实验六 稀释平板计数法
实验六 细菌计数法
实验六细菌计数法菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
目录菌落总数介绍检验方法说明（一）样品的处理和稀释：（二）倾注培养（三）计数和报告菌落总数介绍菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。
检验方法参见：GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》说明（一）样品的处理和稀释：1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
稀释涂布平板法计数公式
稀释涂布平板法计数公式
稀释涂布平板法计数公式：是每克样品中的菌株数=（C÷V）×M，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
扩展资料：
稀释涂布平板法是微生物学实验中的操作方法之一，将含菌材料放入热培养基后再倒入平板，容易导致热敏感菌死亡，而且采用稀释平板法，由于固定在琼脂正中缺氧，影响严格好氧菌的生长，因此微生物学研究中最常用的纯血种分离方法是稀释涂布平板法。
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上形成的单一菌落，即单细胞繁殖这一培养特征而设计的计数方法，一个菌落代表单细胞；计数时，首先使检体成为均匀的系列稀释液，尽量使检体中的微生物细胞分散，作为单一细胞存在，然后取一定的稀释度、一定量的稀释液，均匀地分布在平板中的培养基内，培养后，各个细胞增殖形成菌落，通过计数菌落数，可以计算样品中的菌数。
稀释培养和稀释平板测数法
稀释培养和稀释平板测数法稀释培养测数法一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。
见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。
根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。
具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。
培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；稀释度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8重复数 5 5 5 5 5 5出现生长的管数 5 5 5 4 1 0根据以上结果，在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。
由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100 000）。
稀释涂布平板法计数公式
显微镜计数法即血球计数法，事先把菌液稀释到一定的倍数，然后通过血球计数板在显微镜下计数。
此法计数比较精准。
活菌计数法是将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.2ml放入无菌平皿，再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数：每毫升原菌液活菌数=同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5稀释涂布平板法是一种粗略的活菌计数法，即通过一定的稀释倍数，涂布到平板上，在适宜的条件下培养后，观察活菌数。
平板划线法是用来分离单菌落的一种方法，不是计数的方法。
如果只有一个稀释度的平均菌落数符合30~300这个范围
则以该稀释度平均菌落数除以涂布平板所用稀释液体积(0.1mL)，乘以稀释倍数作为该样品的细菌总数
如果有两个稀释度的平均菌落数符合要求
则按照两者菌落总数之比来决定
如果小于2，取两者的平均值
如果大于2，取较小的菌落总数
本题的46*10^3与295*10^2的比之为1.6
应取两者的平均值
（46*10^3+295*10^2)/0.1/2=3.775*10^5
相当于统计学里面的比较差异，
如果多比少大于2倍，则梯度浓度差异是10倍的情况下，其菌落是有很多重叠或者链接在一起的，这样就无法计算清楚是否为单菌落了，所以只有选择较小的菌落数。
来保证以上要求。
稀释平板计数法
实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。
实验器材LB液体、固体培养基1m1移液器，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。
实验步骤1．无菌器材的准备(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。
(2) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。
2．样品稀释液的制备(1) 编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。
另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
(2) 稀释用1m1移液器吸取0.5m1己充分混匀的菌悬液(待测样品)，至10-1的试管中，此即为10倍稀释。
将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。
用1m1移液器在10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。
吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面。
混匀后吸取至10-2试管中，此即为100倍稀释。
……其余依次类推，整个过程如图所示。
3．平板接种培养平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。
稀释平板计数法的原理和方法
稀释平板计数法的原理和方法
嘿，朋友们，今儿咱们来聊聊那个“稀释平板计数法”是咋个回事儿。
这个啊，咱们四川人儿叫“平板计数法”，陕西的朋友可能直接就说“计数法”，而北京的哥们儿估计会叫得更正式些。
但不管咋叫，这法儿都是用来计算微生物数量的。
咱们先从原理说起。
这个“稀释平板计数法”的原理啊，就像咱们四川人做泡菜一样，得掌握好比例和条件。
简单来说，就是把微生物样本进行一系列稀释，然后分别涂布在培养基平板上，让微生物在适宜的条件下生长。
长得好的那些菌落，咱们就能数出来，从而推算出原样本中微生物的数量。
再来说说方法。
首先呢，得准备好培养基平板，这就像是咱们陕西人准备面团一样，得精心调配。
然后，把微生物样本进行稀释，这一步很关键，得稀释到合适的程度，才能让微生物在平板上分散开，长成单个菌落。
接着，就是把稀释后的样本涂布在平板上了，这个得涂得均匀，不能厚此薄彼。
最后，就是放在培养箱里培养，等微生物长出来，咱们就能数菌落了。
这法儿虽然看起来简单，但实际操作起来还是有不少讲究的。
比如稀释的倍数、培养的条件、计数的方法等等，都得根据具体情况来调整。
就像咱们北京人说的，“做事儿得讲究个精细”，这“稀释平板计数法”也是这么回事儿。
总之啊，这个“稀释平板计数法”是个挺实用的方法，能帮咱们了解微生物的数量和分布情况。
不管是四川的、陕西的还是北京的，咱们都得好好掌握这个方法，才能更好地研究微生物、保护咱们的健康和环境。
稀释平板计数法
稀释平板计数法实验目得学习稀释平板菌落计数得基本原理与方法。
实验内容用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。
实验原理平板菌落计数法就是将待测样品经适当稀释之后，其中得微生物充分分散成单个细胞，取一定量得稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见得菌落，即一个单菌落应代表原样品中得一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数与取样接种量即可换算出样品中得含菌数。
但就是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成得一个单菌落也可能来自样品中得2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数得结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数得结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品得活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素得影响，但就是，由于该计数方法得最大优点就是可以获得活菌得信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料与水〔包括水源水〕等得含菌指数或污染程度得检测。
实验器材酿酒酵母菌悬液马铃薯培养基1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。
实验步骤1．无菌器材得准备(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。
(2) 无菌移液管得准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1、5cm ），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面得微生物吹入。
棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。
然后将移液管尖端放在4~5cm宽得长纸条一端呈45º角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。
(3) 无菌水：取6支试管，分别装入4、5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。
2．样品稀释液得制备(1) 编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。
另取6支盛有4、5m1无菌水得试管，依次标就是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
稀释涂布平板法计数例题
稀释涂布平板法计数例题摘要：1.稀释涂布平板法简介2.稀释涂布平板法的操作步骤3.稀释涂布平板法的计数规则4.稀释涂布平板法在实际应用中的注意事项5.总结正文：一、稀释涂布平板法简介稀释涂布平板法是一种常用的微生物计数方法，主要用于统计细菌数目。
通过将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液涂布到培养基平板上，经培养后形成单菌落，从而实现微生物的计数。
二、稀释涂布平板法的操作步骤1.制备菌液：首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使微生物细胞分散，保证单细胞存在。
2.涂布平板：取定稀释度、定量稀释液接种平板，使其均匀布于平板培养基内。
3.培养：将平板培养基在适当的温度和湿度下培养一段时间，让微生物在培养基上形成单菌落。
4.计数：统计菌落数目，通常选择30~300 个菌落进行计数。
根据稀释倍数和涂布量计算原始菌液的浓度。
三、稀释涂布平板法的计数规则1.如果只有一个稀释度的平均菌落数符合30~300 这个范围，则以该稀释度平均菌落数除以涂布平板所用稀释液体积（0.1ml），乘以稀释倍数作为该样品的细菌总数。
2.如果有两个稀释度的平均菌落数符合要求，则按照两者菌落总数之比来决定。
如果小于2，取两者的平均值；如果大于2，取较小的菌落总数。
四、稀释涂布平板法在实际应用中的注意事项1.稀释倍数的选择：通常选择10^-4~10^-8 的稀释倍数范围进行实验。
2.涂布量的控制：涂布量要适中，过多会导致菌落重叠，影响计数准确性；过少则可能导致菌落数量过少，影响计数精度。
3.培养条件的控制：培养过程中要保证适当的温度和湿度，以利于微生物的生长和形成单菌落。
4.计数时机的选择：一般选择菌落数稳定时进行计数，以保证计数准确性。
五、总结稀释涂布平板法是一种简单且常用的微生物计数方法，通过梯度稀释和涂布平板，形成单菌落，从而实现微生物的计数。
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1mL
-4
-5
-6
-1 225mL无 无 菌生理盐水 25g/mL 样品
每管9mL无 每管 无 菌生理盐水 -4 每皿20mL 每皿 -4
0.1mL
0.1mL
0.1mL
-5
-6
-5
-6
琼脂培养基 -4
-5
-6
涂抹平板计数法
28℃培养3d 观察 ℃培养 结果
无菌室和实验室空气污染情况的检验
将牛肉膏琼脂和马铃薯蔗糖琼脂倒平板,冷却待用 每人每种一个 将牛肉膏琼脂和马铃薯蔗糖琼脂倒平板 冷却待用(每人每种一个 。 冷却待用 每人每种一个)。
二、基本原理
单个微生物细胞于适宜的条件下能在固体培养基上形成一个肉 眼可见的子细胞群体即菌落，一般来说， 眼可见的子细胞群体即菌落，一般来说，一个独立的菌落是由一个单 细胞微生物繁殖而成。该实验就是根据这一生理特性而设计的。 细胞微生物繁殖而成。该实验就是根据这一生理特性而设计的。
三、器具材料（见教材P62） 器具材料（见教材 ）
1mL
1mL
1mL
-4
Hale Waihona Puke -5-6-1 225mL无 无 菌生理盐水 25g/mL 样品
每管9mL无 每管 无 菌生理盐水 -4 每皿15mL 每皿 -4
1mL -5
1mL -6
1mL
-5
-6
琼脂培养基
-4
-5
-6
混合平板培养法
37℃培养48h观 ℃培养 观 察结果
1mL 1mL -2 -3
1mL
1mL
四、操作方法
选择适当的稀释度） 1. 样本稀释液的制备 （选择适当的稀释度） 2. 平板接种培养 酱油中细菌总数， （1）平板混合培养法（测定酱油中细菌总数，稀释度采 ）平板混合培养法（测定酱油中细菌总数 用10-1、 10-2、 10-3 ）； 葡萄、 菌数， （2）平板涂抹计数法（分离或计算葡萄、面包中霉菌数， ）平板涂抹计数法（分离或计算葡萄 面包中霉菌数 稀释度采用10 稀释度采用 -1、 10-2、 10-3）。 3. 结果计算 （1） 每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度 3 次重复的平均菌 ） 每毫升中菌落形成单位（ ） 同一稀释度
落数X稀释倍数 落数 稀释倍数 （2） 每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度 3 次重复的平均菌落 ） 每毫升中菌落形成单位（ ） 同一稀释度 数X稀释倍数 X10 稀释倍数
4. 无菌操作技术及无菌室的无菌的检测和空气中微生物 每种培养基每人一皿） 的检测 （每种培养基每人一皿）
1mL 1mL -2 -3
实验六 实验六 稀释平板计数及霉菌 稀释平板计数及霉菌、酵母菌的分离 与鉴定
一、目的要求
学习了解稀释平板计数法的作用、原理和方法，并结合测定酱 学习了解稀释平板计数法的作用、原理和方法，并结合测定酱 油中微生物总数和葡萄、面包中霉菌的分离计数 的分离计数。 油中微生物总数和葡萄、面包中霉菌的分离计数。强调微生物的无菌 操作技术及无菌室的无菌的检测方法。 操作技术及无菌室的无菌的检测方法。
无菌室内进行空气中杂菌的检验，可在使用前或使用后进行， 无菌室内进行空气中杂菌的检验，可在使用前或使用后进行，方法 取牛肉膏琼脂和马铃薯蔗糖琼脂两种培养基的斜面和平板各3个 是：取牛肉膏琼脂和马铃薯蔗糖琼脂两种培养基的斜面和平板各 个， 于无菌室使用前(或使用后 ，在无菌室内揭开皿盖放置台面上，半小 于无菌室使用前 或使用后)，在无菌室内揭开皿盖放置台面上， 或使用后 时后重新盖上，另一皿不打开作对照。两者同时放30℃下培养， 时后重新盖上，另一皿不打开作对照。两者同时放 ℃下培养，48h 后检验平皿培养基表面有无菌生长及菌落数量， 后检验平皿培养基表面有无菌生长及菌落数量，根据检验结果采取措 施。 种培养基的各12个平板分别置于被测环境的室内和室外或其它需 将2种培养基的各 个平板分别置于被测环境的室内和室外或其它需 种培养基的各 监测的的地方，打开皿盖各暴露于空气5min和10min。加皿盖，倒 监测的的地方，打开皿盖各暴露于空气 和 。加皿盖， 置于28℃ 置于 ℃、37℃培养， 细菌 ，霉菌 ℃培养， 细菌2d，霉菌3-4d，放线菌 ，放线菌5-7d，计数。观 ，计数。 察菌落形态和颜色。 察菌落形态和颜色。