胰蛋白酶的提取
胰蛋白酶分离工艺
1、集落刺激因子（G-CSF ）组成结构：是一种含有二硫键的单链糖蛋白，由175个氨基酸残基组成的单链非糖基化多肽链理化性质：①性状：无色澄明液体②分子量：20000，等电点为5.8～6.6③溶解度：④稳定性：生理作用与临床适应症：作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能 ，主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症， 分离纯化工艺：G-CSF 为无菌冻干粉剂，由含有10mM 醋酸钠pH 为4的蛋白溶液经0.2um 过滤后分装冻干。
由含有高效表达人G-CSF 的原核表达系统（E.coli ）经发酵、分离和高度纯化后经冻干制成。
纯化液聚乙二醇浓缩洗脱液柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀沉淀蛋白质盐析洗脱液纤维素柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀饱和度至加入硫酸铵透析液透析滤液超滤浓缩正常成人尿液150ephadexG -%8020000 S DEAE 2、超氧化物歧化酶（SOD ）：组成结构：理化性质：①性状：淡蓝色冻干粉结晶体②分子量：32000左右③溶解度：④稳定性：耐热性强，90℃ 环境120分钟酶活几乎没有损失，100℃环境60分钟酶活保持90%以上；稳定性高，在pH4.0—11.0范围内酶活稳定。
生理作用与临床适应症：是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞分离纯化工艺：血液预处理,洗涤红细胞和溶血;去除大部分杂蛋白得SOD 粗品;再经柱层析分离得到精品。
猪血经血液预处理、洗涤红细胞、溶血、乙醇一氯仿混合液除去血红蛋白，然后用坟柳043HZO 萃取、丙酮沉淀、55一65℃热变性得到粗酶液。
粗酶液上阴离子DEAE 一Cellulose52交换层析柱、分子筛SephadexG-75柱,最终获得了纯化的铜锌超氧化物歧化酶。
冻干粉末冻干纯化液凝胶层析洗脱液柱柱层析上清液离心透析液磷酸钾缓冲液透析粗提液，后冰浴℃热处理重蒸水溶解沉淀离心加入预冷过的丙酮上清液离心上层液萃取加入上清液离心仿加入预冷过的乙醇，氯溶血液细胞溶胀沉淀离心清洗红细胞去血浆离心匀浆液草酸钾组织匀浆新鲜猪血7552min 1565-5542l a %5.2--SphadexG Cellulose DEAE HPO K C N 3、胰蛋白酶： 组成结构：理化性质：①性状：白色或米黄色结晶性粉末②分子量：24000左右pI10.5③溶解度：溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚④稳定性：最适pH 值7.8～8.5左右pH>9.0不可逆失活 生理作用与临床适应症：本品为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。
胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化综合分析
实验胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
实验（一）胰蛋白酶活性测定[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物，水解反应如下：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm 增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
胰蛋白酶的制备
一、猪胰蛋白酶制备（一）猪胰蛋白酶原的提取∙猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。
∙加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升）。
∙加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。
（二）胰蛋白酶原激活∙向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液。
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使Ca2+与SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中最终仍含有0.1M CaCl2。
2．用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活化8～10小时，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。
3．活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。
（三）胰蛋白酶的分离1．将已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。
2．滤液按250克/升加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤液。
（四）胰蛋白酶的结晶1．将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。
2．用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。
3．放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1 /5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。
猪胰蛋白酶酶活力的测定
猪胰蛋白酶酶活力的测定实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
胰蛋白酶
胰蛋白酶简介一、介绍胰蛋白酶（C6H15O12P3）为蛋白酶的一种。
在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。
在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。
作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。
它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。
是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量23800，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。
除存在于脊椎动物外，还存在于蚕、海盘车、蝲姑、放线菌等范围广泛的生物体中。
另外与高等动物的血液凝固和炎症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系，可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。
胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系，但其特异性则完全不同。
胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。
中国药品标准规定按干燥品计算，每1mg 的效价不得少于2500单位。
由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。
白色或米黄色结晶性粉末。
溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。
分子量24 000，pI 10.5，最适pH值7.8～8.5左右。
pH>9.0不可逆失活。
Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。
临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。
胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
提取与重组胰蛋白酶的不同
胰蛋白酶与重组胰蛋白酶药典标准比较胰蛋白酶药典标准历史2014年之前，只有从猪或牛胰腺提取的胰蛋白酶的标准，活性标准为2500USP units/mg，目前临床已不应用。
在2011年左右，通过了胰蛋白酶:糜蛋白酶（6:1）配方，用于消化道疾病的治疗。
在2013年12月出版了修订稿的“用于生物医药制造过程的辅助材料”，重组胰蛋白酶作为一个例子，给出标准。
2017年2月，FDA正式颁布胰蛋白酶的药典标准。
2010版中国药典第二部规定:药品的安全性保障得到进一步加强。
凡例中规定所有来源于人或动物的供注射用的原料药均增订“制法要求”。
在总则十四规定：（1）来源于动物组织提取的药品，其所用动物种属要明确，所用脏器均应来自经检疫的健康动物，涉及牛源的应取自无牛海绵状脑病地区的健康牛群；来源于人尿的药品，均应取自健康人群。
上述药品均应有明确的病毒灭活工艺要求以及质量管理要求。
（2）直接用于生产的菌种、毒种、来自人和动物的细胞、DNA重组工程菌及工程细胞，来源途径应经国务院药品监督管理部门批准并应符合国家有关的管理规范。
2010版中国药典第三部规定:2010版药典对安全性问题更加重视。
增修订细菌内毒素检查的品种达112种；药典三部增订了逆转录酶活性检查法等。
培养细胞用牛血清应来源于无牛海绵状脑病地区的健康牛群，其质量应符合本药典的有关规定；在生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程中，应提供细胞培养液的详细成分，如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、乳蛋白水解物胰蛋白酶重组胰蛋白酶外观形状白色或类白色溶解性可溶溶解性可溶生物载量NMT100CFU/ml 微生物限量-比活力(USP units/mg pro.)NLT3800金黄色葡萄球菌阴性纯度（HPLC）NLT70%β-trysin,NMT20%α-trypsin绿脓假单胞菌阴性沙门氏菌阴性干燥失重不高于5.0%灼烧残渣不高于2.5%糜蛋白酶限量不高于5.0%活性不低于2,500USP units/mg美国药典中，两种胰蛋白酶的标准的主要不同点:项目胰蛋白酶2014美国药典来源动物来源：从猪或牛的胰腺提取重组（无动物源性）：DNA来源产品纯度检测方法无HPLC活性2,500USP units/mg比活性：3800USP units/mg pro.美国药典中最重要的不同点:①无动物源性，由于辅料的质量，包括酶，应用在生物医药制造，会对治疗用产品有影响，因此无动物源性重组胰蛋白酶的使用是对于人畜共患病的病毒感染的必要预防措施。
测序级胰蛋白酶生产工艺
测序级胰蛋白酶生产工艺引言测序级胰蛋白酶是一种重要的酶制剂，广泛应用于生物医药领域的基因测序、蛋白质鉴定和结构研究等方面。
本文将详细介绍测序级胰蛋白酶的生产工艺，包括菌种培养、酶的提取与纯化、活性检测和产品包装等环节。
菌种培养测序级胰蛋白酶的生产通常采用大肠杆菌作为宿主菌。
首先，选择高产酶的菌株进行培养，常用的菌株有E. coli BL21(DE3)等。
接种菌株后，通过连续扩大培养来增加菌量。
培养基的配方需要根据不同菌株的需求进行调整，一般包括碳源、氮源、矿物质和生长因子等。
培养过程中，需要控制好温度、pH值和氧气供应等条件。
一般来说，温度维持在37摄氏度，pH值在6.8-7.2之间，氧气供应通过搅拌或气体通气来实现。
同时，还需要添加适量的抗生素来抑制杂菌的生长。
酶的提取与纯化菌体培养达到一定程度后，可以开始进行酶的提取与纯化。
首先，将培养物离心，分离出菌体。
然后，通过破碎菌体的方式将胰蛋白酶释放出来。
常用的方法有超声波破碎、高压破碎和酶解等。
接下来，需要对提取的酶液进行纯化。
纯化的目的是去除杂质并提高酶的纯度。
常用的纯化方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
通过这些方法，可以逐步去除蛋白质混合物中的杂质，得到纯度较高的胰蛋白酶。
活性检测在酶的纯化过程中，需要对酶的活性进行检测。
常用的活性检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光法和比色法等。
这些方法可以通过测量酶的底物转化速率或与底物结合的能力来评估酶的活性。
活性检测的结果可以用于调整工艺参数，优化生产过程。
同时，也可以作为产品质量的重要指标，保证测序级胰蛋白酶的活性符合要求。
产品包装经过提取、纯化和活性检测后，测序级胰蛋白酶可以进行最后的产品包装。
包装的目的是保护酶制剂，延长其保存期，并方便使用者使用。
常见的包装形式有冻干粉剂和液体制剂。
冻干粉剂可以通过冷冻干燥将酶溶液转化为固态粉末，便于储存和运输。
液体制剂则直接将酶溶液灌装在适当的容器中，方便用户取用。
实验：猪胰蛋白酶的分离纯 化
猪胰蛋白酶的分离纯化 与检测
主要内容
实验内容 实验目的 实验原理 实验方法 实验结果 实验报告格式
实验内容
一、猪胰蛋白酶的分离纯化 二、蛋源自质含量的测定 三、酶活力的测定 四、纯化效果检测
——SDS-PAGE电泳检测
实验目的
1、掌握盐析沉淀法、透析法及离子交换层析 的原理和操作过程；
在4℃下对0.001 mol/L HCl溶液透析3小时左右（每小时换 液1次 ！）
而后改用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（至少换 液3次，第一次1小时后换液，第二次是2小时后换液，第 三次是3小时后换液，然后过夜透析 ！）
（记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样3，测蛋白含量，及时 SDS化）
3. 离子交换层析法
同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。 蛋白质在其等电点以下（pH<pI），带正电荷，可被阳离子交换树
脂所吸附；而蛋白质在其等电点以上（pH>pI），带负电荷，可被 阴离子交换树脂所吸附。 本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰 蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤 维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正 电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过 增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。 在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的蛋
时SDS化 )
⑤硫酸铵盐析沉淀（75%饱和度） ——计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的 量。 （于4℃静置过夜）
⑥离心（离心10000 rpm，15 min）——取沉淀（为粗胰蛋白酶 ）
实验方法
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胰蛋白酶的提取原理和方法步骤
2010-03-29 14:21:31 来源：易生物实验浏览次数：404 网友评论0 条
在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。
在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。
需采用合适的方法进一步分离纯化。
关键词：胰蛋白酶trypsin
［原理］
在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。
在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。
需采用合适的方法进一步分离纯化。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出来。
经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀。
沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活，三种酶原相互作用过程如下：
也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原，利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通过溶液中Ca2+的环境，使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成
有活性的酶）。
激活后的酶溶液再进一步分离纯化。
［试剂和器材］
1、试剂
（1）pH2.5～3.0乙酸化的水溶液
（2）10%（体积分数）乙酸
（3）2mol/L硫酸
（4）固体硫酸铵
（5）无水CaCl2
（6）结晶胰蛋白酶
（7）25%乙醇溶液(含0.015mol/ＬHCl 、0.05mol/ＬCaCl2)
（8）95%（体积分数）乙醇
（9）5mol/ＬNaOH
（10）丙酮
2、器材
（1）胰脏
（2）组织捣碎机
（3）离心机
（4）磁力搅拌器
（5）透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅
（6）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗
（7）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等
［方法和步骤］
方法一
1、胰蛋白酶原的提取
取新鲜胰脏约150g，剥去结缔组织和脂肪，取净重100g，切成碎块，在组织捣碎机中捣碎，并加入2倍体积预冷的pH2.5～3.0 乙酸化水溶液，制成匀浆。
浆液倒入500mL烧杯中，用10%（体积分数）乙酸调节pH在2.5～3.0之间，在5～10℃下提取6h以上，并间隙轻轻搅拌。
用4层纱布过滤，尽量挤出滤液。
组织残渣中再加入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h），再用4层纱布过滤。
合并两次滤液，用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.5～3.0之间，4℃放置4h（pH始终保持在2.5～3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。
提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤，收集滤液，量取体积（约200mL左右）。
滤液中加入粉末状固体硫酸铵，使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492g，5℃）。
放置过夜，使胰蛋白酶原完全析出。
次日抽滤，弃滤液，压紧并收集滤饼，即胰蛋白酶原粗品。
2、胰蛋白酶原的激活
将胰蛋白酶原粗品称重（湿重），分次加入10倍体积预冷的蒸馏水（按滤饼重量计算），使滤饼完全溶解（一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重1/4）。
用5mol/L NaOH将溶液调至p H8.0，慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl2使溶液的Ca2+终浓度达到0.1mol/L（要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合生成硫酸钙的钙离子）。
取出2mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性。
原溶液中加入5mg结晶胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，25℃放置2～4h，或4℃放置12～16h，使胰蛋白酶原活化。
每隔1h取样测定胰蛋白酶活性增长情况，直至酶激活速度变慢或停止增长。
一般比活可达到3 500～4 000 BAEE单位/mg。
留取2mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。
激活酶溶液用2mol/L硫酸调pH至2.5～3.0，滤纸过滤，滤去硫酸钙沉淀，收集滤液，4℃保存备用。
方法二
称取冷冻猪胰脏100g，在2～5℃下解冻，切成小块，用组织捣碎机中绞碎成胰浆，在5～10℃
存放24h以上，使胰酶自身活化。
胰浆中加入25%（质量分数）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加0.015mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl2），捣碎机中捣碎1min。
胰浆倒入500mL烧杯中，间隙搅拌，温度20℃左右，活化5～6h。
每隔1.5h，吸取2mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。
活化反应结束后，胰浆3 500 r/min离心20min，将离心后上清液用二层纱布过滤。
滤液置250mL烧杯中，以过滤清液的体积为准，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使溶液硫酸铵饱和度为20%。
放置6h后，3 500 r/min离心20min，保存上清液待用，取沉淀。
沉淀分别用适量95%乙醇洗涤过滤，再用丙酮洗涤，过滤。
最后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅰ。
在上述离心上清液中，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使上清液溶液达到55% 硫酸铵饱和度，放置6h后，3 500 r/min离心30min，取离心沉淀，分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤，过滤后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅱ。
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