5-3 慢性毒性作用及其试验方法
[医学]第六章 化学毒物的一般毒性作用-亚慢性和慢性毒性
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二、蓄积作用的研究方法
目的：通过蓄积试验求出蓄积系数K，了解化学 物蓄积毒性的强弱，并作为慢性毒性试验及其 它有关毒性试验的剂量选择提供参考。 蓄积系数法 生物半衰期法
（一）蓄积系数法
蓄积系数(accumulation coefficient)：指多次染毒使半数 动物出现某种效应的总量与一次染毒的半数效量之比值。 一般采用大鼠或小鼠，以死亡作为效应指标。 K=ED50(n)/ED50(1) 或 K=LD50(n)/LD50(1) ED50(n):以慢性方式多次接触受试物时产生预期效应的 累积剂量之和。 ED50(1):一次接触该物质产生相同效应的一次剂量。
＊1. 实验动物的选择 ＊2. 剂量设计与分组 ＊3. 染毒途径与时限 ＊4. 观察指标
五、长期毒性试验的注意事项
重视实验项目管理：选择经验丰富的专业人员对项目的设计和实施 进行管理，保证仪器设备状态良好，工作人员专业培训。
实验室环境的要求：注意动物饲养和试验环境的规范化，符合 GLP 。
蓄积系数的评价
蓄积系数（Ｋ） 蓄积作用分级
<1
高度蓄积
1-
明显蓄积
3-
中等蓄积
5-
轻度蓄积
1. 固定剂量法
方法：
（1）急性毒性实验
LD50(1)
（2）1/20-1/5LD50 每日染毒
LD50(n)
（ 50%动物死亡时累计染毒的总量）
（3）计算K值：K=LD50(n)/LD50(1)
若累计染毒量已达到5个LD50，动物仍未死亡或死 亡未达到半数，可终止实验，其Ｋ值按 ＞５作为结果。
蓄积库（depot）：化学物蓄积的组织器官部位。常见 的蓄积库包括： 血浆蛋白 脂肪组织 肝脏、肾脏 骨骼
短期、亚慢性和慢性毒性作用
试验周期在3个月以内的，在最后一 次给药后24小时和恢复期结束时各 进行一次各项指标的全面检测 试验中期检测指标
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（6）特异性指标及其他
特异性指标
能反映毒物对机体毒作用本质的特征性指 标，常与其毒作用机制有关，可作为效应 生物学标志 根据受试物毒性资料，增加一些相关检查项目
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（二）长期毒性试验的注意事项
专业化人才设计项 目实施管理 试验项目管理 保障设施仪器状态良好 专业培训的实验人员
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试验设计合理
足够高的剂量以能观察到受试物的毒性作 用，动物死亡率不能超出10% 阴性结果 严格控制技术规范
可采取多设一个剂量组的方式
成功的试验设计 明确的剂量-反应关系 理想的LOAEL NOAEL
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试验动物环境 标准化 国际化 控制检测条件 检测仪器和辅助条件 短期内准确可靠 长期稳定可比
外源化学物的一般毒性作用
subacute toxicity/repeat dose toxicity subchronic toxicity chronic toxicity 公共卫生与热带医学学院 张文娟 毒理学系 zhangwj11@
第三节
短期、亚慢性和慢性毒性作用
一 概述
研究长期重复接触化学物毒作用的必要性 长期重复接触化学物毒作用分类
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（2）实验室检测项目 血液学：RBC HGB WBC PLT
PT PTA Fbg ALP ALB
血液生化学指标：AST ALT
BUN TP GLU Crea
T-BIL T-CHO 21
（3）系统尸解和病理组织学检查 心 肝 肾 脾 肺 肾上腺 甲状腺 睾丸 卵巢 子宫 脑 前列腺
脏器相对重量（relative organ weight)
亚慢性、慢性毒性及其评价方法
功能蓄积可能是
❑ 由于贮存体内的化学物或其代谢产物的数 量极微，不能检出物质的蓄积 ❑ 或者是由于每次机体接触化学物之后所引 起的损害累积所致
蓄积作用的检测有两类方法
• 理化方法：应用化学分析或其他技术测定 化学物进入机体以后，在体内含量变化的 过程 该方法可确定化学物的半减期，故可 作为检测物质蓄积的方法
二、慢性毒性作用 （chronic toxicity)
（一）概念 慢性毒性：是指实验动物或人长期 （甚至 终生）反复接触外源化学物所产生的毒性 效应。
• 慢性毒性试验的试验期限，应依受试物的 具体要求和实验动物的物种而定 • 如用大鼠试验期限可为1年，用狗则试验期 限可1～2年 • 慢性毒性试验可终生接触受试物 • 如果慢性毒性试验与致癌试验结合进行， 则实验动物染毒时间最好接近或等于动物 的预期寿命
• 蓄积系数法由于分次染毒的设计不同， 分 为： 1. 固定剂量法： ➢ 先测出1次染毒的LD 50（1），然后每天 给予 1/10(1/20) LD 50 直到半数动物死亡为 止， 此时总剂量即为 LD 50（n）
2. 剂量递增法： ➢ 实验开始时 ， 按 0.1 LD 50 × 4 天 ， 0.15LD 50 × 4天，0.22LD 50 × 4天， 0.34LD 50 × 4天，依次类推，最长28天， 试验期间，当化学物引起动物累计死亡一 半时间即可终止，计算K值
3、剂量选择与分组
亚慢性试验的上限剂量，需控制在实 验动物接触受试化合物的整个过程中，不发 生死亡或仅有个别动物死亡，但有明显的中 毒效应，或靶器官出现典型的损伤。此剂量 的确定可参考两个数值，一是以急性毒性的 阈剂量为亚慢性试验的最高剂量；一是以此 化合物LD 50 的 1/20－1/5为最高剂量。
第15章长期毒性作用及其试验方法课件
七、观察及测定指标
药物的长期毒性试验基本上可通过对实验动物的体 格检查，日常观察，食耗及饮水量，体重和器官重 量，血液学指标，心电图描记，尿液分析，临床生 化检验及病理组织学研究加以确认。
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基本概念和目的
长期毒性试验与急性毒性试验的根本差异：
1. 给药的期限不同。
急性毒性试验为一次性给药或 24 小时内多 次给药；
长期毒性试验为连续多日接触一定剂量给药， 给药期限为临床用药的 3-4 倍时间。 对长期毒性试验各国之间无统一的时间规定。
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基本概念和目的
2
4
12 70
注：有些资料记载的动物体型系数（R）为此表中R 值的1000 倍，如小鼠R 为59，大鼠R 为 90，这不影响药物剂量的折算。
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对于标准体重的动物：
每只用量（mg/只）DB＝ DA· KB KA
千克体重剂量（mg/kg）dB＝ dB· KB KA
KA，KB，RA，RB 值由上表查找。
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试验设计原则及方法
五、限度试验
经济合作与开发组织（OECD）提出如果一种 化合物以1000mg/kg的剂量，按规定期限连续 给药，不产生任何可观察到的毒性反应，而且根 据结构相关药物的已有资料，估计不会产生毒性 的话，就不需要再用三个剂量来进行试验，除非 预期临床需要更高的剂量。
剂量水平选择的方法
➢（1）半数致死量（LD50）法 ➢（2）短期蓄积试验过渡法 ➢（3）药代动力学（MBS）法 ➢（4）最大耐受量法（MTD法） ➢（5）临床拟用剂量法（ACD法） ➢（6）等效剂量法
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长期毒性作用及其试验方法
狗的起始月龄为 6 月龄，一般不超过 12 月 龄； 如选用杂种狗，起始年龄可稍大些，但也不能超 过 5 年。
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二、实验动物
2. 起始月(周)龄
起始体重应在体重均值± 20% 的范围内。
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蓄积作用的表现形式
作用量积蓄 功能性蓄积
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长期毒性试验与急性毒性试验 的根本差别
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给药的期限不同
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给药的剂量范围不同
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观察的毒效应不同
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二、目的与意义
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长期毒性试验的目的
1 预测受试物可能引起的临床不良反应
2 判断受试物反复给药的毒性靶器官或组织
3 推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围
4 提示临床试验中需重点监测的指标
5 为临床试验中的解毒或解救措施提供参考
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长期毒性试验的意义
了解实验动物能耐受的最大剂量，找出完 全无毒的安全界量，这个界量是判断一个待选 新药是否有进一步开发研究的价值以及能否过 渡到临床试用的重要依据，同时，也可为其它 毒性实验和临床初始剂量的选择提供依据。因 此长期毒性试验是临床前安全性评价的主要内 容，它与急性毒性试验、生殖毒性以及致癌性 等毒理学研究有着密切的联系，是新药报批临 床时重点审评项目之一，是药物从药学研究进 入临床试验的重要环节。
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二、实验动物
1.种类及品系
☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物, 一 种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类， 首选狗。
兽药慢性毒性和致癌试验指导原则
兽药慢性毒性和致癌试验指导原则一、概述（一）定义与目的慢性毒性和致癌试验是预测药物在临床应用中诱发癌症危险性的评价方法。
在动物的大部分生命期间，经过反复给予受试药物后观察其呈现的慢性毒性作用及其剂量－反应关系，尤其是进行性和不可逆毒性作用及肿瘤疾患。
确定受试药物的无作用剂量(NOEL)，作为最终评定受试药物能否应用于动物尤其是食品动物的依据。
为了确保慢性毒性和致癌试验结果的真实性、可靠性和可追溯性，根据新兽药研究的规律，结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。
（二）适用范围本指导原则适用于评价兽用化学药品、中兽药、消毒剂及饲料药物添加剂对动物的慢性毒性和/或致癌性的测定。
长期毒性试验发现有可疑肿瘤发生，某些器官组织细胞异常、药物结果与已知致癌物有关或代谢物与已知致癌物有关、作用机制为细胞毒类等情况下，要求进行致癌试验。
二、试验设计（一）材料与方法1.实验动物（1）实验动物种类选择一般要求选用两个种属的实验动物，即啮齿类和非啮齿类，目前已掌握大白鼠和小白鼠各品系的特点及诱发肿瘤的敏感性，故可优先将其用于慢性毒性和致癌试验。
对活性不明的受试药物，则应选用两种性别的啮齿类和非啮齿类动物。
（2）动物的起始周龄和体重慢性毒性试验期长，故一般用刚断乳的大鼠或小鼠。
大鼠50～70g（出生3～4周），小鼠10～15g（出生3周）。
动物个体体重的变动范围不超出各性别平均体重的20%。
（3）动物的性别和数量每个剂量组的动物数应满足试验结束时进行统计学处理的要求，如大鼠40～60只（小鼠数应据此适当增加），一般雌雄各半，雌鼠应为非经产鼠、非孕鼠。
如果将慢性毒性试验与致癌试验结合进行，每组雌雄动物数均应在50只以上。
如计划在试验过程中定期剖杀动物，则动物数应相应增加。
（4）肿瘤自发率实验动物的自然肿瘤发生率原则是控制到越低越好，但试验结果评价时主要是以在相同条件下观察对照组与各剂量组的肿瘤发生率及其剂量-反应关系作为判定依据。
毒理学
2-1_毒物毒性和毒作用1.某先天缺乏NADH-高铁血红蛋白还原酶的患者，当一次接触大量苯胺后发生高铁血红蛋白血症，这种毒性作用应为：A、速发作用B、局部作用C、过敏性反应D、高敏感性E、特异体质反应2.机体接触有机磷农药后，血液中胆碱酯酶活性降低，致使神经递质乙酰胆碱不能及时水解，引起瞳孔缩小、肌肉颤动、大汗、肺水肿、肢体麻痹等中毒表现。
这种毒性作用属于：A. 速发作用B. 局部作用C. 全身作用D. 高敏感性E. 过敏性反应3.以三邻甲苯磷酸酯TOCP为代表的某些有机磷农药在急性中毒恢复后8-14 d又出现肢体麻痹、共济失调等临床表现相当严重的中毒性神经病，以下哪种概括更为合适：A、局部作用B、不可逆作用C、过敏性反应D、迟发作用E、特异体质反应4.以下哪一种不是化学毒物出现选择毒性的原因：A.物种和细胞学差异B.不同生物或组织器官对化学毒物生物转化过程的差异C.生物所接触的毒物剂量的差异D.不同组织器官对化学毒物亲和力的差异E.不同组织器官对化学毒物所致损害的修复能力的差异5.如检测人体的某些生物材料如血液、尿液、头发中的铅、汞、镉等重金属含量可以准确判断其机体暴露水平，这些生物学标志称为A 、接触性生物学标志物B、效应性生物学标志物C、易感性生物学标志物D、一般性生物学标志物E、特殊性生物学标志物2-3_安全限值MRL为：B安全范围为：FADI为：A暴露范围为：E参考剂量为：D实际安全剂量为：CA、人类每日摄入某物质至终生，而不产生可检测到对健康产生危害的量。
B、允许在食物表面或内部残留药物或化学物质的最高含量或浓度。
C、食品中化学物质的日平均接触量的估计值。
D、用于（非？）致癌物质危险度评价的指标。
E、衡量人群“暴露量”估计值与动物实验中获得的NOAEL差异大小的指标。
F、是人群“暴露量”估计值与安全限值差异大小的指标。
下列哪一项效应属于量效应：AA.尿中δ-ALA的含量B. 中度铅中毒C. 动物死亡D. 持续性肌肉松弛E. 正常细胞发生恶变随着科学技术手段的更新，下列表示毒性的指标也会更新，除（D ）外。
食品毒理学评价与食品安全性
食品毒理学评价与食品安全性马立田胡军刘宏霞北京中大华远认证中心100833摘要:本文从食品毒理学的角度对食品安全性进行了论述,探讨了食品安全性评价与ADI、LD50等指标之间的关系，为正确认识和使用食品添加剂及新资源食品的开发提供了理论基础。
关键词：食品毒理学、ADI、LD50、最大使用量前言应用食品毒理学的方法对食品进行安全性评价, 为我们正确认识和安全使用食品添加剂(包括营养强化剂)、开发食品新资源和新资源食品及保健食品的开发提供了可靠的技术保证，为我们正确评价和控制食品容器和包装材料、辐照食品、食品及食品工具与设备用洗涤消毒剂、农药残留及兽药残留的安全性提供了可靠的操作方法。
一．食品毒理学基本概念1.食品毒理学（food toxicology）：应用毒理学方法研究食品中外源化学物的性质，来源与形成，它们的不良作用与可能的有益作用及其机制，并确定这些物质的安全限量和评定食品的安全性的科学。
食品毒理学的作用就是从毒理学的角度，研究食品中可能含有的外源化学物质对食用者的毒作用机理，检验和评价食品（包括食品添加剂）的安全性或安全范围，从而达到确保人类的健康目的。
2.毒物：在一定条件下，较小剂量就能够对生物体产生损害作用或使生物体出现异常反应的外源化学物称为毒物。
食物中的毒物来源有：天然的或食品变质后产生的毒素等、环境污染物、农兽药残留、生物毒素、以及食品接触所造成的污染。
3.外源化学物（xenobiotics）：是存在于外界环境中，而能被机体接触并进入体内的化学物；它不是人体的组成成分，也不是人体所需的营养物质。
近来，确切的概念应称为“外来生物活性物质”。
4. 毒性：是指外源化学物与机体接触或进入体内的易感部位后，能引起损害作用的相对能力，或简称为损伤生物体的能力。
也可简述为外源化学物在一定条件下损伤生物体的能力。
食品中的外源化学物也可能在一定条件下呈有益作用或不良作用。
毒理学的一个基本原则和首要目的就是要对毒性进行定量。
食品毒理学作业
食品毒理学作业题第七章特殊毒性作用及其试验与评价方法1、急性毒性实验的概念和目的2、Ames 实验的原理3、改良Karber法的要求4、蓄积性毒性试验的概念及目的5、亚慢性毒性试验的概念和目的6、生殖毒性和发育毒性的概念，评价的试验方法、指标答：①生殖毒性的概念：外来化合物对生殖过程的损害作用，主要包括对生殖细胞的发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳作用的损害作用。
发育毒性的概念：外来化合物对发育过程中的损害作用，主要包括对胚胎的发育、胎仔发育及出生幼仔发育的损害作用。
②生殖毒性作用的评定主要通过生殖毒性试验进行，也称繁殖试验，主要有三代两窝试验法、两代一窝、一代一窝生殖试验法。
可观察的指标有受孕率、正常分娩率、幼仔出生存活率、幼仔哺乳存活率。
③发育毒性的评定主要是评价受试物的致畸作用，对胎鼠进行体表检查、内脏检查、骨骼检查、生理功能异常的观察。
可观察的指标有活产幼仔平均畸形出现数、畸胎出现率、母体畸胎出现率。
7、微核是什么？其来源于何？细胞质中发现微核说明了什么？答：微核在细胞的有丝分裂后期染色体有规律的进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体无着丝片断或环。
它在末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的细胞质中形成，由于比核小得多故称微核。
微核来源于染色体，在细胞质中发现微核说明染色体发生了变化，发生断裂，受试物对染色体产生了损伤。
第十章食品中有毒有害物质限量标准的制定及风险评估与管理1、安全限量标准制定的意义答：保证食品的食用安全性；国家食品安全质量监督管理的依据；食品安全生产的基础；食品贸易的基本条件。
2、限量标准制定中应综合考虑的因素有哪些？答：在制定限定标准时，应综合考虑各种化学物的来源，毒性大小、毒性特点、实际摄入情况以及社会经济发展情况，权衡该物质可能对人体造成的危害以及可能产生的有益作用，将标准从严制定或者放宽。
考虑因素如下：（一）在体内有蓄积性，不宜排泄或解毒者从严（二）可能产生三致作用的从严（三）接触频度高，长期大量食用者从严（四）供应幼儿、病人食用者从严（五）化学性质稳定，在加工或者烹调过程中不宜破坏者从严（六）与其他化学成分产生协同毒性作用者从严总之，制定的限量标准带有一定的相对性，随着科技进步和社会的发展，限量标准应该适时修订。
6 第6章 一般毒性作用及其试验与评价方法
粘膜
其它
结膜或口腔中分泌物增多，充血、苍白、黄疸
直肠或脚爪部皮肤温度降低或升高；姿势异常，消瘦等
5、LD50的计算方法：
（1）改进寇氏法 P127
• 改进寇氏法：计算简便，结果可靠。
• 试验设计要求：组内动物数相等、组间剂量等比例 设计、死亡率正态分布、最低剂量组死亡率 <20% ， 最大剂量组死亡率>80% • 计算公式：logLD50=Xκ- i(Σp - 0.5)
‘一次接触’
(P122)
经口接触和各种方式的注射接触，“一次接触”，是指 在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内；
而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次接触”是指在一
个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程; 此外，当化学物毒性较低时，需要给予动物较大剂量时， 可在 24 小时内分多次给予，这时的急性接触即为“多 次”。
第一节
急性毒性作用及其评价
一、基本概念。（P122）
急性毒性（acute toxicity）是指机体(人或实验 动物)一次接触(或24小时内多次接触)受试物后， 在短期内所产生的效应及反应，包括一般行为、 外观改变及形态改变，甚至死亡效应。 观察时间：一般为7天，也可连续观察14～28天。
4日接触总剂量 （LD50）
累积接触总剂 量（LD50）
0.40
1.00
1.90
3.26
5.26
8.26
12.74
蓄积毒性试验的目的：
• 求出外源化学物的蓄积系数，了解蓄积毒性大小
• 为慢性毒性试验和其它有关毒性试验的剂量选择提 供参考依据 • 为制定有毒物质在食品中的卫生限量标准时，为安 全系数的选择提供参考 • 确定该受试物可否用于食品供人类长期食用
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第三节慢性毒性作用及其试验方法
一、概念和试验目的
(一) 慢性毒性概念
慢性毒性是指以低剂量外来化合物长期给予实验动物接触，观察其对实验动物所产生的毒性效应。
(二) 试验目的
慢性毒性试验是确定外来化合物的毒性下限，即长期接触该化合物可以引起机体危害的阈剂量和无作用剂量。
为进行该化合物的危险性评价与制定人接触该化合物的安全限量标准提供毒理学依据，如最高容许浓度和每日容许摄入量等。
二、慢性毒性试验设计
（一）慢性毒性试验期限
一般认为工业毒理学慢性试验动物染毒6个月或更长时间；而环境毒理学与食品毒理学则要求实验动物染毒1年以上或2年。
也有学者主张动物终生接触外来化合物才能全面反映外来化合物的慢性毒性效应，以及求出阈剂量或无作用剂量。
但是，也有学者认为大鼠为进行慢性毒性试验动物，接触受试化合物1年以上不一定必要。
多次经验证明延长接触1年以上，大鼠也不再出现新的毒性效应(致癌试验除外)。
例如有报道在122种化合物中，大鼠连续接触3个月之后才出现毒性效应的只有3种(占2.46%)，其它化合物均在3个月内已出现毒性效应。
因此认为以大鼠为试验对象时连续接触外来化合物90天，即可确定受试化合物的长期无作用水平。
但是，这种观点还存有争论。
因此在食品及环境毒理学中进行慢性毒性试验，接触外来化合物的时间仍以2年为好。
（二）实验动物与饲养环境
1、实验动物
慢性毒性试验选择实验动物的条件与亚慢性毒性试验相同。
但实验动物最好为纯系甚至同窝动物均匀分布于各剂量组。
实验动物年龄应较小，大鼠和小鼠应为初断奶者，即小鼠出生后3周，体重
10~12g；大鼠出生后3~4周，体重50~70g。
性别要雌雄各半。
2、动物饲养环境
慢性毒性试验实验动物的饲养条件和饲养环境与亚慢性毒性试验相同。
（三）接触途径
慢性毒性试验多为经口与经呼吸道接触。
经呼吸道接触，每日接触时间，依试验要求而定。
工业毒物的试验通常每日吸入4～6小时。
环境污染物一般要求每日吸入8小时或更长。
（四）剂量的选择与分组
为制定外来化合物卫生标准而进行慢性毒性试验时，一般设3个染毒剂量组和1个对照组，必要时另设一个溶剂对照组，即无作用剂量组、阈剂量组、发生比较轻微毒性效应的剂量组(此为最高剂量组)。
以求出明确的剂量－反应关系。
染毒组剂量的选择可参考三组数据。
一是以亚慢性阈剂量为出发点，即以亚慢性阈剂量或其1/5 ~1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的
1/50~1/10为慢性毒性试验的预计阈剂量组，并以其1/100为预计的慢性无作用剂量组；一是以急性毒性的LD50剂量为出发点，即以LD50的1/10剂量为慢性试验的最高剂量。
以LD50的1/100为预计慢性阈剂量，以LD50 的1/1000为预计的无作用剂量组。
各染毒剂量组之间的剂量间距应当大些，有利于求出剂量-反应关系，也有助于排除实验动物个体敏感性差异。
组间剂量差一般以5~10倍为宜，最低不小于两倍。
（五）观察指标
观察指标的选择，应以亚慢性毒性试验的观察指标为基础。
其中包括体重、食物摄取、临床症状、行为、血象和血液化学、尿的性状及生化成分以及重点观察在亚慢性毒性试验中已经显现的阳性指标。
一些观察指标变化甚微，为此应注意三点：一是试验前应对一些预计观察指标，尤其是血、尿常规及重点测定的生化指标进行正常值测定，废弃个体差异过大的动物；二是在接触外来化合物期间进行动态观察的各项指标，应与对照组同步测定；三是各化验测定方法应精确、可靠、且进行质量控制。
应重视病理组织学的检查。
凡试验期间死亡的动物，都应做病理组织学检查。