酶法制备大米活性肽及抗氧化性的研究
发酵法制备生物活性肽的研究进展
发酵法制备生物活性肽的研究进展作者：范吉釴柯义强刘红海来源：《安徽农学通报》2020年第23期摘要：生物活性肽是一类结构介于氨基酸和蛋白质之间的分子聚合物，具有多种生理功能，是当前研究的热点。
微生物发酵法制备生物活性肽是通过菌种在生长代谢过程中产生的蛋白酶水解底物蛋白从而制备生物活性肽的方法，其工艺简单、生产成本低、更易于产业化，应用前景广阔。
该文对微生物发酵法制备ACE抑制肽、抗氧化肽、抗菌肽和免疫活性肽的研究进展以及发酵肽产物的分离纯化方法进行了综述，并对微生物发酵法制备生物活性肽的研究趋势进行了展望，为今后发酵法制备生物活性肽的进一步研究提供参考。
关键词：生物活性肽;发酵法;抗氧化活性肽;超滤Abstract：Bioactive peptide is a molecular polymers with a structure between amino acid and protein，which has become the focus of current research because of its several physiological functions. Biologically active peptides prepared by microbial fermentation which is a method of preparing biologically active peptides by proteolytic produced by bacteria during the growth and metabolism process hydrolysis of substrate proteins has simple process，low production cost，easier industrialization，and broad application prospects. In this paper，the research progress of ACE inhibitory peptides，antioxidant peptides，antibacterial peptides，and immunoactivity peptides prepared by microbial fermentation and the methods of separation and purification of fermented peptide products are reviewed. It will provide references for the further studies on the preparation of biologically active peptides by the method of microbial fermentation.Key words：Bioactive peptide;Fermentation;Antioxidant active peptide;Ultrafiltration生物活性肽又称功能性多肽，是一种相对分子质量小于6000且具有多种生理功能的化合物[1-3]，它是一类是来源于蛋白质，由氨基酸经共价键连接而成的多功能化合物，对人体免疫和神经系统、内分泌系统、消化功能和心血管系统都有着重要的调节作用[4]，并且还具有抗氧化、调节血压、降低胆固醇、抑菌、抗肿瘤、提高免疫力、防癌等生理功能[5-7]。
大米蛋白研究与利用概述
大米蛋白研究与利用概述摘要：本文从大米蛋白组成成分、结构和性质出发，以研究开发和利用大米促进精深加工为支撑，阐述大米蛋白分离提取方法，概述国内外大米蛋白产品研究及开发利用现状，并对其前景进行展望。
关键词：大米；大米蛋白；提取工艺；制备；利用农业是国民经济的基础，粮食是基础的基础，是人类赖以生存、繁衍和发展的必要条件，也是食品工业的基础，是所有食品工业的基本原料的来源。
稻谷（Oyaza sativa）是人类重要的粮食种类之一，尤其是在亚洲地区。
2007年国际水稻研究所统计数据显示，近年来世界年生产稻谷总产量约为5.33亿t，中国的稻谷总产量达到1.865亿t，占35％，居世界首位。
稻谷生产和消费集中在亚洲地区，尤其以中国、印度尼西亚、孟加拉、越南和泰国为主［1］。
长期以来，稻谷生产和稻谷加工产品及副产品的深加工一直倍受食品科学家高度关注。
大米蛋白的开发和利用研究正是基于丰富稻米加工产品和合理利用稻米加工副产品的研究和综合利用。
因此，提取和合理利用大米中蛋白质具有重要社会和经济意义。
1 大米蛋白的组成和理化特性1.1 大米蛋白的组成大米蛋白具有优良营养品质，是公认的谷类蛋白中的优质植物蛋白。
按Osborne分类方法［2］，大米蛋白可粗分为4类：清蛋白（albumins），可溶解于水的蛋白质，占总量2%～5％；球蛋白（globulins），溶于0.5mol／L的NaCl溶液，占总量2%～10％；谷蛋白（glutelin），溶于稀酸或稀碱，占总量80％以上；醇溶蛋白（prolamins），溶于70%～80％乙醇溶液，占总量1%～5％。
其中谷蛋白和醇溶蛋白成为贮藏性蛋白，它们是大米蛋白的主要成分。
而清蛋白和球蛋白含量较低，是大米中的生理活性蛋白。
大米蛋白因赖氨酸含量较高、必需氨基酸含量与其他谷类蛋白中必须氨基酸含量比较具有一定优势和生物价（BV）及蛋白质效用比率（PER）较高而具有良好得营养价值。
1.2 大米蛋白的主要理化特性在大米贮藏性蛋白中，谷蛋白分子量较大，分子内和分子之间广泛存在的二硫键以及分子内存在的巯基，结构决定其不溶于中性盐溶液而只溶于稀酸、稀碱，大大限制了大米蛋白功能性开发。
抗氧化肽的研究进展
1.1抗氧化肽的研究进展生物体内具有许多蛋白质类抗氧化活性物质。
随着对蛋白酶解技术的深入研究，人们发现，介于蛋白质和氨基酸间的肽类，与其他生物分子如氨基酸、大分子蛋白质等相比较在食品方面安全性更高，且具有极强的活性和多样性，动植物蛋白水解所得的具有一定生理活性的功能性多肽及寡肽产品被广泛开发利用，如具有抑制血压升高的食品，及有特殊氨基酸组成的、可以作为患者营养补剂的寡肽等。
随着人们发现某些蛋白质具有清除生物体内过量的游离基，抑制脂质氧化的作用后，肽的抗氧化性的研究成为一大热点。
目前对以多种动植物蛋白为原料，制备高效、低毒的天然抗氧化肽的研究，已经取得的一定的成果。
1.1.1 抗氧化肽的种类人们对抗氧化肽研究的种类有很多，常见的有大豆肽、乳蛋白肽和肌肽，也有一些特殊的蛋白肽，如苜蓿叶蛋白肽等。
有些活性肽是直接提取的，也有通过蛋白水解方法获得的。
1.1大豆肽大豆肽是大豆蛋白水解得到的小肽Wendee Chiang 等采用酶膜反应器连续生产大豆多肽，由于及时分离了酶解生成的多肽，消除了产物反馈干扰，提高了酶解效率，并采用氧化稳定指数（OSI检测了大豆分离蛋白及其水解物的抗氧化活性，结果显示大豆分离蛋白酶解后抗氧化活性明显提高。
Hua- Mingchen 等采用 5 种蛋白酶对大豆 7S 球蛋白进行水解，采用硫酸氰铁法检测了不同水解产物的抗氧化活性，并采用G- 25 凝胶层析和反相高压液相色谱对水解产物进行分离、提纯，检测不同大豆多肽的抗氧化活性，得到了6 个抗氧化肽的氨基酸序列。
1.2乳蛋白肽乳蛋白肽是乳品深加工的理想产品，刘志东等研究乳清分离蛋白（WPI）酶解物对自由基的清除效果，并证明了木瓜蛋白酶酶解物和胰蛋白酶酶解物对 DPPH 自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除能力和还原能力强于胰凝乳蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物。
Sandrine G. Rival 等[1]研究了酪蛋白及酪蛋白水解肽的抗氧化活性，认为酪蛋白本身具有抗氧化活性，并不因脱磷酸作用和水解作用而失去这一活性，并使用酪蛋白及酪蛋白水解肽作为抗氧化剂进行研究。
抗氧化肽的研究进展讲解
• 发酵法与酶解法相比，能将微生物产酶和酶水解 工艺同时进行，降低了成本，且微生物产生的端 肽酶对肽末端具修饰作用，使制得的肽不但没有 苦味，还具有发酵的天然芳香味。 • 刘明等用固态发酵法制备出大豆抗氧化肽，具有 较强的还原能力，能清除羟自由基，抑制邻苯三 酚自氧化，并对脂质过氧化有一定的抑制能力。
• 谷胱甘肽主要是通过其巯基氧化- 还原态的转换， 作为可逆的供氢体，在细胞内的水相中起到抗氧 化保护作用。另外，谷胱甘肽还可以复活被活性 氧损伤的巯基酶和参与体内氧化还原过程，能与 过氧化物和自由基结合，抑制活性氧对巯基造成 损伤，保护细胞膜中含巯基的蛋白质，并阻止自 由基引起器官损伤和各种疾病。
抗氧化肽的研究进展
目录
抗氧化肽的种类及其制备方法
抗氧化肽的作用机理
体外抗氧化性检测方法
抗氧化多肽的发展前景及存在的问题
• 自1956 年英国科学家Harman 提出自由基理论以 来，随着研究的深入，人们对自由基过量而导致 的机体衰老以及对多种疾病的诱导作用有了更深 的认识。而高活性的抗氧化剂的摄入是清除体内 过量自由基的一个有效方法。 • 目前生产量最大的是化学抗氧化剂，但因明显的 毒副作用，导致其使用受到限制。随着人们对食 品安全和抗氧化剂安全要求的提高,人们开始把目 光转向天然抗氧化剂。
• 天然抗氧化肽是指生 物体内天然存在的抗 氧化性肽，主要有肌 肽和谷胱甘肽。肌肽 是典型的抗氧化活性 小肽，其抗氧化作用 主要表现在能清除自 由基、抑制脂质过氧 化反应以及提高机体 其他系统的抗氧化能 力。
• 谷胱甘肽(Glutathione，GSH)在谷胱甘肽还原酶 的作用下分解体内的脂质过氧化物，阻断活性氧 自由基对机体进一步损伤，是生物体内重要的活 性氧自由基清除剂。 • 人工合成抗氧化肽的途径主要有化学合成和酶法 合成。化学合成是以氨基酸或小肽为原料，用固 相液相合成法定向合成多肽。酶法合成主要是以 氨基酸和小肽为底物，在合成酶的催化作用下， 合成目的抗氧化肽。
大米蛋白活性肽制备关键技术研究
大米蛋白活性肽制备关键技术研究杨希【摘要】实验研究主要是以碎米糖化制糖以后剩下的下脚料米渣为生产原料,依照米渣的蛋白高温变性优势,充分利用超声波技术对米渣蛋白进行改性,通过超声作用来使紧致的蛋白质分子出现松散,进而利用多酶复合水解米渣蛋白的方式,控制水解条件,获得最优水解度.针对水解后的产物展开膜法分离,再依据活性肽的分子分布水平来截取出米渣蛋白的水解产物,然后对水解产品的理化特性和营养学价值进行评估,来设计出合适的产品配方,提高大米蛋白活性肽的市场应用价值.【期刊名称】《齐齐哈尔大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(034)002【总页数】5页(P59-63)【关键词】大米蛋白;活性肽;制备;关键技术【作者】杨希【作者单位】安徽粮食工程职业学院,合肥 230031【正文语种】中文【中图分类】TS210.91 大米蛋白活性肽的制备意义蛋白质是一种价值非常丰富的营养物质，但是蛋白质也是一种生物大分子，因此蛋白质还拥有能够改变食品蛋白质组成的功能。
所以，在我国生态植物学蛋白开发研究中，正在尝试着对蛋白质结构进行功能改性，目的是为了进一步拓宽植物蛋白的市场应用领域，伴随着酶制剂工业技术的飞速发展，拥有独特功能的多肽类食品正在快步进入到一个极速发展的新时代[1]。
我国是一个稻米粮食的生产大国，拥有着非常丰富的大米蛋白资源，而通过对大米蛋白展开研究以及技术开发，可以有利于对稻米的深层加工和综合利用，从而提高稻米的市场经济效益，同时还能够为我国的食品产业开发，为我国人民的营养保健提供出更多的蛋白质生产基料和蛋白补充剂，因此大米蛋白的深层加工拥有十分广阔的市场发展前景[2]。
本次研究的主要内容是关于大米蛋白活性肽的制备，属于对米渣进行利用的综合研究，可以让大米蛋白资源获得更加科学合理地开发和利用，同时也解决了我国食品工业及食品加工业当中的优质蛋白质的来源问题及需求问题，大大提升了谷物蛋白质在食品生产领域中的开发与应用水平，提升了大米蛋白的生物效能和价值，提高了大米蛋白的粮食附加值，可以使我国的稻米深加工技术的科技含量大幅度提升，从而促进大米蛋白粮食工业的快速发展，促进农村经济建设，并且增加农民的收入，这也是本文研究大米蛋白活性肽制备的重要现实意义所在。
活性肽构效关系的研究进展
2
活性肽的类别
生物活性肽分布广泛 , 多来源于动植物体。目前 生物活性肽尚无一致的分类方法。
按原料来源：海洋生物活性肽和陆地生物活性肽
按分泌部位：内源性生物活性肽和外源性生物活性肽 按功能：生理活性肽，如：血管紧缩素转化酶（ACE） 抑制肽，抗氧化肽、抗菌肽等；食品感官肽，如呈味 肽、表面活性肽、营养肽等
Suetsuna K 等的研究也表明抗氧化肽活性与肽链内氨基酸构 型有密切联系。Hernndez-Ledesma B等提出肽构象或肽键对混合 氨基酸的抗氧化活性既有拮抗作用又有协同效应。多肽的抗氧化 活性也与其分子量密切相关。多肽的分子量越小，则越容易透过 生物膜达到作用部位起效。
抗菌肽的构效关系 抗菌肽是一类对抗外界病原体感染的小分子多肽。抗菌肽的 来源广泛，有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和抗癌等多种活性；抗菌肽 不易导致耐药性，并且对生物体本身无害。根据抗菌肽结构和三 维构象的差异，可将抗菌肽分为 4 类：具有α -螺旋结构的线性肽、 含有二硫键的 β 折叠结构、由一种或多种氨基酸为主构成的多肽 以及具有环形结构的多肽等。 1. 空间结构与抗菌活性 α -螺旋结构是抗菌肽的主要结构特征，具有较高两亲性和稳 定螺旋的区域往往是其活性中心部位。亲水性和疏水性氨基酸侧 链分别排布在α -螺旋的两侧，形成明显的亲水面和疏水面，或者 分别集中在螺旋的N端或C端，形成明显的亲水端和疏水端。这种 两亲性结构有利于α -螺旋型抗菌肽与细胞膜的结合。螺旋结构受 氨基酸的影响,但迄今仍未有对抗菌肽螺旋度与抗菌活性相关性的 定量描述报道。
活性肽构效关系的研究 进展
目录
1 2
活性肽的定义 活性肽的类别 活性肽的制备方法 活性肽构效关系 活性肽分离纯化和分析检验检测技术
3 4 有不同生物活性的 产物。一般由几个到几十个氨基酸残基以酰胺键构成， 氨基酸排列顺序各异、结构多样。现代研究表明，活 性肽具有蛋白质及构成蛋白质的单一氨基酸所不具备 的生理功能。这些肽生物活性多样,包括抗菌、抗病毒、 抗肿瘤、抗氧化、心血管保护作用(抗高血压、抗动脉 粥样化和抗凝血)、免疫调节、镇痛、抗焦虑等作用。
酶水解米渣蛋白制备大米肽研究
中图分类号 ： Ｓ ０ ．＋ Ｔ ２１ １ ２
文献标识码 ： Ａ
文章编号 ： ０ ８ ９７ （０ ７ ０ —０２ 一Ｏ １０ － ５ ８２ ０ ）５ ０２ ２
１ 工 艺试 验 方 法 ． ３
生物活性肽是指有 特殊生理功能肽类。按 它们主 要来源 ，可分 为天然 存在 活性 肽和 蛋 白质水解 活性 肽。天然存在于生物体 内活性肽含量很低、 提取困难、 不能满足大量生产所 需， 故蛋 白质酶水解 生产活性 肽 研 究 已成为 当前热门课题“ 。大米蛋 白是 一种优质植 物蛋 白， 富含疏 水性氨 基酸 ， 生 产功能 性 活性 肽 理 是 想原料 。大米蛋 白经酶水 解后产生大米肽 ， 具有大 米 蛋 白所 不具备 良好溶解 性及易 吸 收、 降血压 、 抗氧 化 等多种生理功能 ， 可作 为食 品原料或辅料 应用于营 养 配方食品、 方便食 品、 速溶饮 品和调味 品等 。 吲 米渣是发 酵和淀 粉糖 工业下 脚料 。大米 经制 糖 后， 由于大量淀粉 已被利用 ， 中蛋 白质 得到浓缩 ， 其 蛋 白质含量高达 ４ ％￣６ ％， 由于米渣 主要含碱溶 性 ０ ０ 但 谷蛋 白， 限制其使用范 围¨ 。长期 以来 ， 大量 米渣主要 用作饲料 ， 质蛋 白资源未能得到 充分利用 ； 优 因此 ， 利 用大米渣酶水解生产大米肽具有 良好经济效益和社会 效益。 陈季旺、 顿新鹏等曾分别 以大米和米渣酶法制备 大米肽进行一些研 究¨ ； 但有关这方面报道还不 多。 本研究 米渣蛋 白酶水解工艺 ， 旨在为进 一步开发 富含大米肽高附加值产品做一些基 础工作 。 １材料与方法
１４ 分 析 检 味 全食 品有 限公 司 （ 武汉 味精 厂） 含水量 ６ ．％， ； ２ Ｏ 干基 蛋 白质 含量 ５ ．％、 ６ ３ 总糖含量
大米蛋白综合利用研究进展
大米蛋白综合利用研究进展大米蛋白是由大米中提取出来的蛋白质，其主要成分为蛋白质、脂肪、碳水化合物和无机盐等。
随着人们对健康饮食的追求以及对食品安全和营养价值的重视，大米蛋白的综合利用研究也逐渐成为学术界和工业界的关注焦点。
大米蛋白的综合利用主要包括利用大米蛋白制备功能性食品、生物活性肽的研究、大米蛋白的酶解和酶促反应等。
一、大米蛋白的功能性食品研究大米蛋白可以通过一系列的物理、化学和生物方法进行改性，从而赋予其不同的功能性。
通过高温处理、酶解或酸解，可以制备出具有良好温度稳定性、胶凝性和乳化稳定性的大米蛋白酸性、中性或碱性凝胶。
这些凝胶可以应用于食品加工过程中，如作为凝胶剂、稳定剂和乳化剂等使用。
大米蛋白还可以通过交联、酯化或酸酶方法改性，制备出具有保湿性、抗氧化性、抗菌性和抗糖化性等功能的大米蛋白，用于化妆品、保健品和药物等领域。
二、大米蛋白生物活性肽的研究大米蛋白酶解产生的生物活性肽具有多种生理功能，如抗氧化、抗菌、抗炎和降血压等。
研究表明，大米蛋白酶解产生的肽段具有较强的抗氧化活性，可以对抗自由基的损伤，减少氧化应激反应。
大米蛋白酶解产生的肽还具有一定的抗菌活性，可以对抗多种细菌的生长和繁殖。
近年来，随着对功能性食品需求的增加，大米蛋白酶解产生的生物活性肽在食品行业的应用逐渐受到关注。
三、大米蛋白的酶解和酶促反应大米蛋白的酶解是将大米蛋白通过外源或内源酶的作用分解为较小的肽段或氨基酸残基的过程。
酶解的方法主要包括物理酶解、化学酶解和生物酶解等。
物理酶解是利用高压、高温、超声波或微波等方法破坏蛋白质的结构，从而使其易于被酶解。
化学酶解则是利用化学试剂如酸、碱、胰蛋白酶等对蛋白质进行酶解。
生物酶解则是利用微生物产生的酶对蛋白质进行酶解。
酶解可以提高大米蛋白的可溶性和消化性，提高其生物利用率和功能性。
大米蛋白的综合利用研究在食品科学、生物技术和营养学等领域有着广泛的应用前景。
随着人们对于健康食品的需求不断增加，大米蛋白的功能性和生物活性肽的利用将会得到更加广泛的关注和应用。
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酶法制备大米活性肽及抗氧化性的研究
摘要以水解液中活性多肽的得率为目标,分别采用5种蛋白酶对大米蛋白进行水解,得出最佳水解酶。
水解大米蛋白然后脱盐处理,用铁氰化钾测定了大米多肽的还原能力,并考查了大米多肽对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(O2-·)、二苯代苦味肼酰基自由基(DPPH·)的抑制作用,并同VC做了比较。
结果表明:大米蛋白制备活性肽的最佳水解工具酶为枯草杆菌碱性蛋白酶。
大米多肽具有还原能力,并对这几种自由基体系具有不同的清除作用。
在20.00～50.00 mg/mL时,大米多肽和VC对·OH的清除作用相当;大米多肽对O2-·的清除作用随浓度的增加而增强;在 5.00 mg/mL时,大米多肽对DPPH·的清除率达到57.69%,但对O2-·和DPPH·的清除能力均低于VC。
关键词大米多肽;碱性蛋白酶;抗氧化
StudyontheEnzymaticPreparationofRiceAntioxidantPeptides
SHEN Yan-haoLIU Fang*
(College of Food Science and Engineering,Central South University of Forestry and Technology,Changsha Hunan 410004)
AbstractRice protein were hydrolyzed by five protease respectively,with the indexes of yield and reducing power of peptides in hydrolyzate. The results showed that the optimum enzyme was Bacillus subitilis alkali protease. The deoxidizing capability of rice peptide was evaluated by using K3(Fe(CN)6)test.The antioxidant activity of rice peptide was studied through the systems of hydroxyl radical(·OH),superoxide radical(O2-·)andDPPH·,compared with those of VC.The results show that the rice peptide had different scavenging effects on these radical systems. At a concentration of 20.00～50.00 mg/mL,the scavenging capability of the rice peptide for hydroxyl radical was similar to that of VC,but for DPPH·and O2-·were lower than those of VC. The scavenging effect of rice peptide to O2-· has increased with the increase of concentration. At 5.00 mg/mL,the scavenging rate of the rice peptide for DPPH·was 57.69%.
Key wordsrice peptides;alkali protease;antioxidation
我国是稻谷生产大国,年产稻谷1.8亿t以上,具有丰富的大米蛋白资源。
大米中赖氨酸含量高,并具有良好的氨基酸组成配比,消化率高,营养价值高[1],是一种优良的植物蛋白。
近年来,人们研究发现,一些蛋白质在水解后产生的肽类具有比
其本身更强的生理活性。
目前,大米蛋白酶解制备的活性肽,国外研究比较多,并已经应用到各种食品中,而我国只是初具端倪,还有待发展[2]。
对大米抗氧化肽活性肽研究,还只停留在实验室阶段,虽已经证实其抗氧化性,但是到规模化的生产还有距离。
由于大米蛋白的低过敏性的优点,它已经受到研究者的关注。
人体自由基应处于平衡中,如果自由基过多或者清除过少,就会对组织产生伤害[3]。
因此,寻找高效、低毒抗氧化剂也一直是研究者的目标。
本试验通过5种酶水解大米蛋白,确定最佳水解酶,并用多种化学模型,对大米多肽的抗氧化活性进行了研究。
1材料与方法
1.1试验材料
供试大米蛋白购于湖南长沙昕晟食品有限责任公司。
试剂为:标准多肽(Sigma公司);枯草杆菌碱性蛋白酶(以下简称碱性蛋白酶),米曲霉中性蛋白酶(以下简称中性蛋白酶),米曲霉酸性蛋白酶(以下简称酸性蛋白酶)(北京东华强盛生物技术有限公司);复合酶(实验室自行配制);胰蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司);二苯代苦味肼酰基自由(Sigma公司);大孔树脂DA201-C(安徽三星树脂科技有限公司);维生素C(山西云鹏制药有限公司);其他所有试剂均为国产分析纯。
主要仪器为:电热恒温水浴锅(DSY-2-8)(浙江余姚工业仪表三厂);台式离心机(TDL-5)(上海安亭科学仪器厂);酸度计(pHS-3C)(上海虹益仪器仪表有限公司);真空冷冻干燥机(广东韶关科力实验仪器有限公司);可见分光光度计(722S)(上海精密科学仪器有限公司)。
1.2 试验方法
1.2.1大米多肽的制备。
大米蛋白悬浮液→调节pH值→按各种酶最适条件进行酶解→85 ℃、10 min灭酶→4 000 r/min离心→大米活性肽粗提液→上清液旋转蒸发、冷冻干燥→大米多肽粗品。
各类酶的水解条件分别为:碱性蛋白酶pH值9.0,55 ℃;中性蛋白酶pH值7.0,40 ℃;酸性蛋白酶pH值3.5,40 ℃;胰蛋白酶pH 值8.0,25 ℃;复合蛋白酶碱性蛋白酶pH值9.0、中性蛋白酶pH值7.0,42 ℃,酶用量均为60 U/mL。
1.2.2多肽标准曲线的绘制。
取10个10 mL的容量瓶,用5%的TCA依次配制0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液,然后分别取6.0 mL标准溶液,加入4.0 mL双缩脲试剂,于漩涡混合仪上混合均匀,静置10 min,2 000 r/min离心10 min,取上层清液,用1 cm光径比色皿,于540 nm下测定OD值(以第1管作空白对照)。
以肽的浓度为横坐标x(mg/mL),OD值为纵坐标y,制作标准曲线(图1)。
1.2.3酶解液中活性肽含量的测定。
取2.5 mL酶解液,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸(TCA)水溶液,于漩涡混合仪上混合均匀,静置10min,然后在4 000r/min下离心15 min,将上清液全部转移到50 mL容量瓶中,并用5%的TCA定容至刻度,摇匀。
然后取6.0 mL上述溶液置另一试管中,加入双缩脲试剂4.9 mL(样液∶双缩脲试剂=3∶2,V/V),于漩涡混合仪上混合均匀,静置30 min显色,取上清液540 nm
下测定OD值,对照标准曲线的样品溶液中的多肽浓度C(mg/mL),进而可求得样品中多肽含量。