植物蛋白酶(生姜蛋白酶)的提取纯化工艺
生姜蛋白酶提取工艺- 副本
生姜蛋白酶提取纯化工艺研究1 生姜蛋白酶的常规提取纯化工艺1.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4℃静置2 h，冷冻离心（10000rpm，5 min）去除沉淀，上清液用磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）定容至100mL（生姜蛋白酶溶液A），4℃冰箱贮存待用。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
1.2 乙醇沉淀法取生姜蛋白酶溶液A20mL，加入1.5 倍的无水乙醇进行沉淀，4℃静置 2 h后，冷冻离心（10000rpm，5 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液B）。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
1.3 丙酮沉淀法取生姜蛋白酶溶液A20mL，加入1.5 倍的4℃预冷丙酮进行沉淀，4℃静置2 h后，冷冻离心（10000rpm，5 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液C）。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
1.4 盐析法取生姜蛋白酶溶液A20mL，加入固体硫酸铵至40%饱和度，4℃静置30min后，冷冻离心（10000rpm，5 min），收集上清液继续加入硫酸铵至60%的饱和度，4℃静置2h后，冷冻离心（10000rpm，5 min），收集沉淀。
0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL （生姜蛋白酶溶液D）。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
生姜中蛋白酶的提取、分子量和含量的测定
蛋白酶活力的计算：
蛋白酶活力单位【U】= OD595nm * K * N
K--100除以络氨酸标准曲线上100mg/ml对应的OD595nm值
N--酶液稀释倍数
实验过程
（1）制作标准曲线
取7支试管，依次分别加入0.0、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50mL的牛 血清蛋白溶液，用水补足到0.5mL，每管再加5mL染色液，立即摇匀，置于室温 下5min，然后测定在波长595nm下的吸光度，并绘制标准曲线。 吸取0.5ml样品提取液于试管中，加入5ml考马斯亮蓝G250染色液，充分混匀， 静置5min，测量吸光度（OD595nm），记录结果，查标准曲线，得蛋白质浓度 X（μg/ml)
低分子量标准蛋白质液的组成
蛋白质
兔磷酸化酶B 牛血清蛋白 兔肌动蛋白 牛磷酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶
分子量
97400 66200 43000 31000 20100 14400
2、分离胶的制备 （1）安装电泳槽 （2）凝胶的制备（先配置分离胶，再配置浓缩胶） （3）灌胶 （4）样品处理 待测蛋白质样品处理：获得的蛋白质样品 50μl,再加入2x 样品缓冲液50μl混匀，在100℃水浴中煮沸5min。
（5）加样 待样品冷却后，用微量进样器吸取30-40μl样品白酶活力的定义：在一定温度（ 40℃）下，每分钟分解
酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。
实验方法：1.0ml蛋白酶液与1.0ml0.5%酪蛋白混合，40℃水浴 保温10min，加入2.0ml0.4mol/l三氯乙酸终止反应，静置10min 后过滤。取0.5ml滤液与5.0ml考马斯亮蓝充分混匀，静置5min， 在595nm处，以对照调消光度0，测量样品吸光度。
生姜蛋白酶的研究进展
从鲜姜中提取的粗酶很快褐变。这一过程可能包 括：在内源多酚氧化酶的作用下，多酚氧化形成醌类化 合物。醌进而可以和氨基、巯基以及生姜蛋白酶中的其 他亲核残基反应，因此导致了酶活性的降低。Ｄ Ｄ Ｔ 和 ＶＣ都是褐变的抑制剂，然而，前者并不能稳定生姜蛋 白酶。显然，对褐变的抑制不能说明ＶＣ稳定生姜蛋白 酶的机理。
又如：２００５年，Ａｄｕｌｙａｔｈａｍ等在研究生姜蛋白酶 的部分纯化和稳定性的时候采用如下的提取方法［５］： 鲜姜，切片，与４倍（ｗ／ｖ）的冷Ｔｒｉｓ－盐酸缓冲溶液 （０．０５Ｍ，ｐＨ８）混合均匀，均质，四层纱布过滤，滤 液在５℃，１２０００ｇ的离心机中离心２０ｍｉｎ。上清液，即 生姜蛋白酶，在５℃保存。
用ＤＥＡＥ－纤维素柱层析对该酶进行了纯化，证明该酶是 由两个组分（ＧＰ－１、ＧＰ－２）构成的，除电泳迁移率外， 两个组分在其他方面基本相同；用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００测得 两个组分的分子量均为２２５００，ｐＩ为７．０和８．０，纯酶结晶 为六面体。１９７８年Ｏｈｔｓｕｋｉ、ｋｏｚｏ等人用Ｐ－１００生物胶过滤 对该酶进行纯化，得出该酶分子量为２９０００。１９９５年，赵 帜平等［７］以安徽舒城的生姜为原料，采用ＤＥＡＥ－纤维 素ＤＥ－５２和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５纯化得两个组分，等电点分别 为７．０和８．０，用苯酚－硫酸法鉴定均为糖蛋白，并证明糖 肽键型均为非Ｏ－型。同年，Ｏｈｔｓｕｋｉ再次发表论文［８］， 报道了用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５纯化该酶，用 等电聚焦电泳将该酶分为三个组分，ｐＩ值分别为４．５、４． ６和４．８，并用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＴＳＫＧ２０００ＳＷ 凝胶过滤再次证明该酶分子量为２９０００。２００２年，代景 泉［９］以莱芜生姜为原料，用硫酸铵沉淀法对生姜蛋白酶 进行粗提，证明了生姜蛋白酶具有酸性蛋白酶的性质， 并用ＤＥＡＥ－纤维素ＤＥ－５２对该酶进行纯化，将该酶分为 两个组分，用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳得出其分子量分 别为４７０００左右和１４０００左右。 ２．２ 分子结构
生姜蛋白酶提取设备主要步骤
生姜蛋白酶提取设备主要步骤
生姜蛋白酶是从生姜中提取的一种新型的水解蛋白质的催化剂，与木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶等属于丝氨酸家族蛋白酶，能特异水解由脯氨酸氨基组成的肽键。
目前生姜蛋白酶提取的方法主要有两种：一种是反胶束萃取法，另一种是以生姜丙酮干粉为原料的制备方法。
两种方法各有特点，现分别介绍如下。
反胶束萃取纯化生姜蛋白酶工艺，以阴离子反胶束从粗酶提取液中进行分离纯化生姜蛋白酶，其主要优点是选择性较高，可在室温下进行处理，反胶束经处理后可再次回用。
生姜蛋白酶分离提取设备主要步骤
①粉碎、提取称取Ikg采摘3天以内的新鲜生姜块茎，切成约
1cm*1cm小块，加入4L温度为4℃、pH值为6.0的0.2mol/L磷酸缓冲液，置于高速组织匀浆机中粉碎，8层纱布过滤。
收集滤液，滤渣再次用6L上述缓冲液分两次进行匀浆粉碎处理，同法过滤，弃滤渣，合井滤液。
②盐析将收集的滤液用离心机以4000r/min的转速离心10min，收集上清液，加入饱和硫酸按溶液进行盐析，使上清液中的硫酸钱终饱和度达到60%时止。
③脱盐将盐析液用离心机以4000r/min转速离心15min，收集不溶物用少量pH7.50的柠檬酸缓冲液溶解，在4℃下对同种缓冲液透析脱盐8h，获得粗生姜蛋白酶提取液。
④萃取除杂取1L粗生姜蛋白酶提取液，加入等体积0.05mol/L的AOT-异辛烷反胶束液，用电动搅拌器以2OOr/min搅拌萃取5min，以除去提取液中的部分杂蛋白。
4000r/min离心10min，收集萃余液，再次用等体积0.05mol/L的AOT-异辛烷反胶束液同法萃取及分离。
生姜蛋白酶的分离纯化
生姜蛋白酶的分离纯化代景泉;黄雪松【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2003(024)002【摘要】生姜蛋白酶能够特异地水解P2位置是脯氨酸(Pro)的肽和蛋白质,这种对Pro的特异性使生姜蛋白酶成为一种非常有前途的用于蛋白质测序和蛋白质中稳定结构域识别的工具酶.中国传统食品"姜撞奶"采用姜汁作为凝乳剂,其中的凝乳因子已被证明是生姜蛋白酶.生姜蛋白酶的凝乳性质使之有望成为奶酪生产中小牛皱胃酶的替代品.此外,生姜蛋白酶在工业上还有更广阔的应用前景.本研究针对生姜蛋白酶的特点,制订一套简便有效的纯化方案,为进一步的基础研究和应用研究提供合格的样品酶.经过实验确立了以下纯化方案:将生姜制成丙酮粉,然后用20倍(W/V)0.1mol/L,pH8.0的磷酸缓冲液提取;上清液加硫酸铵至40%饱和度,其间控制pH＞7.0,离心弃去沉淀,上清液继续加硫酸铵至80%饱和度,离心,取沉淀;将沉淀先对0.1mol/L的氨水透析2h,然后对蒸馏水透析至无SO42-检出,最后对层析初始缓冲液进行延长透析至内外离子强度相等;上DEAE-纤维素DE-52柱;层析初始缓冲液为0.01mol/L,pH8.0Tris(含0.5mmol/L DTT,0.2mol/LNaCl),0.05～1mol/LNaCl梯度洗脱,柱1.5×5.0cm,流速0.75cm3/min,收集速度3ml/管,收集酶活峰,得到在SDS-PAGE上表现为一条带的样品C1和C2.【总页数】7页(P73-79)【作者】代景泉;黄雪松【作者单位】山东农业大学食品学院,泰安,271018;山东农业大学食品学院,泰安,271018【正文语种】中文【中图分类】Q814.1【相关文献】1.生姜蛋白酶和生姜汁对猪肉嫩化效果的比较 [J], 唐晓珍;黄雪松;王明林;马明;李坤2.生姜蛋白酶的分离纯化及其酶学性质初步研究 [J], 游庆红;尹秀莲3.生姜蛋白酶的分离纯化及其糖肽键型的初步研究 [J], 赵帜平;周恩志4.生姜蛋白酶的分离纯化 [J],5.生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶对干腌羊火腿微生物菌相变化的影响 [J], 阿尔祖古丽·阿卜杜外力; 玉素甫·苏来曼; 巴吐尔·阿不力克木因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
SephadexG_50纯化生姜蛋白酶的研究
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行纯化, 获得了较好的纯化效果。
1 材料与方法
111 材料与仪器
生姜 购自山东泰安当地超市; Sephadex G- 50 W hatm an( 进口分装 ); 酪蛋白、酪氨酸、BSA ( 牛血清 蛋白 )、Coom ass ie B lue G- 250 上海化学试剂采购供 应站进口分装; 其它为实验室常规试剂。
p ro tea s e inc rea s ed to 41192 fo lds o f g ing e r ju ice, a nd 21113 fo lds o f c rude g ing e r p ro te as e, b ut a lso p ig m e n,t
inso lub le mi pu ritie s w e re rem o ve d, w h ic h ind ic ts a g o od e ffe c t o f p u rifica tion1
b y g ing e r p ro tea se y ie ld, pu rifie d fo ld s, a nd the e ffic ie nc y o f c hrom a tog ra p hy co lum n1T he pa ram e te rs w e re: g e l
b ed le ng th) 50cm, sam p le a pp lica tio n am o unt) c rud e g ing e r p ro te a se 3m L ( e x tra c te d from 10g g ing e r) , flow
杜新永 1, 2, 唐晓珍1, * ( 11山东农业大学食品科学与工程学院, 山东泰安 271018;
21山东省青州市农业局, 山东青州 262500)
植物蛋白酶家族新成员生姜蛋白酶的生产工艺
植物蛋白酶家族新成员生姜蛋白酶的生产工艺
生姜蛋白酶是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为是植物蛋白酶家族的又一新成员。
生姜蛋白酶是从生姜中提取蛋白水解活性的酶，生姜蛋白酶可以使肉类嫩化，不仅可以显著提高肉的嫩度，而且可以使其具有良好的风味。
也可用来酒类澄清，可显著提高啤酒和葡萄酒的澄清度。
传统的分离纯化方法采用的沉淀剂主要是有机溶剂如丙酮和乙醇，盐类如硫酸铵，以及单宁等。
因为生姜蛋白酶是大分子物质，在过程中易产生农化极差现象，且存在生姜蛋白酶中易变性以及有机溶剂残留问题。
生姜蛋白酶超滤膜分离设备采用的超滤法是进行蛋白质的重要方法，在酶的分离过程中为了除去酶溶液中的盐分、有机溶剂等小分子物质等的分离方法，就是利用膜的孔径将各种小分子化合物去掉。
德兰梅勒超滤膜分离设备在生姜蛋白酶工艺中成为十分重要的一步。
生姜洗净后切碎，榨成汁后经离心分离机除去淀粉，再经过抽滤后应用超滤设备进行过滤，最后取浓汁进行真空冷冻干燥保存。
超滤是一种与膜孔径大小相关的筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过滤介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。
生姜蛋白酶超滤膜分离设备利用超滤技术操作简单、分离速度快、温和、减少二次污染，属于绿色环保工艺。
项目名称：生姜蛋白酶的提纯与固定化及肉类嫩化技术
项目名称：生姜蛋白酶的提纯与固定化及肉类嫩化技术申报奖种：山东省科学技术进步奖项目简介：本项目是在多个“生姜蛋白酶”课题资助的基础上,由山东省科技攻关项目、山东省自然科学基金资助的研究成果,利用我省特色生姜资源进行生姜蛋白酶的提纯、固定化、应用研究,拥有自主知识产权,达到国内领先水平;包括以下主要内容：1生姜蛋白酶的提取纯化技术：确定了生姜蛋白酶的最佳提取、纯化配套方案为无水乙醇沉淀法提取后采用Sephadex G-50 Medium尺寸排阻层析SEC纯化和Cellulose DE-52与Sepharose DE-52两种离子交换层析IEC联合纯化法;以姜汁酶活力为基准,SEC纯化倍数达到倍,是粗酶的倍;并确定了生姜蛋白酶由两个等电点不同的组分组成,且都是酸性蛋白质;2双水相萃取法：确定了生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法中聚乙二醇最佳分子量和浓度、硫酸铵和NaCl电解质的最佳浓度以及双水相的配比和最佳pH,确定了第二、三步硫酸铵盐溶液的添加量和浓度;第一步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为,酶活力回收率为%,上相酶纯化倍数为,酶的得率为%；第二步分别为, %, , %；第三步为,%,,%;3确定了乳化-交联法制备活性壳聚糖微球的最佳制备条件,及以其为载体采用吸附-交联法固定生姜蛋白酶的最佳固定化条件,所得固定化酶的酶活力为g,酶活回收率达到了%;同时比较了固定化酶与游离酶的酶学性质差异;4研究了生姜蛋白酶对肉类嫩化的最佳工艺条件是：酶用量为%,pH为,预处理温度为50℃,预处理时间是2h,嫩化效果显著;并通过测定牛肉肌纤维的小片化指数和牛肉肌纤维直径、全肌肉蛋白SDS-PAGE电泳等牛肉超微结构的变化,推断其嫩化机理可能是：生姜蛋白酶将牛肉肌纤维软化、分解,使牛肉肌纤维直径减小,促进牛肉肌纤维的小片化,同时促进了牛肉蛋白质降解成更小的物质,使牛肉成分整体上分解为更细、更小的成分,使其食用时变得细嫩、松软,从而达到嫩化的效果;5收集到全国38种不同品种的生姜,比较了不同品种生姜中蛋白酶含量差异,发现不同品种生姜中蛋白酶含量从黄山老姜到丹东姜,差异很大,从而分析出了国内外专家学者关于生姜蛋白酶的许多分歧点的可能原因是不同品种间的差异,这是造成生姜中蛋白酶含量差异较大的主要原因,远远高于不同提取方法造成的生姜蛋白酶含量差异;授权专利情况：专利“生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法”已经授权;应用推广情况：生姜蛋白酶可广泛应用于食品、药品、纺织等领域,投资少,前景广阔,尤其发达国家,如欧美市场有大量需求;该项目已经在山东莱芜东兴源食品有限公司、山东日照赛普食品有限公司等4家单位进行了生产,三年新增利润万元,这主要是因为市场上该类产品很少,满足不了市场需求,价格昂贵,利润丰厚;我单位与日照赛普食品科技有限公司于2010年正式合作,通过国家农业成果转化项目2011GB2C600022进行该成果的推广和大规模、专业化生产；2011年与山东莱芜东兴源食品有限公司合作,成功启动了国家科技支撑计划子课题“生姜功能成分高效分离关键技术研究与功能食品开发”;全部完成人排序及对项目的贡献和工作量全部完成人排序：唐晓珍、张平平、王玉民、位思清、姜媛、乔旭光、马明、赵冬艳、申江涛全部完成人对项目的贡献和工作量：唐晓珍负责项目的申报书撰写,实验内容、技术路线、实验方案的设计；各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写,对项目各项创新都做出了不同的贡献,对本项目各项创新的具体贡献分别是1有4篇通讯作者的文章；2有1项第一位发明专利和2篇通讯作者的文章；4有2篇第一位、2篇通讯作者的文章；3、5是相关研究生论文的导师;投入的工作量占本人工作总量的80%左右;张平平参与完成了创新1、2、3、5,具体负责生姜蛋白酶的酶学性质的整个研究的实验内容、技术路线、实验方案的设计；各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写,,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的70%;王玉民：参与完成了创新点1、2、3、5,具体负责生姜蛋白酶的纯化试验等技术路线和试验方案的设计以及部分实验,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的70%;位思清：参与完成了创新点1、2、3、5,具体负责生姜蛋白酶的纯化试验等技术路线和试验方案的设计以及部分实验;负责整个项目的设备选型、维修,数据处理以及38种生姜中姜酶含量差异试验的设计与试验;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;姜媛：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责各个创新点的资料收集、查新、数据处理以及部分生姜蛋白酶的固定化技术试验的实施,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;乔旭光：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责各个创新点的实验设计与技术路线,负责整个项目的组织实施和生姜蛋白酶的固定化技术路线和试验方案的设计和工作报告的撰写;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;马明：参与完成了创新点1、2、3、4、5的各种实验指标测试,重点参与了创新点538种生姜的收集、调研以及提取试验的设计与试验;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;赵冬艳：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责生姜蛋白酶固定化的实验内容、技术路线、实验方案的设计及其各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的40%;申江涛：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责整个项目技术在其单位推广方案设计,组织生产的实施；推广技术在其单位应用效果的统计和经济效果的核算以及相关资料的撰写;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的30%;全部完成单位及排序：山东农业大学、日照赛普食品科技有限公司五、推广应用情况、经济效益和社会效益。
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生姜蛋白酶的提取纯化工艺
一、实验目的
1、掌握生姜蛋白酶提取纯化工艺的基本原理和操作步骤
2、掌握生物工程下游加工技术的一些方法和技能
二、实验原理
生姜蛋白酶是从生姜中提取的有蛋白水解活性的酶，可用于肉类嫩化、酒类澄清等。
其提取分离技术有超滤法、盐析法、有机溶剂法、絮凝法、亲和层析法等。
然而，生姜蛋白酶属大分子物质，超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极化现象，且生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及存在有机溶剂残留等问题，盐析法提取的生姜蛋白酶活性较低，与应用要求相差甚远；絮凝法提取专一性不强,制得的生姜蛋白酶纯度不高；亲和层析法提取的酶纯度虽然较高，但是操作复杂，不易工业化生产。
相对来说，双水相萃取法能有效分离提取高纯度生姜蛋白酶。
原因是双水相萃取具有两相界面而张力低，有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递，易于连续化操作，具有目标产物收率高, 不存在有机溶剂残留，分离过程经济等特点。
双水相萃取技术是利用一种高分子聚合物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合物，在一定浓度下将体系分成互不相溶的两相，由于表面性质、电荷间及各种作用力（如憎水键、氢键和离子键）等因素的影响，使得目标蛋白酶和其他蛋白质在两相间的分配系数不同，从而达到分离目的。
通过调整双水相系统中一系列参数就可选择性地萃取目标蛋白酶。
本实验对成相物质组成、浓度和萃取条件进行了初步探索，建立了操作条件温和、能耗低、易放大、可连续操作、无有机溶剂残留、简单可行的分离提取生姜蛋白酶的方法。
三、试剂与仪器
试剂：生姜 TCA纯度99.0％，酪蛋白含氮14.5％-15.5％，考马斯亮蓝G-250，各种聚乙二醇（PEG800、PEG1000、PEG2000、PE G4000、PE G6000、PE G8000，）；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，EDTA纯度99.5％，L-半胱氨酸含量98％～102,生姜蛋白酶, 主要仪器：紫外分光光度计，离心机，美菱榨汁·搅拌机，精密增力电动搅拌器，酸度计，
四、操作步骤
1、生姜蛋白酶的提取
取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉淀，上清液用1.5倍的无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
2、双水相萃取
将不同分子量的聚乙二醇和成相盐按质量比配制一系列不同浓度及pH的双水相体系，每个双水相体系改变一个参数。
由于备用溶液黏度很高，为减少误差，各组分含量均以质量分数（w）表示。
加入一定量的聚乙二醇和下相盐后用去离子水调系统总质量至20g。
充分溶解后倒入60ml的分液漏斗中进行分相，待分相完成后加入3m l的生姜蛋白酶粗酶液。
将分液漏斗封口，反复倒置2～3min，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2h，使体系上下相分离完全。
3、生姜蛋白酶活力测定
精密量取样品酶液1.0ml于试管中，40℃水浴中保温5min，吸取预热40℃酪蛋白（0.5％）2.0m l加入此管，在40℃下反应5min，立即加入三氯乙酸（TCA）2.0ml摇匀，过滤；另取样液1.0ml置另一试管中，加入TCA 2.0ml，40℃保温5min后立即加入预热40℃酪蛋白液2.0ml，摇匀过滤。
以后管为对照，测前管滤液的A b s 280n m值。
标准曲线方程为：y = 802.92x - 9.5212，单位：U。
4、蛋白质含量的测定
本试验采用BradfordProtein Assay（考马斯亮蓝G-250）法测定蛋白质浓度。
按1ml 样品加5ml考马斯亮蓝指示剂，于2～10min内测定Abs 595nm吸光度值。
标准曲线方程为：y = 97.142x-1.2932，单位：μg/ml。
5、生姜蛋白酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
⑴蛋白酶的电泳分离
采用垂直平板式的聚丙烯酞胺凝胶电泳法,分离胶浓度为7.5 % , PH8.9,交联度2.3 %,浓缩胶浓度为2.8% ,交联度2.3 % ,PH6.7。
光照聚合,电极缓冲液用Tris一Gly体系(PH8.3,0.1M ) 。
生姜汁点样量100μL,电泳电压:浓缩胶为60 V ,分离胶为150V，冰箱中电泳约4 小时,溴酚蓝为前缘指示剂。
电泳结束后,凝胶以每0.5cm 为一小段切下,按上述方法测其生姜蛋白酶活性, 以迁移率为横坐标, 酶活性为纵坐标作图,由酶活的峰值确定出蛋自酶的同工酶组份及各组份的迁移率。
（2）生姜蛋白酶的等电聚焦电泳分离及等电点的测定方法
以聚丙烯酞胺凝胶为介质,按1%加载体两性电解质pharmalite, 凝胶浓度7.5 %,交联度3.0%,光照聚合,电极溶液用磷酸一NaOH系统,点样量100μL,以细胞色素C作聚焦指示剂,15OV电压于冰箱中电泳聚焦约4小时。
电泳结束后,以每0.5cm为小段从上到下切下,按上述方法测酶活,以横坐标表距离,纵坐标表酶活,同时在空白凝胶带上由上到下切成0.5cm长的小段,分别浸于2ml的重蒸馏水中过夜,测浸提液的PH值,横坐标表距离,纵坐标表PH值,得一条等电聚焦电泳的“pH一距离曲线”,由此曲线确定生姜蛋白酶各组份的等电点。
6、计算方法
（1）分配系数：生姜蛋白酶的分配系数等于上下相各自酶活性值的比值[20]。
公式为：K E=Et/Eb。
E是生姜蛋白酶的酶活力单位；下标t和b分别代表上相和下相。
相似的蛋白质的分配系数K P的计算公式为：KP=Pt/Pb，P是蛋白质的浓度，单位：μg/ml。
（2）纯化倍数：生姜蛋白酶提取相（上相）中的纯化倍数可用下列公式计算[21]：PF=(Et/Pt)/(Ei/Pi)，Ei是生姜蛋白酶原酶液的活性，单位：units/ml；Pi是原酶液总蛋白质浓度，单位：μg /ml。
（3）酶活回收：分相后酶活回收的计算公式是[22]：R=EtVt/EiVi，Vi和Vt分别代表原酶液体积和上相体积。
（4）上下相体积比：V=Vt/Vb，Vt和Vb分别代表分相后上相和下相的体积。