器就像一个个小筛子，细菌这些大个头就被筛在外面啦，只有干净的东西能进到发酵罐里。
不过呢，这个过滤器得经常检查和更换，要是过滤器破了个小口子，那些细菌就会像小偷一样悄悄溜进去啦。
总之呢，每种灭菌方法都有它的优缺点，要根据发酵罐的具体情况，还有发酵的东西来选择合适的灭菌方法。
就像给不同的人挑衣服，得选最适合的才行呀。
发酵设备的使用和灭菌
万河奔海流。流去不西归。万物盼秋归，归来又复生
消除，但只有当故障排除，蜂音器才能停止报警； 自动或人工控制按钮，用以决定本控制器是处在 自动控制或人工控制状态；电极电导连线分别连
接控制发酵罐的 DO、pH、温度、泡沫、转速、电
机启动、加热和冷却；空气调节装置，控制器的
空气调节装置由进气口、出气口、空气减压阀、 空气压力表、空气流量调节阀和空气流量计组 成，用以调节进入发酵罐的空气流量及压力。进
碱泵，用以向发酵罐加入酸液、碱液以调节培养
液中的 pH；消泡剂加入泵，用以向发酵罐加入消
泡剂，以消除发酵过程中产生的过多的泡沫；报 警及蜂音器按钮，当发酵过程中，电路上发生故 障，如显示屏上显示温度、转速或 DO 值超出本
机的设定值，则显示屏上的相应值闪烁，并发出
“嘟、嘟”声。按此按钮则“嘟、嘟”声可暂时
气管与空气压缩机或氧气瓶相连；出气管与发酵
罐之间接有空气过滤器，以滤除空气中的微生
万河奔海流。流去不西归。万物盼秋归，归来又复生
物，避免染菌。 发酵设备的使用和灭菌
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生物反应器是生物工程的重要组成部分，是 生物技术转化为产品的关键设备，在生物工程中 处于中心地位。机械搅拌式生物反应器，又称发
酵罐，是进行液体发酵的特殊设备。实验室使用
的小型发酵罐，其容积可从 1L 至数百升。发酵
罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试 验所需的培养条件，是微生物学、遗传工程、医 药工业等科学研究所必需的设备。
拌器及冷凝管口等。发酵罐放置在罐座上，罐座 除支持发酵罐外，还有搅拌器转动装置，升温和 冷却装置等。
控制器能够完成基本的控制功能，它由下列
几部分构成：参数输入及显示装置，用以输入控
2.3发酵罐及灭菌方法
第一节 物理消毒灭菌法
热力灭菌法 辐射杀菌法 滤过除菌法 超声波杀菌法 干燥与低温抑菌法
一. 热力灭菌法
干热灭菌法— 焚烧：废弃物、尸体 灼烧：接种环、试管口 干烤：玻璃器皿 红外线：医疗器械 湿热灭菌法（moist heat sterilization)— 巴氏消 毒法：61.6-62.8 ℃30min或71.7℃15-30s,主要用于 牛乳消毒。 煮沸法；流动蒸汽消毒法 间歇蒸汽消毒法； 高压蒸汽灭菌法
消毒剂的种类：酚类、醇类、重金
属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷 化剂。
消毒剂的应用：病人排泄物与分泌
物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空 气、手。
第三节 影响消毒灭菌效果的因素
消毒剂的性质、浓度与作用时间 微生物的种类与数量 温度 酸碱度 有机物
发酵罐按容积分类
一般认为500L以下的是实验室发酵罐；
500-5000L是中试发酵罐；
5000L以上是生产规模的发酵罐。
现代发酵工程规模
低值工业品大型化
以规模来取胜 （几十数百吨）。如味精、氨基酸、 有机酸、抗生素、饲料、食品工业用 产品等；
高价值转基因产品小型化（几十数
百升）。基因工程大肠杆菌、酵母菌 高密度培养；动物细胞植物细胞培养；
二. 辐射杀菌法
紫外线 波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。 其主要作用于DNA，使一条DNA链上相 邻的两个胸腺嘧 啶共价结合形成二聚体， 导致细菌变异和死亡。 电离辐射 高速电子、X射线、γ射线 微波 波长1mm~1m
三. 滤过除菌法
赛氏滤器
玻璃滤器
薄膜滤器
四. 超声波杀菌法
制药行业灭菌汇总方法，不能再详细了！
制药行业灭菌汇总方法，不能再详细了！灭菌法是指用适当的物理或化学手段，将物品中活的微生物杀灭或除去的方法。
本法适用于无菌、灭菌制剂、原料、辅料及医疗器械等生产过程中物品的灭菌。
无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。
然而，对于任何一批灭菌产品来说，绝对无菌是既无法保证也无法用试验来证实的，因为不可能对每一最小包装的产品进行无菌试验。
事实上，物理或化学灭菌方法手段灭菌试验表明：微生物的杀灭曲线遵循对数规则，因此，已灭菌物品的无菌性标准一般在概率意义上定义为污染单位低到可接受的程度。
灭菌产品的无菌保证并不能依赖于最终产品的无菌检验，而是取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理和良好的全面质量保证体系。
灭菌工艺的确定应综合考虑其被灭菌物品的性质、灭菌方法的有效性、经济性以及灭菌后产品、物品的完整性和稳定性等因素。
常用的灭菌方法有蒸汽湿热灭菌法、干热灭菌法、气体灭菌法、辐射灭菌法和过滤除菌法。
可根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法的组合灭菌。
本法是指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽或流通蒸汽灭菌、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。
流通蒸汽不能完全杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。
高压蒸汽灭菌：该法灭菌能力强，为热力学灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。
药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他其它遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可用本法灭菌。
流通蒸汽不能完全杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。
高压蒸汽湿热灭菌条件一般通常采用121℃×20min或116℃×40min的程序，也可采用其它温度和时间参数。
灭菌物品的表面必须洁净，不得污染有机物质。
必要时，外表应适宜包裹，特别是烧瓶、试管等容器的塞子要防止脱落。
灭菌柜内的物品装载方式应保证灭菌蒸汽彻底穿透物品，且不影响蒸汽穿透速度和灭菌后的干燥程度。
发酵罐灭菌方法
发酵罐灭菌方法
发酵罐灭菌是指对发酵罐内的微生物进行有效的杀灭，以保证发酵过程的纯净和安全。
发酵罐灭菌方法有多种，常见的包括高温灭菌、压力灭菌、化学灭菌等。
下面我们就来详细介绍一下这些方法。
首先是高温灭菌法，这是最常见的发酵罐灭菌方法之一。
在高温条件下，微生物会失去活力并被彻底杀灭。
常见的高温灭菌设备有蒸汽灭菌锅和高温热风灭菌箱。
蒸汽灭菌锅利用高温蒸汽对发酵罐内的微生物进行杀灭，而高温热风灭菌箱则通过高温热风的循环对发酵罐进行灭菌。
这两种方法都具有高效、简单、易操作的特点，是发酵罐灭菌的常用手段。
其次是压力灭菌法，这是一种利用高压力对发酵罐内微生物进行灭菌的方法。
在高压力条件下，微生物的细胞壁会破裂从而被彻底杀灭。
常见的压力灭菌设备有高压灭菌锅和压力蒸汽锅。
这种方法具有灭菌效果好、速度快的特点，是一种比较有效的发酵罐灭菌方法。
最后是化学灭菌法，这是利用化学药剂对发酵罐内微生物进行灭菌的方法。
常用的化学药剂有过氧化氢、乙醛等。
这种方法具有操作简单，对设备的腐蚀小的特点，是一种比较方便的发酵罐灭菌方法。
总的来说，发酵罐灭菌方法有多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在进行发酵罐灭菌时，应根据具体情况选择合适的灭菌方法，并严格按照操作规程进行操作，以确保发酵过程的安全和纯净。
发酵工艺：发酵灭菌原理及全自动灭菌技术介绍
发酵工艺：发酵灭菌原理及全自动灭菌技术介绍在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌广泛使用湿热灭菌法。
工厂里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。
用湿热灭菌的方法处理培养基，其加热受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。
营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成，所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热受热时间是灭菌工作的关键。
一、湿热灭菌相关理论：1、微生物的死亡速率：对数残留定律微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。
微生物受热而丧失活力，但其物理性质不变。
在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。
在灭菌过程中，微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，即对数残留定律。
用N表示残留活菌个数，则活菌的减少率（死亡率）与N呈线性关系，即：积分边界条件：N0→Nθ；t0=0注：式中，θ：灭菌时间（s）；K，灭菌速度常数；N0：灭菌开始时培养基中杂菌个数（个）；N：经过灭菌时间θ后残存的活菌数（个），一般取N = 0.001，即1000次灭菌中有1 次失败关于上述公式几点说明：（1）K值越大，微生物越易死亡；（2）一定温度下，K随M种类不同而异。
一般来说，细菌营养体、酵母菌、放线菌、病毒及噬菌体对热的抵抗力较弱，而细菌芽孢、霉菌孢子则较强。
（3）随着温度的变化，K有很大变化。
温度对K的影响遵循阿仑尼乌斯定律：A：系数，s-1；△E：活化能，J/mol；R：气体常数，8.314 J/(mol·K)；T：绝对温度。
2、两种常见灭菌方式：分批灭菌和连续灭菌理论时间计算及优劣比较（1）分批灭菌分批灭菌通常分为升温、保压和降温三个阶段。
如只考虑保温阶段，以耐热的芽孢杆菌为灭菌对象，发酵罐内装培养基40m3，121℃分批灭菌，初始培养基中含芽孢107个/mL，关于理论灭菌时间T计算可根据公式：其中A=1.34×1036 s-1，ΔE=2.844×105 J/mol，则k=0.0281 s－1；No=40×106×107=4×1014个，Nt=0.001个，则T=24min，理论上与一般分批灭菌条件121℃灭菌30min相差不大；若考虑升温阶段对灭菌的贡献，初始温度从100℃计算，从保温开始时培养基中活微生物数不是No而是Np，则：其中Km为100℃至121℃时间内灭菌常数平均值：k m＝0.0061s－1，Np＝2.65×1011个，保温灭菌时间T=19.7min。
发酵培养基灭菌PPT课件
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2、 微生物的死亡速率：对数残留定律 微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生 物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变 性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热 而丧失活力，但其物理性质不变。
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在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反 应速度理论。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其 减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死 亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，
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问题2 1、为防止杂菌的污染，整个生化生产过程哪些需要注意 灭菌？ 培养基、发酵设备、空气、菌种制作
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发酵培养基灭菌
• 一、灭菌的原理和方法 • 二、湿热灭菌原理 • 三、培养基的湿热灭菌方式 • 四、灭菌时间计算与影响因素
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一、灭菌的原理和方法
消毒与灭菌的区别？
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3、灭菌温度和时间的选择
当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾，这 就是，加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有 用成分也会随之遭到破坏，那么有何良策可以既达到灭 菌要求，同时又不破坏或尽可能少破坏培养基中的有用 成分呢？
实践证明，在高压加热的情况下，培养基中的氨基 酸和维生素极易被破坏，如在121℃，仅20min，就有 59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏，蛋氨 酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此，必须选择一个 既能满足灭菌需要，又可使培养基的破坏尽可能小的灭 菌工艺条件。
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问题 灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法 可以采用，一种是118℃灭菌15min，另一种是 128℃灭菌5min。哪一种方法好，为什么？
答：从理论研究和生产实践都可证明，在灭菌过程中，同 时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程 的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温 度的升高更为显著。
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发酵罐按容积分类
一般认为500L以下的是实验室发酵罐；
500-5000L是中试发酵罐；
5000L以上是生产规模的发酵罐。
现代发酵工程规模
低值工业品大型化
以规模来取胜 （几十数百吨）。如味精、氨基酸、 有机酸、抗生素、饲料、食品工业用 产品等；
高价值转基因产品小型化（几十数
百升）。基因工程大肠杆菌、酵母菌 高密度培养；动物细胞植物细胞培养；
培养基（culture medium)是人工配制的适 合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物 的营养基质。 碳源 氮源 无机盐及微量元素 前体、促进剂与抑制剂
培养基的类型
孢子培养基：供菌种繁殖孢子，常用固体 培养基
种子培养基：提供大量优质的菌体，其配 方上应适合于菌体生长于繁殖 发酵培养基：使微生物积累代谢产物，既 要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老， 又要有利于产物的大量合成。
研究中心智能化、全能性。
(二)发酵辅助设备
发酵辅助设备主要包括：无菌空气 系统，培养基配制和灭菌系统、发 酵车间的管道及阀门等。
1、无菌空气系统
好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要 作到 绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济的。 发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂 质，无水，无油，正压等几项指标； 发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵 过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。 在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许 有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为 N=10-3
两级分离、冷却、加热的空气 除菌流程
１——粗过滤器 ４——冷却器
２——压缩机 ５——丝网分离器
３——贮罐 ６——过滤器
高效前置过滤除菌流程
１——高效前置过滤器 ２——压缩机 ３——贮罐 ４——冷却器 ５——丝网分离器 ６——加热器 ７——过滤器
空气净化的流程
吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤 进入空气压缩机（120-150度） 冷却（20-25度），除去油、水，再加热至3035度。 最后通过总过滤器和分过滤器除菌，获得洁净 度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。
发酵设备及检测控制系统 B|Braun公司
•发酵罐：Biostat系列 •参数检测 •多级控制：
Biostat B2
Biostat ED10
Pilot Biostat UD50
国内、外发酵设备公司
德国贝朗 占中国80%以上的市场 瑞士比欧 美国NBS 韩国 日本 华东理工大学 江苏理工大学
第三节 发酵设备及消毒灭菌
典型发酵设备
种子制备设备、主发酵设备、辅助 设备(无菌空气和培养基的制备)，发 酵液预处理设备，粗产品的提取设 备、产品精制与干燥设备、流出物 回收、利用和处理设备等。
一
发酵设备概述
发酵主要设备为发酵罐和种子罐，它们各自 都附有原料 ( 培养基 ) 调制、蒸煮、灭菌和冷 却设备，通气调节和除菌设备，以及搅拌器 等。
种子罐：以确保发酵罐培养所必需的菌体量 为目的。 发酵罐：承担产物的生产任务。它必须能够 提供微生物生命活动和代谢所要求的条件， 并便于操作和控制，保证工艺条件的实现， 从而获得高产。
(一)发酵罐
发酵罐的定义：是为一个特定生物化学过 程的操作提供良好而满意的环境的容器。 对于某些工艺来说，发酵罐是个密闭容器， 同时附带精密控制系统；而对于另一些简 单的工艺来说，发酵罐只是个开口容器， 有时甚至简单到只要有一个开口的坑。
2）实罐灭菌
将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭 菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度， 然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。 操作要点： 三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入 罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定 的时间。这就是所谓的“三路进气”。
发酵罐基本类型
(1）搅拌釜反应器 （stirred tank reactor） (2）气泡柱式反应器 （bubble column) (3) 气升式生物反应器 （airlift reactor) 内管型；外管型
发酵罐工艺操作条件
1．温度 3．灭菌条件；温度100～140℃，压力0～3 kg／cm3 (表压). 4．pH：2～11。 5．需氧量：0．05～0.3 kmo1／m3· h。 6．通气量：0.3～2 VVM。 7．功率消耗：0.5～4kW／m3。 8. 发酵热量：5 000～20 000 kcal／m3．h。
发酵罐系统
一个优良的发酵罐装置和组成 （1）应具有严密的结构 （2）良好的液体混合特性 （3）好的传质、传热速率 （4）具有配套而又可靠的检测、控制仪表
发酵罐的特点
（1）发酵罐对纯种培养的要求高。因此，发酵 罐的严密性，运行的高度可靠性是发酵工业 的显著特点。 （2）发酵罐更加趋向大型化和自动化发展。 自动化方面，如 pH 电极、溶解氧电极、溶解 二氧化碳电极等的在线检测在国外巳相当成 熟。国内目前尚处于起步阶段，发酵检测参 数还只限于温度、压力、空气流量等一些最 常规的参数。
发酵生产中制备无菌空气的大 致过程
高空取气管
高空取气管是远离地面几十米 的管子。一般而言，地面附近 空气中所含的 微生物和灰尘等 均比高空空气中含的多，据资 料介绍，每升高10米，空气中 杂菌可降低一个数量级，因此 从高空取气要比从低空取气有 利得多。
油水分离器
其内部同时采用直接拦截， 惯性碰撞，布朗扩散及凝 聚等机理，能有效地去除 空气中的水、油雾、尘埃， 内部不锈钢丝网可清洗， 使用寿命长。
2、培养基的灭菌
1）空罐灭菌 空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、 还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基 （或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为 空罐灭菌。 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空 罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这 样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。
空气压缩机：目前常用的是往复式空压机 过滤器：空气过滤器的类型很多，有棉花 活性炭过滤器、管式过滤器和接送式过滤 器等。 过滤介质：空气除菌用的过滤介质有：棉 花、活性炭玻璃纤维，超细玻璃纤维纸， 石棉滤板、烧结材料、聚乙烯醇(PVA)等多 孔合成树脂、素烧陶瓷筒和聚碳酸酯等。
培养基