慢性亚慢性毒性试验
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短期、亚慢性和慢性毒性作用
试验周期在3个月以内的，在最后一 次给药后24小时和恢复期结束时各 进行一次各项指标的全面检测 试验中期检测指标
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（6）特异性指标及其他
特异性指标
能反映毒物对机体毒作用本质的特征性指 标，常与其毒作用机制有关，可作为效应 生物学标志 根据受试物毒性资料，增加一些相关检查项目
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（二）长期毒性试验的注意事项
专业化人才设计项 目实施管理 试验项目管理 保障设施仪器状态良好 专业培训的实验人员
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试验设计合理
足够高的剂量以能观察到受试物的毒性作 用，动物死亡率不能超出10% 阴性结果 严格控制技术规范
可采取多设一个剂量组的方式
成功的试验设计 明确的剂量-反应关系 理想的LOAEL NOAEL
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试验动物环境 标准化 国际化 控制检测条件 检测仪器和辅助条件 短期内准确可靠 长期稳定可比
外源化学物的一般毒性作用
subacute toxicity/repeat dose toxicity subchronic toxicity chronic toxicity 公共卫生与热带医学学院 张文娟 毒理学系 zhangwj11@
第三节
短期、亚慢性和慢性毒性作用
一 概述
研究长期重复接触化学物毒作用的必要性 长期重复接触化学物毒作用分类
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（2）实验室检测项目 血液学：RBC HGB WBC PLT
PT PTA Fbg ALP ALB
血液生化学指标：AST ALT
BUN TP GLU Crea
T-BIL T-CHO 21
（3）系统尸解和病理组织学检查 心 肝 肾 脾 肺 肾上腺 甲状腺 睾丸 卵巢 子宫 脑 前列腺
脏器相对重量（relative organ weight)
亚慢性、慢性毒性及其评价方法
功能蓄积可能是
❑ 由于贮存体内的化学物或其代谢产物的数 量极微，不能检出物质的蓄积 ❑ 或者是由于每次机体接触化学物之后所引 起的损害累积所致
蓄积作用的检测有两类方法
• 理化方法：应用化学分析或其他技术测定 化学物进入机体以后，在体内含量变化的 过程 该方法可确定化学物的半减期，故可 作为检测物质蓄积的方法
二、慢性毒性作用 （chronic toxicity)
（一）概念 慢性毒性：是指实验动物或人长期 （甚至 终生）反复接触外源化学物所产生的毒性 效应。
• 慢性毒性试验的试验期限，应依受试物的 具体要求和实验动物的物种而定 • 如用大鼠试验期限可为1年，用狗则试验期 限可1～2年 • 慢性毒性试验可终生接触受试物 • 如果慢性毒性试验与致癌试验结合进行， 则实验动物染毒时间最好接近或等于动物 的预期寿命
• 蓄积系数法由于分次染毒的设计不同， 分 为： 1. 固定剂量法： ➢ 先测出1次染毒的LD 50（1），然后每天 给予 1/10(1/20) LD 50 直到半数动物死亡为 止， 此时总剂量即为 LD 50（n）
2. 剂量递增法： ➢ 实验开始时 ， 按 0.1 LD 50 × 4 天 ， 0.15LD 50 × 4天，0.22LD 50 × 4天， 0.34LD 50 × 4天，依次类推，最长28天， 试验期间，当化学物引起动物累计死亡一 半时间即可终止，计算K值
3、剂量选择与分组
亚慢性试验的上限剂量，需控制在实 验动物接触受试化合物的整个过程中，不发 生死亡或仅有个别动物死亡，但有明显的中 毒效应，或靶器官出现典型的损伤。此剂量 的确定可参考两个数值，一是以急性毒性的 阈剂量为亚慢性试验的最高剂量；一是以此 化合物LD 50 的 1/20－1/5为最高剂量。
亚慢性毒性试验解析
毒理学作业农药2,4-滴钠盐原药为白色粉末，水溶性，表1是其对SD大鼠的急性经口试验结果，请根据表中结果，给出该农药的90天亚慢性试验的试验方案，以及如何对保证实验质量予以控制。
表1 2，4-滴钠盐原药对SD大鼠急性毒性实验结果剂量设置高剂量为25%LD50，中剂量为12.5%, 低剂量为6.3%。
雌性LD50为584mg/kg，高剂量为146mg/kg,中剂量为73mg/kg,低剂量为37mg/kg；雄性为501mg/kg，高剂量为125mg/kg，63mg/kg,低剂量为31mg/kg。
根据GB15670《农药登记毒理学实验方法》的农药急性毒性分级标准，2，4-滴钠盐原药的LD50>500mg/kg，属于低度农药。
因此试验时选择SD大鼠的LD50为584mg/kg。
农药2,4-滴钠盐原药SD大鼠亚慢性毒性试验目的;研究喂饲农药2,4-滴钠盐原药对大鼠的亚慢性毒性。
方法：取初断乳 SD大鼠80只，雌雄各半按照体重随机分为4组。
将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别拌入饲料内经口喂饲染毒90d。
观察：大鼠外观体征、体质量、进食情况等。
在实验中期和末期采血检测检测血液学。
试验末期检测血生化指标以及尿常规检查。
实验结束时处死实验动物，计算脏器指数，并对主要脏器进行病理组织学观察。
1 材料和方法1.1 受试物农药2,4-滴钠盐原药，白色粉末，水溶性，由某地某农药公司提供。
SPF级初断乳大鼠80只，雌雄各半，体质量50~100 g，由XXX实验动物研究所繁育场提供，动物合格证号为医动字第XX-XXXX号。
1.2 饲养与管理SPF 环境条件下，同组同性别两只一笼喂养，自由进食和饮水。
环境温度 21～25℃，相对湿度 40%～60%。
严格控制昼夜交替。
1.3实验方法试验前将雌、雄大鼠各半按体重随机分为3个剂量组和1个对照组，每组20只，将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别均匀混入饲料中制成颗粒饲料辐照灭菌后分别供高、中、低剂量组动物食用，连续每日一次喂养90d；对照组给予不加受试物的正常饲料。
短期、亚慢性、慢性毒性评价
接触天数
1～4 5～8 … 25～28
每天接触剂量LD50 0.1 4天接触剂量LD50 0.4 累计接触剂量LD50 0.4
0.15 … 1.12
0.6 … 4.48
1
… 12.74
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③剂量固定的20天蓄积法
通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分成五组，包
括阴性对照组和1/20LD50，1/10LD50，1/5LD50，1/2LD50四 个剂量组，每组动物数10只。每日染毒一次，连续染毒20 天。观察每组雌雄合计动物数。
6
7
2.物质蓄积(material accumulation): 机体多次地接触 化学毒物一定时间之后，用化学分析方法能够测出 机体内存在该物质或其代谢产物时，称为物质蓄积。
3.功能蓄积(functional accumulatio): 机体多次地接触 化学毒物一定时间之后，虽不能测出该物质或其代 谢产物，但机体有慢性中毒的症状出现，这种情况 称为功能蓄积。
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forward
毒效应谱
对外源化学物的负荷增加
意义不明的生理和生化改变
亚临床改变
临床中毒
死亡
损害效应
Hale Waihona Puke 癌 致突变 致畸fallback
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(三)亚慢性毒性试验方法要点
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1. 实验动物选择： ①物种和品系: 啮齿类 大鼠、小鼠、家兔 两个动物种属 非啮齿类 犬、猴子
评价：均无死亡
蓄积性不明显
仅1/2LD50有死亡 仅1/20LD50无死亡 均有死亡，且有剂量反应关系
弱蓄积性 中度蓄积 强蓄积
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亚慢性和慢性毒性作用
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一、亚慢性毒作用
6 第6章 一般毒性作用及其试验与评价方法
2、剂量设计与分组
• 根据受试物或其近似物的物理、化学性质选择与本实 验相同动物物种或品系，相同染毒途径的LD50值作为 参考值，选择剂量系列。 • 一般分四组：高中低三个剂量组及一个阴性对照组
3、确定实验动物染毒方法： 灌胃
4、观察周期及观察内容
观察周期：一般为14天或24h，但计算出LD50时应注明
• 品种、品系的选择 • 健康状况：健康成年动物
小鼠、大鼠测半数致死量，狗观察毒性反应。
• 年龄：大鼠180-240g，小鼠18-25g（35-50日 龄），家兔2-2.5kg，豚鼠200-250g，狗10-15kg。 • 性别：雌、雄各半，雌性实验动物要求是未 经交配和受孕的。 • 各剂量组动物数： 小动物数量为每组 10 只，大动物也应每组 6 只。
‘一次接触’
(P122)
经口接触和各种方式的注射接触，“一次接触”，是指 在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内；
而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次接触”是指在一
个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程; 此外，当化学物毒性较低时，需要给予动物较大剂量时， 可在 24 小时内分多次给予，这时的急性接触即为“多 次”。
免费茶水的重金属严重超标
一份外国学者的研究指出， 中国13个品牌的香烟重金属含量超标
第二节 蓄积毒性
一、基本概念 P138
当化学毒物连续、反复进入机体，而且进 入的速度（或总量）超过代谢转化与排出的速度 （或总量）时，物质就有可能在体内逐渐增加并 贮留的现象--蓄积作用（accumulation） 化学毒物容易蓄积的组织和器官——贮存库
急 以性 死毒 亡性 为的 终上 点限 参 数 急 非性 毒 作致 性 用死 的 为性 下 终急 限 点性 毒参 性数 ，
毒理学 长期毒性试验
蓄积毒性作用
药物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物
反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度
(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学
毒物的蓄积作用 (accumulation) 。
三、长期毒性试验与急性毒性试验的根本差异
1.给药的期限不同
急性毒性试验为一次性给药或 24h 内多次给药。
长期毒性试验为连续多日接触一定剂量给药，给药期限可以从数天至终生甚至数代，一
般为临床用药的 3-4 倍。
表 3-1 常用实验动物的平均寿命及长期毒性试验给药期限
试验动物 平均寿命（年） 亚慢性试验给药期限（月） 慢性试验给药期限（月）
使用本方法时要注意染毒期间定期(每 4 天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒 物的染毒绝对量。 3.剂量固定的 20 天蓄积法：
通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为 5 个组，包括阴性对照组和 1/20 LD50、 l/10 LD50、1/5 LD50 和 1/2 LD50 四个剂量组，每组动物数 10 只，雌雄各半。每日染毒一次， 连续染毒 20 天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。
①供试药物在体内的生物蓄积作用：测定有关的蓄积参数，有助于了解药物的蓄积性。 对于高蓄积性药物应适当减少剂量； ②供试药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被供 试药物本身所诱导或抑制。例如，某些药物如果抑制与其本身代谢或解毒有关的酶，则 该药物的给药剂量应酌情减少。 ③供试物在消化道中的稳定性，与胃肠道内容物有亲和性的药物，应酌情增加剂量。
功，是其它实验动物不可替代的。
急性毒性、蓄积毒性、亚慢性毒性、亚急性毒性、慢性毒性资料区分
实验动物和靶动物区别(写资料的时候首先弄清楚用的是什么动物，写 的动物错了，意义就变了) •实验动物：实验动物是人工饲养，对其携带的微生物实行控制，遗传 背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定及其科 学实验的动物。例如，兽药用的多的大鼠、小鼠、兔子、狗、猴或小 型猪等，人药较多的猩猩、猕猴、狒狒等非人灵长类动物。 •试验动物：做试验动物。(搞不清楚了写试验动物) •靶动物：通俗的说就是治疗的目标动物。
5
易混知识
毒性概念区分 蓄积性毒性(资料不要求，但注意区分)
蓄积性毒性：当化学毒物反复多次(未有时间要求)给动物(实验或靶动物)染毒，化学 毒物进入机体的速度（或总量）超过代谢转化和排泄的速度（或总量）时，化学毒物或 其代谢物在机体内逐渐增加并贮留的现象为化学毒物的蓄积作用。 蓄积作用是发生亚慢性、慢性毒作用的物质基础。 试验目的：求出外源化学毒物的蓄积系数K，了解蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试 验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。 评价方式： 1.蓄积系数法（accumulation coefficient）以蓄积系数K为指标，一般认为K值越小，蓄 积毒性越大(参考《蓄积系数分级标准》表) 2.生物半减期法（biological half-life, t1/2）,根据得到的蓄积极限值可以推断产生中毒的 大概时间。
3
易混知识
兽药易混知识点 2.毒性概念区分 (临床资料22号-26号)
毒性：指外源化学物质在一定剂量、一定接触时间和一定接触方式下，对 动物机体产生的总体毒效应的能力，又称作一般毒性作用。 毒性分类 1.一般毒性根据外源化学物质剂量大小和时间长短分为：急性毒性、蓄积 毒性、亚慢性毒性、亚急性毒性、慢性毒性等。 442公告中中兽药要求的23号资料要求长期毒性试验（化药为亚慢性毒 性），长期毒性即包括：亚慢性毒性和慢性毒性试验！ 2.相对特殊毒性根据观察目标不同可分为：遗传毒性、生殖发育毒性、致 癌性、免疫毒性、神经毒性和神经行为毒性等。
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易混知识
毒性概念区分 蓄积性毒性(资料不要求，但注意区分)
蓄积性毒性：当化学毒物反复多次(未有时间要求)给动物(实验或靶动物)染毒，化学 毒物进入机体的速度（或总量）超过代谢转化和排泄的速度（或总量）时，化学毒物或 其代谢物在机体内逐渐增加并贮留的现象为化学毒物的蓄积作用。 蓄积作用是发生亚慢性、慢性毒作用的物质基础。 试验目的：求出外源化学毒物的蓄积系数K，了解蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试 验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。 评价方式： 1.蓄积系数法（accumulation coefficient）以蓄积系数K为指标，一般认为K值越小，蓄 积毒性越大(参考《蓄积系数分级标准》表) 2.生物半减期法（biological half-life, t1/2）,根据得到的蓄积极限值可以推断产生中毒的 大概时间。
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易混知识
兽药易混知识点 2.毒性概念区分 (临床资料22号-26号)
毒性：指外源化学物质在一定剂量、一定接触时间和一定接触方式下，对 动物机体产生的总体毒效应的能力，又称作一般毒性作用。 毒性分类 1.一般毒性根据外源化学物质剂量大小和时间长短分为：急性毒性、蓄积 毒性、亚慢性毒性、亚急性毒性、慢性毒性等。 442公告中中兽药要求的23号资料要求长期毒性试验（化药为亚慢性毒 性），长期毒性即包括：亚慢性毒性和慢性毒性试验！ 2.相对特殊毒性根据观察目标不同可分为：遗传毒性、生殖发育毒性、致 癌性、免疫毒性、神经毒性和神经行为毒性等。
毒性试验
遗传毒性研究在药物研发中处于比较的重要位置，尤其是在药物筛选阶段，在很大程度上遗传毒性试验结果将影响到药物开发的进程。
一般而言，根据其检测的遗传学终点可分为4种类型：检测基因突变；检测染色体畸变；检测染色体组畸变；检测DNA原始损伤。
长期毒性试验
长期细胞毒性试验一般是在急性毒性试验结果的基础上，观察评价动物反复给予受试物后，机体产生毒性反应的特征及其毒性损害的严重程度，以及主要毒性靶器官及其损害的可逆性。
急性毒性试验
急性毒性试验是指在24小时内动物接受药物1-2次（间歇时间为6-8小时），观察给药后动物7-14天内所产生的急性中毒反应。
急性毒性试验可确定被研究药物的毒性程度，即剂量和不良反应之间的关系，亦可以比较被研究对象与其他已知急性毒性物的相对毒性程度，通过对不同给药途径出现毒性作用的比较研究， 就可以确定药物不同接触途径的相对危害。
受试物长期毒性试验的目的是提供受试物的无毒性反应剂量和临床主要检测指标，为制定人用安全剂量提供参考资料。
因此长期毒性试验的设计 最好能包括神经病理学、生理学、生物化学及相关的形态学指标的监测，还应注意受试物再组织中可能的蓄积，以及通过其他机制产生的延缓毒性作用等。
北校区北门2205师母,13515209736
致畸敏感期毒性试验大鼠致畸敏感期毒性试验：按受试品剂量分组，对雌性大鼠受孕后的第6-15天连续给药。观察受试品对胎仔外观、体重、身长、尾长、内脏和骨骼等的影响，并与生理盐水对照组比较。
围产期毒性试验大鼠围产期毒性试验：按受试品剂量分组皮下注射给药，给药时间为孕鼠妊娠15天开始至分娩后28天，观察受试品大、中、小三个剂量组，对大鼠胚胎后期生长发育、母鼠分娩、以及新生F1代大鼠的生理发育指标、神经反射发育指标和生殖功能，并与生理盐水对照组比较。
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• 至少设三个染毒剂量组 • 一个对照组
.
观察指标
.
实验检查Biblioteka 一般性 指标实验室 检查
组织病 理学检
查
外观体征和行为活动、粪便性状、食量 及体重变化等，往往是敏感的综合毒效 应指标。
体内生化转化和排泄的重要器官肝和胃 的功能是检查重点，血液是另一个重要 的靶器官。
可以发现受试物毒作用的靶器官，判断 损害的性质和程度，推测可能的毒作用 机制。
慢性亚慢性毒性实验
实验目的
剂量-反应(效应)关系，确定NOAEL和LOAEL 毒作用特点和毒作用靶器官 慢性毒性作用的可逆性
无相关毒性资料时，进行危险性评价
.
实验准备
实验动 物的选
择
染毒 方式
剂量选 择和分
组
• 两种实验动物，啮齿类和非啮齿类 • 两种性别，每组雌雄各半 • 选择离乳不久的动物
• 经口染毒：灌胃法，喂饲法，胶囊法 • 经皮肤接触 • 经呼吸道
.
谢谢
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观察指标
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实验检查Biblioteka 一般性 指标实验室 检查
组织病 理学检
查
外观体征和行为活动、粪便性状、食量 及体重变化等，往往是敏感的综合毒效 应指标。
体内生化转化和排泄的重要器官肝和胃 的功能是检查重点，血液是另一个重要 的靶器官。
可以发现受试物毒作用的靶器官，判断 损害的性质和程度，推测可能的毒作用 机制。
慢性亚慢性毒性实验
实验目的
剂量-反应(效应)关系，确定NOAEL和LOAEL 毒作用特点和毒作用靶器官 慢性毒性作用的可逆性
无相关毒性资料时，进行危险性评价
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实验准备
实验动 物的选
择
染毒 方式
剂量选 择和分
组
• 两种实验动物，啮齿类和非啮齿类 • 两种性别，每组雌雄各半 • 选择离乳不久的动物
• 经口染毒：灌胃法，喂饲法，胶囊法 • 经皮肤接触 • 经呼吸道
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谢谢
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