玻璃化冷冻
精率较高，胚胎发育良好。
达到的主要技术和指标：
玻璃化冷冻卵裂期胚胎、囊胚已全面应用 于临床
卵子冷冻已开展并应用于临床
已总结成文一篇，已发表
另两篇文章总结中，待发表
请提宝贵意见
目前7例病人进行了卵子冷冻保存，共冷冻卵子72
个。解冻卵子两例，共19个卵子，存活率89.5%，
ICSI正常受精率64.7%，临床妊娠率100%。
比较玻璃化冷冻与程序化冷冻对胚胎发育潜 能及临床结局的影响
回顾性分析2009年1月～2011年12月实施胚胎冷冻复苏的 590个周期，其中程序化冷冻复苏周期133例 ，玻璃化冷冻
我们的研究表明应用玻璃化冷冻卵子可获得高的 存活率，ICSI受精后获得高的卵裂率，而且胚胎
发育良好，并最终获得临床妊娠成功。
本研究为人卵母细胞低温贮藏的临床应用提供了 一种可靠方法。
主要创新点：
建立本中心卵裂期胚胎和囊胚的玻璃化冷 冻及解冻技术体系
玻璃化冷冻采用高浓度的细胞内冷冻保护 剂，提高了卵母细胞冷冻存活率，ICSI受
程序化冷冻 玻璃化冷冻
研究目的：
研究玻璃化冷冻对原核期、卵裂期和囊胚 期人类胚胎冷冻后存活率、种植率和临床 妊娠率的影响 与慢速冷冻进行比较，寻找最适合人类胚 胎冷冻的方法和阶段
研究方法：
进入体外培养-胚胎移植治疗周期病人所获 得的正常胚胎，分别进行玻璃化冷冻和慢 速冷冻
第一天
注：*表示两组差异显著，P<0.05
研究结果：
玻璃化冷冻胚胎复苏率、完胚率、临床妊娠率均高 于程序化冷冻。
玻璃化冷冻法适用于人类胚胎的保存，包括卵裂期 胚胎和囊胚期胚胎均可以得到同样理想的效果和临 床结局。
将玻璃化冷冻技术全面应用到临床，可以提高胚胎 冷冻后的存活率和临床妊娠率。
研究结果：
复苏卵裂期胚胎398例，复苏囊胚期胚胎59例。
玻璃化法和程序化法冷冻人胚胎发育潜能及临床结 局的比较
指标 周期数 程序化冷冻 133 玻璃化冷冻 457
解冻数
年龄 复苏率 完胚率 平均移植个数 周期取消率 临床妊娠率 种植率 流产率
注：*表示两组差异显著，P<0.05
523
30.5±4.2 77.2(404/523) 44.3(179/404) 2.5±0.6 2.3(3/133) 36.2(47/130) 21.1(70/331) 27.7(13/47)
第二天
第三天
第四天
第五天
冷冻胚胎移植
内膜准备
自然周期
人工周期
胚胎复苏
解冻复苏的胚胎在37℃、6% CO2 培养箱中培
养2h 后优选1～2个胚胎移植。
胚胎存活:
显微镜下观察：存活卵裂球>50％为胚胎存活
冷冻前
复苏后
临床妊娠率
移植后20天B超检查，有孕囊者为临床妊娠
研究内容：
1148
30.2±4.1
94.4(1084/1148)
﹡
73.7(799/1084)﹡ 2.2±0.5﹡ 1.3(6/457) 50.8(229/451) 16.6(38/229)
﹡
30.2(302/1000)﹡
玻璃化法冷冻人卵裂期胚胎和囊胚发育潜能及临 床结局的比较
指标 周期数 解冻数 年龄 复苏率 周期取消率 临床妊娠率 种植率 流产率 卵裂期胚胎 398 1007 30.2±4.1 94.2(949/1007) 1.5(6/398) 51.8(203/392) 30.5(273/623) 15.8(32/203) 囊胚期胚胎 59 141 30.0±4.0 95.7(135/141) 0(0/59) 44.1(26/59) 27.9(29/104) 23.1(6/26)
人卵子、胚胎玻璃化冷冻 技术的研究及临床应用
汇报内容：
1、研究背景
2、研究方法
3、研究内容
4、研究结果
5、主要创新点
研究背景：
胚胎冷冻保存是辅助生殖领域中不可缺少 的重要部分 胚胎冷冻技术的作用
提高单次取卵的累积妊娠率
减少了多胎妊娠 防止OHSS的发生
研究背景：
冷冻技术的方法
比较玻璃化冷冻与程序化冷冻各阶段胚胎
的存活率，种植率和临床妊娠率
比较同种冷冻方法不同冷冻阶段的胚胎存
活率、种植率和临床妊娠率
玻璃化冷冻的临床应用
从09年11月开始陆续进行开展玻璃化冷冻的临床应
用，2010年5月起胚胎保存全部实施玻璃化冷冻，
到目前为止，共实施玻璃化冷冻948例，进行复苏 周期877例，解冻胚胎2134个，存活率94.1%。临床 妊娠率53.0%，流产率13.6%。
玻璃化冷冻度
玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。
各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。
人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。
玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。
解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。
C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。
比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。
冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。
这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。
玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。
冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。
玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。
玻璃化深低温冷冻保存气管的实验研究的开题报告
玻璃化深低温冷冻保存气管的实验研究的开题报告
一、选题背景
气管疾病是临床常见疾病之一，在治疗过程中需要进行气管切除手术。
而切除术后的气管需要进行保存，以备后续移植使用。
传统的保存方法往往会对气管组织的质
量造成影响，因此需要研究更优异的保存方法。
二、研究目的
本研究旨在探索玻璃化深低温冷冻保存气管的方法，并评估保存后气管的生物学特性，为气管切除手术后的保存提供新的方法。
三、研究意义
当前气管保存方法一般采用传统的液氮冷冻，会对气管组织造成一定程度的损伤。
而本研究提出的玻璃化深低温冷冻保存方法能够有效地降低保存过程中冷冻所致的冻
结损伤，且保存后的气管在生物学特性上表现良好，可为气管切除手术后的保存提供
更优异的方法。
四、研究内容和步骤
1. 采集人或动物气管组织，对气管进行体外冷冻。
2. 将气管组织分为两组，一组进行传统液氮低温冷冻保存，另一组进行玻璃化深低温冷冻保存。
3. 评估两组保存后的气管组织的组织学结构、生化特性等指标，并进行对比分析。
五、预期结果
本研究预期将比较玻璃化深低温保存气管和传统方法保存气管的差异，验证玻璃化深低温保存气管的可靠性，并探索不同保存方法对气管组织的影响，为气管切除后
的保存提供参考。
六、研究难点
本研究难点主要在于探索出一种对气管组织影响较小的保存方法，并在保存后对气管组织的生物学特性进行全面的评估和对比分析。
胚胎玻璃化冷冻技术治疗不孕症1例
于 ２１ ０ ０年 ９月来南 昌大 学 第一 附属 医 院辅 助 生殖 科 就诊 。患者 平 素 月 经 规 律 ， 生 活 正 常 ； 夫 ３ 性 丈 １
以备 移植 ］ 于 ２ １ ， ０ １年 １月 １ ６日行 第 ２次 胚 胎 移
植。
岁， 精液 检查 多次 提示 无 精 子 ， 睾 丸 穿刺 检 查 示 ： 行
３ 讨 论
玻 璃化 冷冻 技术是 一种 快速 冷冻 细胞或 组织 的 方法 ， 可避 免冻融 过程 中细胞 内冰晶 的形 成 ， 最大 限
亚砜 、． 乙 二 醇 、 ２ ｇ・Ｌ １ 白蛋 白） ， 置 ７５ １ －人 中 放 ５ｍｉ， 察胚胎 一次 皱缩 至扩 张 的过程 。然 后移 至 ｎ观
０ ０ Ｌ １ ． １ｇ・ － 庆大 霉 素 、 ５ 二 甲基 亚 砜 、 ５ 乙二 １ １ 醇 、２ｇ・ 人 白蛋 白、 ． １ Ｌ ０ ６ｍｍｏ 蔗糖 ） ， ９ ｌ 中 在 ０Ｓ 内移至半 封 闭式麦 管 中 ， 即放入 液氮 中保存 。 立
该 患 者 新 鲜 周 期 移 植 后 未 获 得 临 床 妊 娠 ， 求 要
右 附睾 活动 精 子 ０ １ ＨＰ 活 力 ｂ ～ ／ ， —Ｃ级 。夫 妇 双 方要 求行 “ 管婴儿 ” 试 助孕 治疗 。本 病例选 择及 发表 经 医院伦 理委 员会许 可 ， 签署 了患 者知 情 同意书 。 并
１ ２ 方 法 ．
玻璃化在食品加工中的应用
玻璃化在食品加工中的应用1. 玻璃化技术简介玻璃化是将物料在高温下加热至熔点以上并迅速冷却，以产生具有玻璃状态特征的过程。
这种技术经常用于食品加工上，可改善食品的保质期、口感、颜色、味道等方面。
2. 玻璃化在冷藏冷冻食品中的应用冷藏冷冻食品的保质期较短，使用玻璃化可以将食品中的水分迅速冷凝成微小颗粒，使得其不能转化为冰晶，从而避免食品冻结所带来的负面效应。
使用这种技术可以延长冷藏冷冻食品的保质期并保持其质量。
3. 玻璃化在干果和坚果中的应用干果和坚果中含有许多油脂，而油脂在加热后容易氧化并变质。
使用玻璃化技术可以将水分和油脂分离，从而避免松脆度下降和口感变质。
这种技术能够使得干果和坚果保持其优质口感并延长其保质期。
4. 玻璃化在肉类和海鲜中的应用肉类和海鲜中含有大量水分，容易导致营养成分流失，并且容易腐败。
使用玻璃化技术可以将水分转化为微小颗粒，避免水分的流失和导致腐败。
同时，这种技术还可以改善食品的口感和质地，使得食品更加美味。
5. 玻璃化在糕点和糖果中的应用糕点和糖果中往往含有大量的糖分，这些糖分容易受潮而导致粘连。
使用玻璃化技术可以将水分转化为微小颗粒，避免糖分的潮湿和降低其黏性。
同时，这种技术还可以改善糕点和糖果的外观和口感，使其更加美味。
6. 总结玻璃化技术在食品加工中具有重要的应用价值。
通过玻璃化技术，可以改善食品的口感、质感、颜色和保质期等方面，从而提高食品的品质和市场竞争力。
未来，玻璃化技术将进一步推广和应用于食品加工行业，为消费者提供更加高品质的食品。
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法
卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。
安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。
*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。
注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。
（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。
（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。
（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。
（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。
放进37℃的培养箱中完成恢复。
注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。
质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。
成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。
新技术玻璃化冷冻
3
➢具体实施案
• 需要特定的冷冻保存剂以及载杆 • 操作者经过相应的培训
4
➢国内外应用情况
• 目前国内外较大的生殖中心均有开展 • 北京地区已有多家生殖中心开展该项目，包括协和医院
、北医三院、301医院等
5
适应证、禁忌证 及不良反应
7
禁忌证及不良反应
在低温保存过程中，剧烈的温度和物理变化容易造成细胞 的损伤和死亡
8
技术路线
9
胚胎冷冻
冷冻保护剂的配制 胚胎在冷冻保护剂中依次转移，进行脱水 将胚胎置于载杆上，快速浸入液氮
10
胚胎解冻
解冻保护剂的配制 将冷冻载杆从外套管中取出，将其前端（装有胚胎）浸于T1
液中，在显微镜下寻找胚胎，胚胎依次转入T2 –T4中 挪入事先准备好的培养滴内清洗后移入培养滴内 行辅助孵化后培养至移植
• 费用两种方法相当，玻璃化的载杆和保护剂成本稍高于程序化冷冻
13
新技术申请-胚胎玻璃化冷冻
开展玻璃化冷冻的目的、 意义和实施方案
2
➢开展玻璃化冷冻的目的、意义
玻璃化冷冻是目前普遍采用的冷冻方法 此方法避免了细胞外冰晶形成引起的理化损伤和细胞内形成的冰
晶对细胞的机械性损伤，维持了细胞内正常的超微结构 提高冷冻速率，可达到20000 -100000°C/min，使细胞迅速度过
11
与传统程序化冷冻法 的比较
12
➢风险、疗效、费用、及疗程的比较
• 传统的程序化冷冻需要复杂的冷冻仪，价格昂贵，并且所需冷冻时间比 较长
• 玻璃化冷冻不需要昂贵的程序化降温仪，冷冻时间大大缩短，并且复苏 率普遍高于程序化冷冻法
玻璃化冷冻技术名词解释
玻璃化冷冻技术名词解释
玻璃化冷冻技术是一种用于将食物或其他物品冷冻保存的技术。
它涉及将食物或物品迅速冷冻到极低的温度，以使其成为类似玻璃状的状态，从而防止冰晶的形成和物品的结晶化。
这种技术可以延长食物的保质期，并且可以在冷冻后保持食物原有的质地、口感和营养成分。
玻璃化冷冻技术的原理是在极低温下将物品迅速冷冻，使得其水分在冷冻过程中成为非晶态状态，而不是结晶状态。
这样可以避免冰晶的形成，从而减少对食物细胞结构的破坏，同时也减少了食物在解冻后的水分流失。
此外，玻璃化冷冻技术还可以应用于生物样品的保存和冷冻。
例如，利用这种技术可以有效冷冻保存细胞、组织和生物样品，以便后续的实验和研究。
这种冷冻技术在生物医学研究和医学应用领域具有重要的意义。
试管婴儿人类配子胚胎与性腺常见的冷冻方法
试管婴儿人类配子胚胎与性腺常见的冷冻方法在辅助生育技术中，最常见的是程序化慢速冷冻法，其次是玻璃化冷冻，较少用的是超快速冷冻，后两者都属于快速冷冻的范畴。
冷冻技术在不同的IVF中心有或多或少的变化，但不同的方法都可获得较好的结局。
这表明冷冻标本可以耐受一定的外界变化，只要这种变化是在细胞可以承受的范围，则细胞可以存活，发育潜能可以维持。
(一)程序化慢速冷冻法通常在程序化慢冷的液体中，各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂，于室温下，在低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡，然后放置在终浓度的冷冻液中。
在冷冻仪(图13–2)内于预设的程序下降温标本，经过冷冻保护剂的处理后，胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。
由于细胞自身的特性，它在细胞内外电解质平衡时，胞内液冰点比胞外低。
程序冷冻仪图13–1程序冷冻仪图13–2在室温到植冰点之间降温，往往冰晶还未来得及形成，但此期可以发生温度休克。
温度休克al shock)是指某些细胞在降温过快时受到损伤，甚至在冷冻过程中被破坏的一种表现。
其特点是与温度变化速率有关，常发生在15℃一一5℃降温过程之间。
这可能是由于细胞膜脂类的相变，膜受损后渗透率改变；或在不同的热收缩应激反应时，细胞膜结构的断裂引起的。
卵磷脂被认为有保护作用。
冷冻液通常在达到诸如一15℃的温度而冰晶尚未形成，即处于超冷状态。
为了避免过冷状态的发展，使每一个溶液在一个特定的温度时开始冻结，使细胞脱水逐步顺利地进行，及为了控制过冷生物样品中过度大冰晶的形成作用，可通过两种方法来诱发结晶：一是向液体中加入微量冰晶，较少采。
二是较常用的植冰(seeding)：用预冷至一70℃，或更低温度的金属棒在标本溶液冰点以下2–3℃时，瞬间地接触样品容器，可以带走大量水在液相转化为固相的潜伏热，这样可以激发和协助溶液中许多小冰晶的形成。
辅助生殖中常采用的植冰温度是一6℃一– 8℃。
目前，人工植冰比冷冻仪自动植冰可靠，用冷冻过的金属镊接触的部位应避免标本刚好所在位置，以免将样品迅速降温至细胞内冰晶形成而致死，一旦看到细胞外溶液中有一个白点样的小冰晶出现，提示溶液中已有大量冰核形成，即应立刻移开金属镊，将冷冻管放回冷冻仪，数秒钟后如再次拿出冷冻管观察，则标本溶液呈白色云雾状，提示溶液中已有大量小冰品形成，提示植冰成功。
玻璃化冷冻法
玻璃化冷冻法
基本原理是将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下凝固，形成不规则
的玻璃化样固体，保存了液态时正常分子和离子分布，因而在细胞内发生
玻璃化时能起到保护作用。
所保存细胞在冷冻保护液中脱水到一定程度后，则引起内源性胞质大分子如蛋白质及渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，从而
使细胞在剧烈的快速降温中得到保护。
人类的配子和胚胎的冷冻保存已经是人工生殖领域中一个必要的部分。
在过去这二十年中，冷冻保存技术的发展亦可反映人工生殖技术的发展程度，现在的冷冻技术已可用在冷冻保存精子、卵子和不同时期的胚胎，尤
其是玻璃化冷冻技术(Vitrification)，其不仅已获得医学界广泛的认可，并渐渐取代传统慢术冷冻法，而成为冷冻技术的最佳选择，甚而将此技术
运用在高难度的卵子、卵巢组织和人类胚胎干细胞的冷冻上。
有别於慢速冷冻法在降温的冷冻过程中会形成冰晶，进而造成胚胎的
伤害，玻璃化冷冻技术的特色就是使细胞本身及冷冻溶液在冷冻时，呈现
黏稠而不产生结晶的玻璃化状态，利用这种不结冰的原理以改善慢速冷冻
之缺点。
换言之，胚胎的冷冻保存与解冻的成败与否，不单是胚胎品质的
好坏，同时必须靠冷冻保存中有无一个完全无结冰生成的冷冻过程。
而玻
璃化冷冻其高浓度冷冻保护剂和细胞间经一定时间平衡後，细胞体积可因
脱水而减少30-50%，然後将之置入冷冻器材，再直接投入液态氮中使细胞
瞬间玻璃化，在无冰晶形成下保存，以减少细胞内结冰造成伤害。
玻璃化冷冻操作说明
玻璃化冷冻操作说明
1、冷冻载架和载杆做好标记
2、试剂从冰箱内拿出后室温平衡半小时使用。
3、用移液枪加70-100ul BS、ES、VS液体各一滴。
4、吸胚胎与BS中轻轻洗涤3-5次，转移到ES中。
5、胚胎在ES中1-2分钟，让胚胎自由沉到液滴底部。
6、轻轻转移胚胎的位置2次。
7、胚胎在ES中5分钟后，吸胚胎到VS中。
8、胚胎在VS中15-20秒后，吸胚胎轻轻吹吸5次左右，
轻轻的将胚胎放在载杆上，至于液氮中，从胚胎置于
VS的时间到置于液氮中，时间控制在1分钟左右，不超过1分半钟。
玻璃化解冻操作说明
1、解冻1液置于37培养箱中平衡30分钟，解冻
2、
3、4
液室温平衡30分钟。
2、找到解冻胚胎的载杆，甩一下液氮，轻轻但迅速的置于
解冻1液中1分钟。
3、胚胎在解冻2液中3分钟，中间不需要移动胚胎。
4、胚胎在解冻3液中3分钟，中间不需要移动胚胎。
5、胚胎在解冻4也中6分钟，中间轻轻转换位置3次。
6、将胚胎轻轻转移到培养液中。