亚慢性、慢性毒性及其评价方法

功能蓄积可能是
❑ 由于贮存体内的化学物或其代谢产物的数 量极微，不能检出物质的蓄积 ❑ 或者是由于每次机体接触化学物之后所引 起的损害累积所致
蓄积作用的检测有两类方法
• 理化方法：应用化学分析或其他技术测定 化学物进入机体以后，在体内含量变化的 过程 该方法可确定化学物的半减期，故可 作为检测物质蓄积的方法
二、慢性毒性作用 （chronic toxicity)
（一）概念 慢性毒性：是指实验动物或人长期 （甚至 终生）反复接触外源化学物所产生的毒性 效应。
• 慢性毒性试验的试验期限，应依受试物的 具体要求和实验动物的物种而定 • 如用大鼠试验期限可为1年，用狗则试验期 限可1～2年 • 慢性毒性试验可终生接触受试物 • 如果慢性毒性试验与致癌试验结合进行， 则实验动物染毒时间最好接近或等于动物 的预期寿命
• 蓄积系数法由于分次染毒的设计不同， 分 为： 1. 固定剂量法： ➢ 先测出1次染毒的LD 50（1），然后每天 给予 1/10(1/20) LD 50 直到半数动物死亡为 止， 此时总剂量即为 LD 50（n）
2. 剂量递增法： ➢ 实验开始时 ， 按 0.1 LD 50 × 4 天 ， 0.15LD 50 × 4天，0.22LD 50 × 4天， 0.34LD 50 × 4天，依次类推，最长28天， 试验期间，当化学物引起动物累计死亡一 半时间即可终止，计算K值
3、剂量选择与分组
亚慢性试验的上限剂量，需控制在实 验动物接触受试化合物的整个过程中，不发 生死亡或仅有个别动物死亡，但有明显的中 毒效应，或靶器官出现典型的损伤。此剂量 的确定可参考两个数值，一是以急性毒性的 阈剂量为亚慢性试验的最高剂量；一是以此 化合物LD 50 的 1/20－1/5为最高剂量。
Ⅲ 生物半减期法 ➢ 生物半减期法是用毒物动力学原理阐明 外源化学物在机体内的蓄积作用特征。
四、局部毒作用
• • • • • • • 1.皮肤原发性刺激试验 2.皮肤致敏反应试验 3.光致敏反应 4.光刺激试验 5.眼刺激试验 6.其他粘膜刺激试验 7.替代（体外）试验
实验动物的选择
• 慢性毒性试验
年龄：大鼠 50~70g 狗 <8月 小鼠 初断乳 数量：小动物≥40 大动物≥8 性别：雌雄各半
2. 慢性毒性试验期限
– 工业毒理学—— 3－6个月 – 食品毒理学—— 6个月－1年 – 环境毒理学—— 6个月－1年 – 致 癌 试 验 —— 接近或等于动物的预期寿命
（三）慢性毒性试验方法要点
1、实验动物的选择 慢性毒性试验选择实验动物的条件与亚慢 性毒性试验相同。但实验动物最好为纯系 甚至同窝动物均匀分布于各剂量组 实验动物年龄应较小，大鼠和小鼠应为初 断奶者，即小鼠出生后3周，体重 10－12g； 大鼠出生后3－4周，体重 50－70g。性别 要雌雄各半
3）食物利用率：是指动物每食入100g饲 料所增长的体重克数。分析比较接触组与 对照组食物利用率，有助于分析受试化学 物对实验动物的生物学效应 4）症状：实验动物在接触外来化合物过 程 中所出现的中毒症状及出现各症状的先 后次序、时间均应记录和分析
实验室检查指标： ➢ 血象：包括红细胞计数、白细胞计数和 分类、血红蛋白定量等 ➢ 肝、肾功能的检测： SGOT、SGPT、 血清尿素氮、尿蛋白定性或定量、尿沉渣 镜检等 一般为筛检性和探讨性
染毒途径
❑ 经呼吸道接触，每日接触时间，依试验要 求而定 ❖ 工业毒物的试验通常每日吸入4～6小时 ❖ 环境污染物一般要求每日吸入8小时或更 长
3. 剂量的选择与分组
一般设3个染毒剂量组和1个对照组， 必要时另设一个溶剂对照组，即无作用剂 量组、阈剂量组、发生比较轻微毒性效应 的剂量组(此为最高剂量组)。以求出明确的 剂量－反应关系。
三、蓄积毒性作用
• 蓄积作用（accumulation)：当化学物与机 体发生亚慢性接触，将反复进入机体，而 且当进入的速度或总量超过代谢转化与排 出的速度或总量时，化学物就有可能在机 体内逐渐增加并贮留的现象。
• 蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础 ； • 一种外源化学物有无蓄积作用是评定该化 学物是否可能引起潜在慢性中毒的论据之 一，也是制定卫生限量标准时安全系数的 一种依据。
慢性毒性的剂量选择
• 阴性对照组 • 低剂量组 亚慢性阈剂量1/100 • 中剂量组 亚慢性阈剂量1/50～1/10 • 高剂量组 亚慢性阈剂量1/5~1/2 • 组距：2~5倍，最低不小于2倍
染毒组剂量的选择可参考三组数据
一是以亚慢性阈剂量1/5-1/2剂量为慢性毒
性试验的最高剂量，以这一阈剂量的1/501/10为慢性毒性试验的预计阈剂量组，并以 其1/100 为预计的慢性无作用剂量组
（二）慢性毒性试验的目的
1. 研究受试物慢性毒性的剂量一反应 （效 应）关系，确定其慢性毒性参数的下限， 即观察到有害作用的最低剂量（LOAEL） 和未观察到有害作用的剂量（NOAEL）， 为对该受试物的危险性评价和制定安全限 量提供依据
2. 研究受试物的慢性毒性效应谱，确定慢性 毒作用的靶器官 3. 如果试验期限不是终生染毒，则还应观察 受试物毒性损害的可逆性。 4. 为毒性机制研究和将毒性结果外推到人提 供依据
一是以急性毒性的LD50 剂量为出发点， 即
以LD 50 的1/10、1/100和1/1000为染毒剂量
各染毒剂量组之间的剂量间距应当大些，有
利于求出剂量-反应关系，也有助于排除实 验动物个体敏感性差异。 组间剂量差一般以 2-5倍为宜，最低不小于两倍
4. 观察指标
观察指标的选择，应以亚慢性毒性试验的
实验动物选择
亚慢性毒性试验 年龄：大鼠80~100g
狗 8~12月 小鼠10~15g
数量：小动物≥20
大动物≥6
性别：雌雄各半
2、染毒途径
亚慢性毒性试验接触外源化学物途径的选 择，应考虑两点： ① 尽量模拟人类在环境中接触该化合物的途 径或方式 ② 应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相 一致 具体接触途径主要有经口、经呼吸道和经 皮肤三种
（一）蓄积作用类型：
• 物质蓄积（material accumulation)：实验动物 反复多次接触化学物后，用化学分析方法能够 测得机体内存在该化学物或其代谢产物。 • 功能 ( 机能 ) 蓄积（ functional accumulation)： 有的化学物在• 剂量固定20天蓄积试验评价标准 ➢ 各剂量组均无死亡，蓄积性不明显 ➢ 1/2LD 50 剂量组死亡，其他组无死亡， 则弱蓄积性 ➢ 1/20LD 50 剂量组无死亡，其他各组间死 亡数有剂量反应关系，则为中等蓄积性 ➢ 1/20LD 50 剂量组有死亡，各组间死亡数 有剂量反应关系，则为强蓄积性
3. 研究受试物亚慢性毒性损害的可逆性 4. 为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选 择提供依据 5. 为在其他试验中发现的或未发现的毒作用 提供新的信息，比较不同动物物种毒效应 的差异，为受试物毒作用机制研究和将研 究结果外推到人提供依据
（三）亚慢性毒性试验方法的要点
1、实验动物的选择 亚慢性毒性作用研究一般要求选择两种实 验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿 类，如大鼠和狗，以便全面了解受试物的 毒性特征 由于亚慢性毒性试验期较长，所以被选择 动物的体重(年龄)应较小，如小鼠应为15g 左右，大鼠100g左右
• 在卫生毒理学实际工作中，蓄积作用试验多用小 鼠或大鼠为实验动物，一般以死亡为指标，其K 值计算公式如下： K= LD 50 (n）/LD 50 (1) LD 50 (n)表示引起一半动物死亡的累积总剂量 LD 50 (1)表示引起一半动物死亡的一次剂量 意义：K值越小，表示化学物的蓄积毒性越大
• 虽然蓄积系数法具有一定使用价值， 但是 某些外源化学物的慢性中毒效应，无法用K 值表示 • 例如多数有机磷化合物是属于轻度蓄积 (K>5)，但当小剂量反复与机体接触后，红 细胞与脑组织的乙酰胆碱酯酶可以持续降 低，而且伴有一定程度的中枢神经系统症 候
Ⅱ 剂量固定的20天蓄积法： ➢ 实验分为5组，包括阴性对照组和 1/20 LD 50 ，1/10LD 50 ，1/5LD 50 ，1/2LD 50 ， 每组动物数10只，雌雄各半， 每日染毒1次， 连续20天，观察每组动物死亡数
系统尸检和病理学检查
亚慢毒性试验中应重视病理学检查。 凡是在染毒过程中死亡的动物均应及时解 剖，肉眼检查后再进行病理组织学检查， 必要时作组织化学或电镜镜检。
脏器系数
脏器系数 (称脏/体比值)：是指某个脏器的湿重与 单位体重的比值，通常以100g体重计。 如肝/体比,即 (全肝湿重/体重) ×100, 此指标的意义：实验动物在不同年龄期，其各脏 器与体重之间重量比值有一定规律。若受试化学 物使某个脏器受到损害，则此比值就会发生改变， 可以增大或缩小。据此可提供受试物靶器官的重 要线索。 因此，脏/体比值是一个灵敏、有效和经济的指 标
• 生物学方法：即将多次染毒与一次染毒所 产生的生物学效应进行比较，故所测出的 蓄积性不能区分功能蓄积和物质蓄积。
（二）蓄积作用的研究方法
• 蓄积毒性试验目的 1. 求出外源化学物的蓄积系数，了解蓄积毒 性大小 2. 为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂 量选择提供参考
Ⅰ蓄积系数法原理：
–蓄积系数(accumulation coefficient)：多次 染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量 [ED50(n)]与一次染毒使半数动物出现相同效应 (或死亡)的剂量[ED50(1)]的比值，即： K＝ED50(n)/ED50(1) K＝LD50(n)/LD50(1)
观察指标为基础。其中包括体重、食物摄 取、临床症状、行为、血象和血液化学、 尿的性状及生化成分以及重点观察在亚慢 性毒性试验中已经显现的阳性指标。 应重视病理组织学的检查。凡试验期间死 亡的动物，都应做病理组织学检查。