稀释培养和稀释平板测数法
平板菌落计数法
平板菌落计数法农资101 1031240125 周瑶实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。
实验方法1、样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml 无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。
放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不准确，结果误差较大。
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。
样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。
通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。
平板菌落计数法的步骤
平板菌落计数法是一种常用的微生物计数方法，通过稀释液体样品、平铺在琼脂平板上、培养和计数菌落数量，可以确定原液中微生物的浓度。
这种方法可以应用于食品、环境和医药等领域的微生物数量测定，为微生物研究和质量控制提供了重要的手段。
平板菌落计数法的基本步骤如下：
1、准备无菌的培养基、试管、吸管、平皿、酒精灯等器材，以及待测的样品和适合的稀释液（如无菌水或盐水）。
2、将样品制成一系列的稀释液，通常采用10倍递增的稀释法，即每次取1mL的上一级稀释液加入9mL的稀释液中，充分混匀，得到下一级稀释液。
3、从每个稀释液中分别取出一定量（如0.1mL或1mL）置于灭菌平皿中，与已熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，或者涂抹在已凝固的琼脂培养基上，使菌液均匀分布于培养基内。
4、在一定的温度下，培养一定的时间（通常为24至48小时），使菌液中的单个细胞生长繁殖成可见的菌落。
5、从每个平皿中计数菌落数量，选择菌落数在30至300之间的平皿，用计数器或计数板辅助计数，避免重复或遗漏。
6、根据计数结果和稀释倍数，计算原液中的菌落数量和浓度，通常用每毫升或每克的活菌数（CFU/mL或CFU/g）表示。
高中生物选修三：稀释涂布法与平板划线法的区别
高中生物选修三：稀释涂布法与平板划线法的区别
一、平板划线分离法
先倒制无菌琼脂培养基平板，待充分冷却凝固后，在无菌条件下，用接种环沾取少量待分离的含菌样品，在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。
划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。
通过这样在平板上进行划线稀释，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。
经培养后，可在平板表面形成分散的单个菌落。
但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线1-2次，并结合显微镜检测个体形态特征，才可获得真正的纯培养物。
●用途：一般多用于从菌株的纯化
●优点：简便快速，可以观察菌落特征
●缺点：不能用于计数
二、稀释涂布平板法
该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基，先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。
待充分冷却凝固后，将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用三角形无菌玻璃涂棒涂布，使菌液均匀分散在整个平板表面，倒置温箱培养后挑取单个菌落。
●用途：一般多用于筛选菌株
●优点：可以计数，可以观察菌落特征。
计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。
●缺点：操作相对麻烦。
稀释涂布平板法计数公式
“微生物数量测量”是2017年高考大纲中的新内容，也是教学中的重要难点。
稀释涂板法是计数微生物的常用方法，用于计数样品中活菌的数量。
当样品的稀释度足够高时，在培养基表面上生长的菌落来自样品稀释液中的活细菌。
通过计算平板上的菌落数，我们可以猜测样品中有多少种活细菌。
但是，菌落计数结果的处理常常成为学生容易出错的地方。
典型示例：在从土壤中分离产生脲酶的细菌的实验中，将10g土壤样品溶液进行梯度稀释，并将0.1mL稀释倍数为105的土壤样品溶液接种在三个中板上。
培养一段时间后，平板上的细菌菌落数分别为42、200和256。
1g土壤样品中的细菌数为。
在PEP高中生物学选修课“生物技术实践”中，有这样一条陈述：用稀释包被板法计数菌落：为了确保结果的准确性，菌落数在30到30之间通常选择300和300进行计数。
但是，如果我们理所当然地认为42、200和256个数据都在30〜300范围内，那么直接对它们求平均并乘以稀释倍数就可以得出错误的结果1.66×108。
这也是许多学生犯错误的原因。
实际上，教材中的相关表述仅说明了可计数菌落数的适当范围。
在一定稀释度下，三个平板中的菌落数不能简单地直接平均，应注意稀释度的设定和计数结果的允许差异。
为了确保准确确定有效活菌计数，必须设置三个稀释度并进行分级，并且每个梯度应设置三个重复。
为了确定土壤中细菌的数量，通常使用104、105和106倍的稀释剂进行平板培养。
为了确定放线菌的数量，通常使用103、104和105倍的稀释度。
为了确定真菌的数量，通常使用102、103和104倍的稀释度。
如果平板中的菌落数太少，必然会导致计数误差太大；相反，如果培养皿中的菌落太多，将导致计数困难。
因此，世界上菌落计数的基本原理是对稀释的平板进行计数，其中平板上有30〜300个菌落。
同时，相同稀释度重复3次的平板上菌落数的标准差应小于允许的差。
也就是说，在平板计数试验中，如果在相同稀释度下三个重复菌落的数量在30〜300之间，但是数据相差很大，则需要将其丢弃。
平板计数法
平板菌落计数法平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。
方法如下：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
目录一、菌落总数介绍：二、检验方法三、说明一、菌落总数介绍：二、检验方法三、说明展开但是，由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu ：colony-forming units），而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
[1]编辑本段一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
编辑本段二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
大肠菌群检测中平板计数法主要操作要领
大肠菌裙检测是一项非常重要的微生物检测工作，它可以帮助我们了解环境和食品中是否存在大肠菌裙，从而保证人们的健康安全。
在大肠菌裙检测中，平板计数法是一种常用的检测方法。
下面将介绍大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领。
1.准备工作在进行大肠菌裙检测之前，需要准备相应的实验器材和培养基。
实验器材包括平板计数仪、移液器、无菌培养皿等。
培养基一般选择大肠埃希氏菌（EC）培养基。
2.样品处理将待测样品取适量放入无菌容器中，进行适当的稀释。
这一步要确保样品的稀释倍数适中，以保证后续的计数结果准确。
3.接种和培养取一定量的处理过的样品，在无菌工作台上均匀涂抹于含有适量培养基的培养皿上，然后进行培养。
培养条件一般为37摄氏度，培养时间为24小时。
培养后会形成菌落，这些菌落代表了原始样品中的细菌数量。
4.计数和记录在培养后，利用平板计数仪对菌落进行计数。
计数的时候需要注意避免重复计数同一菌落，保证计数准确。
需要记录计数结果，包括菌落数量和相应的单位。
5.结果分析根据计数结果，可以对原始样品中的大肠菌裙数量进行估算。
可以通过对对照组和样品组的比较来判断样品中大肠菌裙的数量是否合格。
大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领就是以上几点。
通过严格按照这些要领进行操作，可以确保检测结果的准确性和可靠性。
在进行操作过程中，还需要遵守无菌操作规范，确保实验过程中不受外界污染。
希望大家在进行大肠菌裙检测时能够严格按照操作要领进行，保证测试结果的准确性，从而更好地保障人们的健康安全。
大肠菌裙检测中的平板计数法是一种经典的微生物计数方法，它主要用于测定食品、饮用水、环境等样品中大肠菌裙的数量。
在这个过程中，我们需要注意几个关键的环节，来保证实验的准确性和结果的可靠性。
在准备工作环节，我们需要保证实验器材和培养基的质量。
实验器材一定要经过严格的消毒和清洁，以免外来细菌的污染影响实验结果。
培养基的选用也尤为重要，要选择与待测细菌的生长要求相适应的培养基，以保证细菌在培养基上的正常生长。
细菌数量测定---标准平板计数法
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样 接种量即可换算出样品中的含菌数。由 于待测样品往往不易完全分散成单个细 胞。所以平板菌落计数法结果往往偏低。 现在常使用菌落形成单位。
三、实训仪器和材料
1、仪器：恒温培养箱。高压蒸汽灭菌锅，
电热套、托盘天平 吸量管、烧杯、三角瓶、培养皿、试管、 试管架、酒精灯 2试剂：大肠杆菌悬液、牛肉膏蛋白胨培 养基（营养琼脂培养基），生理盐水、盐 酸、氢氧化钠、蒸馏水
2、倒平板：在上述平皿中倒入熔化并冷 却至50℃左右的琼脂培养基约15~20 mL，置 水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，于37℃ 培养箱中倒置培养24h。
（五）计数
取出平皿，观察并计算菌落数。一般 选择平皿上长有30~300个菌落的稀释度 计算每毫升的菌落数最合适。
算出同一稀释度2个平皿上的菌落平 均数，并按下列公式计算： 活菌落数/mL=同一稀释度2个平皿上 的菌落平均数×稀释倍数×5
检验结果
稀释度
10-4
1 2 平均 1
10-5
2 平均 1
10-6
2 平均Biblioteka 菌落数活菌数 /mL
活菌落数/mL=同一稀释度2个平皿上的菌落平均数×稀释倍数×5
在上述平皿中倒入熔化并冷却至50左右的琼脂培养基约1520ml置水平位置迅速旋动混匀待凝固后于37培养箱中倒置培养24h
细菌数量测定---标准 平板计数法
一、实训目的
1、掌握菌液稀释的方法和步骤。
2、掌握浇混接种的操作步骤。 3、掌握菌落计数的原理与方法
二、实训原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当 稀释后，其中的微生物充分分散为单个 细胞，取一定量的稀释液接种到平板上， 经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形 成的肉眼可见的菌落，即代表原样品中 的一个单细胞。
稀释培养和稀释平板测数法
稀释培养和稀释平板测数法稀释培养测数法一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。
见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。
根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。
具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。
培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；稀释度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8重复数 5 5 5 5 5 5出现生长的管数 5 5 5 4 1 0根据以上结果，在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。
由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100 000）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
稀释培养测数法
一、实验目的
通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理
最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。
见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。
根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。
具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。
培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；
稀释度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8
重复数 5 5 5 5 5 5
出现生长的管数 5 5 5 4 1 0
根据以上结果，在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。
由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100 000）。
那么，1ml原菌液中的活菌数＝17×100 000 = 17×105。
即每毫升原菌液含活菌数为l700000个。
在确定数量指标时，不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可将此数加到前面相邻的第三位数上即可。
如某一微生物生理群稀释培养记录为：
稀释度 lO-1 10-2 10-3 lO-4 10-5 10-6
重复数 4 4 4 4 4 4
出现生长的管数 4 4 3 2 1 0
以上情况，可将最后一个数字加到前一个数字上，即数量指标为“433”，查表得近似值为30，则每毫升原菌液中含活菌30×102个。
按照重复次数的不同，最大或然数表又分为三管最大或然数表、四管最大或然数表和五管最大或然数表。
应用MPN计数，应注意两点，一是菌液稀释度的选择要合适，其原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。
对土壤样品而言，分析每个生理群的微生物需5—7个连续稀释液分别接种，微生物类群不同，其起始稀释度不同(见附表1)；二是每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般2—5个重复，个别也有采用2个重复的，但重复次数越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确。
不同的重复次数应按其相应的最大或然数表计算结果。
若要求出土样中每克干土所含的活菌数，则要将前述两例中所得的每毫升菌数除以干土在土样中所占的质量分数（烘干后的土样质量／原始土样的质量）。
计算式为：
三、实验器材
1. 土壤样品：肥沃菜园土
2. 培养基：阿须贝（Ashby）无氮培养液(附录三、15)22管(每管装5ml，加1cm×4.5cm滤纸l 条)
3. 器材：90ml无菌水（装入250 ml三角瓶中，并装有15—20个玻璃珠）、9ml无菌水、lml 刻度无菌吸管、试管架、记号笔。
四、实验方法
1．称取10克土样，放入90ml无菌水中，振荡20min，让菌充分分散，然后按十倍稀释法将供试土样制成10-1—10-6的土壤稀释液。
2．将22支装有Ashby无氮培养液的试管按纵4横5的方阵排列于试管架上，第一纵列的4支试管上标以10-2，第二纵列的4支试管上标以10-3……第五纵列的4支管上际以10-6（即采用5个稀释度，4个重复），另外2支试管留作对照。
3．用lml无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6的土壤稀释液各lml放入编号10-6的4支试管中，再吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的4支试管中，同法吸取10-4、10-3、10-2稀释液各lml放入各自对应编号的试管中。
对照管不加稀释液。
3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。
四、实验方法
1．样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）。
图22-1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。
样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。
通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。
2．平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。
（1）混合平板培养法将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。
然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基(图22-2)，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。
至长出菌落后即可计数。