植物蛋白酶提取纯化工艺
菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
生姜蛋白酶提取工艺- 副本
生姜蛋白酶提取纯化工艺研究1 生姜蛋白酶的常规提取纯化工艺1.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4℃静置2 h，冷冻离心（10000rpm，5 min）去除沉淀，上清液用磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）定容至100mL（生姜蛋白酶溶液A），4℃冰箱贮存待用。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
1.2 乙醇沉淀法取生姜蛋白酶溶液A20mL，加入1.5 倍的无水乙醇进行沉淀，4℃静置 2 h后，冷冻离心（10000rpm，5 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液B）。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
1.3 丙酮沉淀法取生姜蛋白酶溶液A20mL，加入1.5 倍的4℃预冷丙酮进行沉淀，4℃静置2 h后，冷冻离心（10000rpm，5 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液C）。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
1.4 盐析法取生姜蛋白酶溶液A20mL，加入固体硫酸铵至40%饱和度，4℃静置30min后，冷冻离心（10000rpm，5 min），收集上清液继续加入硫酸铵至60%的饱和度，4℃静置2h后，冷冻离心（10000rpm，5 min），收集沉淀。
0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL （生姜蛋白酶溶液D）。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
植物蛋白酶(生姜蛋白酶)的提取纯化工艺
生姜蛋白酶的提取纯化工艺一、实验目的1、掌握生姜蛋白酶提取纯化工艺的基本原理和操作步骤2、掌握生物工程下游加工技术的一些方法和技能二、实验原理生姜蛋白酶是从生姜中提取的有蛋白水解活性的酶，可用于肉类嫩化、酒类澄清等。
其提取分离技术有超滤法、盐析法、有机溶剂法、絮凝法、亲和层析法等。
然而，生姜蛋白酶属大分子物质，超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极化现象，且生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及存在有机溶剂残留等问题，盐析法提取的生姜蛋白酶活性较低，与应用要求相差甚远；絮凝法提取专一性不强,制得的生姜蛋白酶纯度不高；亲和层析法提取的酶纯度虽然较高，但是操作复杂，不易工业化生产。
相对来说，双水相萃取法能有效分离提取高纯度生姜蛋白酶。
原因是双水相萃取具有两相界面而张力低，有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递，易于连续化操作，具有目标产物收率高, 不存在有机溶剂残留，分离过程经济等特点。
双水相萃取技术是利用一种高分子聚合物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合物，在一定浓度下将体系分成互不相溶的两相，由于表面性质、电荷间及各种作用力（如憎水键、氢键和离子键）等因素的影响，使得目标蛋白酶和其他蛋白质在两相间的分配系数不同，从而达到分离目的。
通过调整双水相系统中一系列参数就可选择性地萃取目标蛋白酶。
本实验对成相物质组成、浓度和萃取条件进行了初步探索，建立了操作条件温和、能耗低、易放大、可连续操作、无有机溶剂残留、简单可行的分离提取生姜蛋白酶的方法。
三、试剂与仪器试剂：生姜 TCA纯度99.0％，酪蛋白含氮14.5％-15.5％，考马斯亮蓝G-250，各种聚乙二醇（PEG800、PEG1000、PEG2000、PE G4000、PE G6000、PE G8000，）；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，EDTA纯度99.5％，L-半胱氨酸含量98％～102,生姜蛋白酶, 主要仪器：紫外分光光度计，离心机，美菱榨汁·搅拌机，精密增力电动搅拌器，酸度计，四、操作步骤1、生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉淀，上清液用1.5倍的无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺的研究_冯秀萍
SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺的研究_冯秀萍SUMO蛋白酶是一种重要的酶类，广泛应用于生物医学和生物工程领域。
因此，研究SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺对于提高SUMO蛋白酶的产量和纯度具有重要意义。
本文将结合已有的文献，对SUMO蛋白酶的生产和纯化工艺进行综述。
SUMO（Small Ubiquitin-like Modifier）蛋白酶是一类参与蛋白质修饰的酶，它通过与底物蛋白结合并结合底物蛋白，参与了调控多种细胞生物学过程，如DNA复制、DNA修复、染色质结构等。
因此，SUMO蛋白酶的产量和纯度直接关系到其功能的发挥和应用的效果。
SUMO蛋白酶的发酵工艺主要包括发酵条件的优化和基因工程菌的构建。
发酵条件的优化主要涉及培养基的优化、发酵温度和pH的调控以及酶基因表达的调控。
培养基的优化包括碳源、氮源、微量元素等营养物质的调配，以及添加适量的表达诱导剂。
发酵温度和pH的调控对于细胞的生长和酶的活性具有重要影响。
另外，酶基因的表达调控也是提高SUMO 蛋白酶产量的关键。
研究者可以通过构建高效的表达载体，包括选择适合的启动子、优化信号序列等方式来提高酶基因的表达水平。
SUMO蛋白酶的纯化工艺主要包括细胞破碎、蛋白质提取和纯化、SUMO酶的活性检测和纯化后的鉴定。
细胞破碎可以选择机械破碎、超声波破碎和动物细胞基因工程等方法。
蛋白质提取和纯化可以通过溶解、清除杂质、浓缩等步骤实现。
SUMO酶的活性检测可以采用多种色谱技术，如酶联免疫吸附测定、酶活性测定等。
纯化后的鉴定主要利用SDS-和质谱分析等方法。
研究SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺需要综合考虑多种因素，例如工艺参数的选择和调控，以及酶活性的检测和鉴定等。
此外，在研究过程中还要注意保护环境和提高产品质量。
因此，有关SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺的研究仍然具有重要意义。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取一、实验目的：1、了解菠萝蛋白酶的提取和纯化工艺2、优化和加深熟悉菠萝蛋白酶提取技术二、实验原理：菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000 ，等电点为9.55 。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
产品已被广泛应用于食品、医药等行业。
结果表明。
提取菠萝中菠萝蛋白酶最佳提取工艺条件是添加单宁溶液的浓度为0．2％，提取时最适pH值为6．5～8．5左右，而最适提取温度为60℃。
菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
三、实验步骤操作要点：菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。
上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。
虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。
离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml，搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因
![[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因](https://img.taocdn.com/s3/m/8ea02ca0ed630b1c59eeb5dd.png)
[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因菠萝蛋白酶提取一、实验目的：1、了解菠萝蛋白酶的提取和纯化工艺2、优化和加深熟悉菠萝蛋白酶提取二、实验原理：菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
其外观为浅灰色粉末状，分子量为 33000 ，等电点为 9.55 。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
产品已被广泛应用于食品、医药等行业。
结果表明。
提取菠萝中菠萝蛋白酶最佳提取工艺条件是添加单宁溶液的浓度为0．2％，提取时最适pH值为6．5～8．5左右，而最适提取温度为60℃。
菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
三、实验步骤操作要点：菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。
上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。
虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。
离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml，搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取和纯化前言：木瓜蛋白酶(Papain) , 又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜茎叶和果实中,以未成熟果实的乳汁中为最高。
它既有很强的蛋白水解催化活性又含凝乳和溶菌活性,还具脂解能力及蛋白合成功能, 主要是催化蛋白质水解, 也能分解小肽。
它的切割分解点很多, 大致优先分解精氨酶, 苯丙氨酸的肽键。
又因其含量高、稳定性好、能有效地分解明胶、酪蛋白、谷蛋白、弹性蛋白、球蛋白和肌纤维蛋白等常用蛋白质，被广泛应用于肉类嫩化、啤酒澄清、明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等工业，另外还在医学方面主要用于治疗消化不良、各种炎症和水肿，防止腹膜粘连，处理血检及创伤脱痂；此外，它还可以用于研究蛋白质结构等等。
在番木瓜的茎、叶中含有木瓜蛋白酶,但在实际生产中,主要是从未成熟的生番木瓜果实中收集果皮创口流出的白色浆液,经过加工提纯后得到。
木瓜蛋白酶的生产以番木瓜未成熟果实的新鲜乳汁为原料，但因番木瓜种植区主要分布在经济不发达地区，所以蛋白酶生产工艺相对落后，很多地区仍采用太阳暴晒的方式生产木瓜蛋白酶。
另外，对于木瓜蛋白酶的商业化生产来说，不同用途的酶所要求的纯度存在相当大的差异……近年来，木瓜蛋白酶在工业上的应用日趋广泛，对其纯度要求也更高，因此，有必要对提取纯化工艺开展深入的研究。
下面主要介绍一种简单的提取纯化途径。
提取与纯化途径：1.主要流程：番木瓜 (采集浆液)→浆液(过滤)→滤液(单宁法去杂质干燥)→粗酶制品(加半胱氨酸混合研磨)→研磨混合液(调PH后过滤)→滤液(硫酸铵和氯化钠两次盐析) →盐析物(低温半胱氨酸溶液中结晶)→结晶体(重结晶) →精酶2.具体操作：（1）番木瓜浆液的采集：番木瓜果实的浆液中富含木瓜蛋白酶,但是在果实完全成熟时,白色浆液就会逐渐减少。
因此,采集浆液时应选择绿色的未成熟果。
其采浆方法是：用薄不锈钢刀片沿番木瓜果实的纵线将果皮割破,深度为2-3mm，根据果实大小，每个果实可以割5-10条刀口。
木瓜蛋白酶的生产过程
木瓜蛋白酶的生产过程1.材料准备：生产木瓜蛋白酶的关键材料是木瓜果肉。
新鲜、成熟的木瓜果肉是首选材料，因为它含有丰富的蛋白酶酶源。
其他所需材料包括维生素、糖、盐和发酵基质等。
2.果肉处理：将木瓜果肉经过清洗、去皮去籽等处理，然后剁碎成细小的颗粒状。
细碎的果肉便于酶的分离和提取。
3.酶的提取：将细碎的果肉加入适量的缓冲液中，使果肉与缓冲液的比例合适。
然后用搅拌器或搅拌棒进行搅拌，破碎细胞壁，使酶释放到溶液中。
4.澄清和过滤：将搅拌后的果肉与提取液进行分离，采用澄清法或过滤法将酶液中的果肉残渣去除。
过滤可以使用滤纸、纱布或特殊的滤网等。
5.稳定和富集：将已澄清的酶液进行稳定处理，添加适量的酶稳定剂和防腐剂，在适宜的温度下进行保藏。
同时，也可以利用浓缩和富集等工艺步骤提高酶的含量。
6.发酵过程：取适量的酶液与发酵基质进行混合，然后将混合物装入发酵罐中。
发酵过程需要控制合适的温度、湿度和通气条件等因素，使菌株能够生长繁殖，并产生丰富的酶。
7.发酵结束后，进行酶液的提取和纯化。
通常采用加热杀菌、固液分离、过滤、浓缩等步骤对发酵液进行处理，除去微生物和杂质，并得到纯净的酶液。
8.酶液的活性测定和品质检测：利用标准测定方法对木瓜蛋白酶液的酶活进行测定，以评估酶液的品质和活性水平。
常用的活性测定方法包括凝胶电泳法、酶联免疫吸附测定法等。
9.包装和贮藏：将酶液进行分装和灭菌包装，然后存放在低温下进行贮藏。
包装后的酶液需要标示清楚产品名称、规格、生产日期和有效期等信息。
总而言之，在木瓜蛋白酶的生产过程中，关键步骤包括木瓜果肉处理、酶的提取和分离、酶液的稳定和富集、发酵过程、酶液的提取和纯化、活性测定及品质检测、包装和贮藏。
这些步骤的严格控制可以保证木瓜蛋白酶的质量和活性，以满足市场需求。
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植物蛋白酶提取纯化工艺
生物工程09-2班陈福泉学号：3090343214
一、实验目的
1、了解植物蛋白酶常用的提取纯化方法的基本原理和基本操作；
2、掌握双水相和反胶束萃取的原理和操作步骤；
3、掌握蛋白质含量和蛋白酶酶活的检测方法
二、实验原理
植物蛋白酶常用的提取纯化方法有缓冲盐溶液提取、初步纯化的方法有有机溶剂法、乙醇粉法、丙酮粉法、盐析法、双水相法、反胶束萃取法等
以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高，最佳工艺为：以pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液25℃提取2次，料液比1∶1；应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化，粗酶液再以60%硫酸铵盐析24h，透析袋（14000）低温透析12h，冻干；酶学性质研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适pH值为
6.0，30℃保温30min，酶活稳定。
三、实验材料
材料与试剂
新鲜生姜、酪蛋白（化学纯）、考马斯亮蓝G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铵、丙酮等试剂均为分析纯。
0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250溶液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。
0.5%酪蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，先用少量0.55mol/L碳酸钠溶液润湿，再加少量
0.02 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮沸溶解，定容至100mL。
四、实验步骤
方法一：生姜蛋白酶提取液制备: 取定量新鲜生姜,切成小块后加入10 倍体积的pH 6. 0, 0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液( 4 e ) , 于粉碎机中匀桨, 8 层纱布过滤后于4000 rpm 离心10 min, 吸取上清液, 加入高饱和度的( NH4) 2SO4 液使盐析体系中( NH4) 2SO4 终饱和度为60% , 4000 rpm 离心15 min。
收集上层不溶物, 用少量pH 7. 50 的柠檬酸缓冲液溶解, 在4 e 下对同种缓冲液透析8 h。
透析液定容, 即为生姜蛋白酶提取液。
方法二：生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉
淀，上清液用1.5倍的无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
生姜蛋白酶的反胶束萃取：在生姜蛋白酶提取液加入等体积的AOT-异辛烷阴离子反胶束或CTAB-庚烷/ 辛醇阳离子反胶束, 用磁力搅拌器以200 rpm 的速度进行搅拌5~10 min, 8000 rpm 离心10 min, 萃余液( 下层) 用考马斯亮兰法测定残留生姜蛋白酶酶活力和蛋白质量。
生姜蛋白酶的pI= 5. 4~ 5. 5, 在pH 5. 4 以上, 用AOT-异辛烷反胶束不能萃取出生姜蛋白酶, 但是却可以萃取出71. 86% 的杂蛋白。
用CTAB 庚烷/ 辛醇反胶束二次萃取AOT-异辛烷萃余液, 其蛋白质萃取率为60125%。
双水相萃取将不同分子量的聚乙二醇和成相盐按质量比配制一系列不同浓度及p H的双水相体系，每个双水相体系改变一个参数。
由于备用溶液黏度很高，为减少误差，各组分含量均以质量分数（w）表示。
加入一定量的聚乙二醇和下相盐后用去离子水调系统总质量至20g。
充分溶解后倒入60m l的分液漏斗中进行分相，待分相完成后加入3m l的生姜蛋白酶粗酶液。
将分液漏斗封口，反复倒置2～3m i n，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2h，使体系上下相分离完全。
资料表明，P E G-缓冲盐双水相萃取生姜蛋白酶的最佳萃取条件为：P E G分子量为4000，P E G浓度为20％，磷酸缓冲液的p H值为6.5，浓度为10％，生姜蛋白酶上相酶活力回收R和纯化倍数P F可达279.05％和1.86
生姜蛋白酶活力测定
绘制标准曲线
配制各取6 支刻度试管, 分别加入0. 4、0. 8、1.2、1. 6、2. 0、2. 4μg 牛血清白蛋白2 滴1:1 HCl,及3 mL 考马斯亮兰G-250 液, 室温下显色30 min后用蒸馏水
定容至10 mL, 于595 nm 下测定OD
595。
以蛋白质质量为横坐标, OD
595
为纵坐标绘制标
准曲线。
其线性回归方程为:
Y= 01019X- 0. 001。
蛋白质浓度测定
取定量蛋白溶液, 加入pH= 6. 0 的磷酸缓冲液3 mL, 3 mL 考马斯亮兰G-250 液及2 滴1:1 HCl,室温下显色30 min 后用蒸馏水定容至10 mL, 于595 nm 下测定OD
595
, 根据标准曲线或线性回归方程计算蛋白质含量。
生姜蛋白酶活力
各取0. 2 mol/ L、pH= 6. 0 的磷酸缓冲液3 mL,分别加入0. 2%牛血清白蛋白溶液2 mL 及1 mL 生姜蛋白酶溶液, 于60 e 下反应15 min, 反应完成后
加入2 滴1B1 HCl 以终止反应, 对照则在加入生姜蛋白酶溶液之前加入同量1B1 HCl 以阻止反应发生。
加入3 mL 考马斯亮兰G- 250 液显色30 分钟后定容至10 mL。
分别于分光光度计上测定OD595,以反应前后OD595 差表示生姜蛋白酶活力。
以每分钟内每mL 蛋白酶提取液水解1 μg 牛血清白蛋白为生姜蛋白酶的活力单位。
生姜蛋白酶活力=
( 酶反应液OD
595-空白OD
595
) / mL 酶液·min- 1, 即μg牛血清白蛋白/ mL·min- 1。
1．安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。
同学们可根据具体不同型号要求进行操作。
主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。
2．配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度
3．制备凝胶板：
（1）分离胶制备：按表配制20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm 高，用1ml 注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm 高，以进行水封。
约30min 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。
倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。
（2）浓缩胶的制备：按表配制10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm 处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。
约30min后凝胶聚合，再放置20—30min。
待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm 以上，即可准备加样。
4．样品处理及加样
各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/mL，沸水浴加热3 分钟，冷却至室温备用。
处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1 分钟，以消除亚稳态聚合。
一般加样体积为10－15μL（即2－10μg 蛋白质）。
如样品较稀，可增加加样体积。
用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。
5．电泳
将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。
待样品进入分离较时，将电流调至20－30 mA。
当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。
拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
6．染色及脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h 左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。
计算
1.相对迁移率mR =样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）
2.以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。
五、注意事项
1. 不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种
方法测出的分子量是不可靠的。
包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。
例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。
因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。
2．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS 和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。
因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。
为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。