玻璃化冷冻法
冷冻保存动植物的方法
保存效果：冷冻保存的胚胎或干细胞在解冻后仍能保持其生物活性和功能
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冷冻保存的挑战和前景
冷冻保存中的挑战
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冰晶形成：冷冻过程中，冰晶可能会形成，破坏细胞结构，影响其存活率和功能
细胞损伤：冷冻过程中，细胞可能会受到损伤，影响其存活率和功能
温度控制：冷冻过程中，温度控制非常重要，过高或过低的温度都可能影响细胞的存活率和功能
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冷冻保存的步骤
样品准备和处理
干燥样品：使用适当的方法将样品干燥，防止水分影响冷冻效果
消毒样品：使用适当的消毒剂进行消毒，防止微生物污染
清洗样品：去除表面的灰尘、污垢和微生物
选择合适的样品：新鲜、无污染、无破损
冷冻保护剂的选择和使用
选择合适的冷冻保护剂，如DMSO、甘油等
确定冷冻保护剂的浓度，一般为5%-10%
未来研究方向和前景
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降低冷冻保存成本：研究低成本的冷冻保存技术和方法，降低冷冻保存的成本。
提高冷冻保存效率：研究新的冷冻技术和方法，提高冷冻保存的效率和成功率。
提高冷冻保存质量：研究新的冷冻保存技术和方法，提高冷冻保存的质量和保存时间。
探索新的冷冻保存应用领域：研究冷冻保存技术在其他领域的应用，如生物医学、食品加工等。
优点：保存效果好，复苏率高，适用于各种生物组织。
操作步骤：将生物组织放入冷冻保护剂中，然后迅速投入液氮中，使温度迅速降低至零下100摄氏度以下。
注意事项：操作过程中要避免生物组织受到物理损伤，同时要保证冷冻保护剂的浓度和成分合适。
玻璃化冷冻法
原理：通过快速降温，使细胞内的水分子形成玻璃化率：低温下生物代谢速率降低，减少能量消耗
4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化保存效果
㊀㊀基金项目:广东省珠海市医学科研基金资助项目(20191208A010071)作者单位:519100㊀遵义医科大学第五附属(珠海)医院烧伤整形手外科通信作者:陈世玖,电子信箱:csj6916@4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化保存效果李㊀智㊀戴依娜㊀王㊀成㊀陈世玖摘㊀要㊀目的㊀评估二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)㊁甘油㊁丙二醇㊁乙二醇玻璃化法保存人指固有神经中的保护效果,筛选合适的人指固有神经冷冻保护剂㊂方法㊀取截肢手术后患者放弃肢体的指固有神经,分为实验组(30%DMSO 组㊁甘油组㊁乙二醇组㊁丙二醇组)和空白对照组进行玻璃化法于液氮(-196ħ)中保存3周㊂复温后进行光学显微镜观察㊁共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测㊁指固有神经片段的神经生长因子(nerve growth factor,NGF)检测㊂结果㊀光镜观察:空白对照组神经鞘膜结构模糊,神经纤维排列疏松㊁紊乱;实验组神经鞘膜较为完整,神经纤维排列相对整齐㊁紧凑㊂LSCM 结果:采用钙黄绿素-AM (calcein -AM)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色后空白对照组神经纤维绿色荧光强度较弱,红色荧光强度较强㊂实验组绿色荧光较空白对照组均增强,红色荧光强度均减弱㊂ELISA 检测结果:空白对照组12.95ʃ3.03pg /ml㊁乙二醇112.64ʃ3.54pg /ml㊁30%DMSO109.51ʃ9.98pg /ml㊁甘油61.47ʃ3.34pg /ml㊁丙二醇62.53ʃ3.64pg /ml㊂结论4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化法保存均有保护作用,其中乙二醇效果最佳,更适合用于人指固有神经玻璃化保存㊂关键词㊀冷冻保护剂㊀人指固有神经㊀周围神经损伤㊀玻璃化保存中图分类号㊀R658㊀㊀㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀㊀㊀DOI ㊀10.11969/j.issn.1673-548X.2022.07.023Experimental Study on Cryopreservation of Human Proper Digital Nerve by Vitrification with Four Cryoprotective Agents Abstract.LI zhi ,DAI Yina ,WANG Cheng ,et al.Department of Plastic and Hand Surgery ,The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University ,Zhu-hai ,Guangdong 519100,ChinaAbstract ㊀Objective ㊀To evaluate the protective effect of dimethyl sulfoxide (DMSO),glycerol,propylene glycol and ethylene gly-col vitrification in the preservation of human finger proper nerve,and to screen a suitable cryoprotective agent for human finger proper nerve.Methods ㊀The proper digital nerves of the limbs abandoned after amputation were divided into experimetal group (30%DMSO group,glycerol group,ethylene glycol group,propylene glycol group)and blank control group.They were vitrified and stored in liquid ni-trogen (-196ħ)for 3weeks.After rewarming,optical microscope observation,confocal microscope (LSCM )detection and nerve growth factor (NGF)detection of finger intrinsic nerve segments were carried out.Results ㊀Light microscope observation:in the blank control group,the structure of nerve sheath was fuzzy,and the arrangement of nerve fibers was loose and disordered;the nerve sheath in the experimental group was relatively complete,and the nerve fibers were arranged relatively orderly and compact.LSCM results:After calcein AM /PI double staining,the green fluorescence intensity of nerve fibers in the blank control group was weak and the red fluores-cence intensity was strong;the green fluorescence of the experimental group was stronger than that of the blank control group,and the red fluorescence intensity was weaker.ELISA results:In blank control group,the results were 12.95ʃ3.03pg /ml,ethylene glycol 112.64ʃ3.54pg /ml,30%DMSO 109.51ʃ9.98pg /ml,glycerol 61.47ʃ3.34pg /ml,propylene glycol 62.53ʃ3.64pg /ml.Conclusion ㊀The four cryoprotectants have protective effects on the vitrification preservation of human finger proper nerve,and ethylene glycol is the best,which is more suitable for the vitrification preservation of human finger proper nerve.Key words ㊀Cryoprotective agents;Human proper digital nerve;Peripheral nerve injury;Vitreous preservation㊀㊀全球急性手外伤发生率为0.15ɢ~3.15ɢ,手部神经损伤将导致神经传导中断,会导致肌肉萎缩失去功能㊁感觉功能障碍,造成手部功能丧失,严重影响患者生活质量[1]㊂修复手部损伤神经㊁重建手部神经功能意义重大㊂同种异体神经移植是理想的治疗方案㊂本研究以患者放弃肢体的指固有神经作为研究对象,旨在评估甘油㊁二甲基亚砜㊁乙二醇㊁丙二醇4种冷冻保护剂(cryoprotective agents,CAPs)的玻璃化保存效果,为人指固有神经玻璃化法保存提供一定的理论依据㊂对象与方法1.标本来源及处理:取在遵义医科大学第五附属㊃501㊃(珠海)医院因外伤行截肢手术后患者放弃的肢体(共6例上肢,腕部水平离断1例,前臂离断3例,上臂离断1例,肩部离断1例),患者无高血压㊁糖尿病及周围血管神经病变㊂肢体置于无菌操作台,剥离指固有神经至远端指间关节,剪成长度为1cm 的神经片段,共75个片段,随机分为5组(4个实验组分别为30%DMSO 组㊁甘油组㊁乙二醇组㊁丙二醇组和1个空白对照组)㊂2.玻璃化保存:以胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)㊁RPMI1640培养液㊁各组对应种类CAPs,按体积比为1ʒ6ʒ3配置玻璃化冻存液㊂处理分组后的神经片段分别放入装有4ħ预冷的对应组的冷冻保护剂的冻存管中,在4ħ中平衡30min,-20ħ平衡2h,于-80ħ冰箱过夜后投入液氮罐内深低温保存3周㊂3周后取出,直接放入40ħ的水浴中快速复温,复温后加入含有0.5mol /L 的蔗糖溶液中,洗脱10min,0.25mol /L 蔗糖溶液,再次洗脱10min㊂3.HE 染色光学显微镜观察:每组取出5个标本,各截取0.5cm 进行常规脱水固定㊁石蜡包埋㊁切片㊂按试HE 染色剂盒(美国博士德生物公司)说明书进行染色操作,在400倍光学显微镜(日本Olympus 公司)下观察神经组织结构㊂4.玻璃化保存指固有神经的组织结构观察:取0.5cm 长度神经标本,各组5条,按Calcein -AM /PI 活细胞/死细胞双染色试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)说明书进行孵化染色,防荧光淬灭剂封片,TCS -SP2型激光扫描共聚焦显微(德国Leica 公司),分别在490nm㊁545nm 波长下观察荧光强度㊂ 5.神经体外培养:复温后指神经Hankᶄs 液洗涤3次,置于8孔细胞培养板的培养孔中,每孔2.5ml 含有10%胎牛血清,100U /ml 链霉素的H -DMEM 培养基,37ħ㊁5%CO 2培养箱内培养7天,每2天更换培养液1次㊂6.ELISA 法检测玻璃化保存后神经的NGF:取培养后神经用0.01mol /L 的PBS 液冲洗,称取湿重,按200mg 组织加入1ml 三蒸水的比例,进行组织匀浆,2500r /min 离心20min 后,取上清液㊂严格按照人神经生长因子ELISA 试剂盒(美国博士德生物公司)说明书操作,依照试剂盒说明及标准品浓度,建立标准曲线,每组设置3个复孔㊂在波长450nm 酶标仪(美国PerkinElmer 公司)上测定A 值;以A 值为纵坐标,标准品浓度横坐标,建立标准曲线,根据样品A 值找出对应浓度㊂7.统计学方法:采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析,计量资料以均数ʃ标准差(x ʃs )表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD 法,以P <0.05为差异有统计学意义㊂结㊀㊀果1.玻璃化保存指固有神经组织结构:HE 染色后光镜下观察,空白对照组神经鞘膜结构散乱,神经纤维排列疏松㊁紊乱,局部有脱髓鞘改变;甘油组㊁丙二醇组神经鞘膜偶见断裂,神经纤维结构较松散,脱髓鞘改变均较轻;30%DMSO 组间神经鞘膜完整性更好,神经脱髓鞘改变更轻;乙二醇组神经鞘膜最完整,神经纤维排列整齐㊁紧凑,脱髓鞘改变最轻(图1)㊂图1㊀玻璃化保存3周人指固有神经病理切片(HE,ˑ400)A.空白对照组;B.乙二醇组;C.30%DMSO 组;D.甘油组;E.丙二醇组㊀㊀㊀2.玻璃化保存指固有神经生物活性:Calcein -AM /PI 双染色,激光共聚焦显微镜观察,结果显示,空白对照组神经纤维绿色荧光(代表活细胞)轻度较弱,红色荧光(代表死细胞)强度较强,且广泛分布;实验组与空白对照组比较,绿色荧光较强,红色荧光弱;实验组内,甘油组及丙二醇组神经荧光强度相似,绿色荧光强度最弱,红色荧光强度最强;30%DMSO 组于前两组比较绿色荧光较强,红色荧光较弱;乙二醇组绿色荧光最强,红色荧光最弱,分布范围有限(图2)㊂㊃601㊃图2 人指固有神经激光扫描共聚焦显微(Calcein-AM/PI,ˑ400)A.空白对照组;B.乙二醇组;C.30%DMSO组;D.甘油组;E.丙二醇组㊀㊀㊀3.ELISA法检测培养神经的神经生长因子(NGF)水平:人指固有神经玻璃化保存3周后,空白对照组NGF(12.95ʃ3.03pg/ml)水平最低,其次是甘油组(61.47ʃ3.34pg/ml)㊁丙二醇组(62.53ʃ3.64pg/ ml)㊁30%DMSO组(109.51ʃ9.98pg/ml),乙二醇组(112.64ʃ3.54pg/ml)NGF水平最高;空白对照组与4个实验组间比较,差异均有统计学意义(P均< 0.05)㊂实验组间比较,甘油组与丙二醇组比较,差异无统计学意义(P>0.05),其余各实验组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)㊂讨㊀㊀论周围神经损伤是创伤外科较为棘手的问题,自体神经移植作为神经损伤修复金标准[2]㊂受到供区并发症㊁取材长度限制㊁神经直径匹配度低等限制[3~5]㊂同种异体神经具有天然的神经结构,提供适合神经再生的基质及生长因子,其来源广泛㊁匹配度高,在周围神经损伤治疗中具有优势[6~8]㊂深低温保存技术能有效地降低异体移植的免疫原性,延长移植神经的时效性㊂但降温过程对细胞及组织却是致命打击㊂细胞外冰晶形成导致细胞溶质浓度增高,造成细胞脱水㊁细胞膜结构及蛋白功能受损,形成 溶质损伤 ,细胞内冰晶直接导致细胞死亡[9~11]㊂玻璃化保存通过高浓度CAPs及超高的冷却速率,使细胞内外液体形成玻璃态,从而有效避免冰晶形成[12,13]㊂渗透性CAPs通过提升液体玻璃化转换温度及降低溶剂冰点,减少了降温过程中细胞内外冰晶[14]㊂解冻过程中渗透性CAPs 还可以抑制冰晶再形成导致的二次损伤,进一步保护组织复温后的组织结构㊂不同CAPs对组织保护效果存在差异,因其发挥作用的机制不同,DMSO与丙二醇通过改变双分子层的排列进而起到细胞保护作用,甘油与乙二醇则通过与磷脂分子形成氢键发挥保护作用[10,14]㊂周围神经损伤后的再生过程中施万细胞(schwann cells,SCs)发挥积极作用㊂损伤后SCs失去轴突支配,成熟的SCs通过基因调控去分化为具有修复状态的祖细胞,称为修复施万细胞[15]㊂修复施万细胞引起髓鞘自噬,募集巨噬细胞清除损伤神经断端周围的组织碎片,减缓局部炎性反应,为神经轴突再生提供合适环境[16]㊂同时神经断端间由巨噬细胞㊁嗜中性粒细胞㊁成纤维细胞等形成 神经桥 ,SCs 沿着神经桥生长形成中控管道,为轴突再生提供支架㊂SCs生长过程中分泌大量的神经生长因子,营造再生微环境㊂自体神经移植联合SCs移植修复神经损伤能有效修复运动功能与感觉功能[17,18]㊂根据神经营养因子表达差异,SCs可分为运动型施万细胞和感觉型施万细胞,NGF㊁血管内皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1在感觉神经施万细胞中高表达㊂研究发现,感觉型施万细胞对运动神经与感觉神经在再生具有较强的引导作用,这是由于NGF的受体TrkA仅在感觉神经中表达引起,所以NGF的浓度水平可以反映诱导感觉神经再生的能力[19]㊂周围神经损伤发生后神经断端的NGF表达上调后:①促进SCs引起髓鞘自噬,推进髓鞘碎片的清除;②引导SCs沿 神经桥 迁移,协助再生神经支架形成;③为新生轴突提供合适的再生微环境,促进轴突再生;④促进修复施万细胞的再髓鞘化,由此可见, NGF是神经再生微环境中重要的组成部分㊂而微环境中较高浓度的NGF可以维持神经的再生状态[20,21]㊂人造神经支架由于缺少合适的再生微环境,其修复能力弱于自体神经移植,当加入外源性神经生长因子后神经再生速率与准确性得到明显提升[22]㊂研究发现,CAPs可以改变玻璃化冻存的细胞线粒体mRNA的表达,SCs对NGF分泌作用受多种基因信号调控,本实验中,不同组神经组织匀浆中㊃701㊃NGF的含量差别可能与CAPs对SCs活性的保护作用有关,同时不能排除CAPs对SCs内NFG分泌相关基因调控的影响[23,24]㊂综上所述,同种异体神经移植作为理想的修复材料,玻璃化保存可延长使用时限㊂本实验结果证实,4种CAPs对人指固有神经的玻璃化法保存均有保护作用,其中乙二醇效果最佳,更适合用于人指固有神经玻璃化保存㊂本研究旨在为人指固有神经玻璃化保存提供一定的理论基础,希望后续可以找到更加适合人指固有神经的玻璃化保存方法,为周围神经损伤再生修复提供新的治疗手段㊂参考文献1㊀薛刚,蔺亚平.手外伤严重程度评估系统与术后患者手功能相关性研究[J].陕西医学杂志,2020,49(1):83-862㊀李兵仓.周围神经损伤的外科学处理[J].创伤外科杂志,2020, 22(11):864-8693㊀Nadia,Rbia,Alexander,et al.The role of nerve graft substitutes in motor and mixed motor/sensory peripheral nerve injuries[J].Journal of Hand Surgery,2017,42(5):367-3774㊀Silva JB,Marchese GM,Cauduro CG,et al.Nerve conduits for trea-ting peripheral nerve injuries:a systematic literature review[J].Re-tour Au Numéro,2017,36(2):71-855㊀Lovati AB,Dᶄarrigo D,Odella S,et al.Nerve repair using decellu-larized nerve grafts in rat models.a review of the 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程序化和玻璃化冻融人卵裂期胚胎的临床应用效果比较
2016.08171生殖健康疗效2例，整体治疗有效率为91.37%；顺铂组58例病患的病情情况中，完全缓解的有21例，病情部分缓解的有24例，稳定不变的有8例，稍有进展的疗效5例，整体治疗有效率为77.59%；对照组58例病患的病情情况中，完全缓解的有16例，部分缓解的有21例，稳定不变的有13例，病情稍有进展的疗效8例，整体治疗有效率为63.79%。
三组数据中，奈达铂组和顺铂组的整体治疗有效率明显高于对照组；对比具有显著差异性，满足统计学意义（P<0.05）。
如表1所示。
2.2 整体不良反应发生率根据对比结果显示，整体不良反应发生情况对比方面，奈达铂组58例病患中，无不良反应的有52例，轻度不良反应的有3例，病患可忍受的不良反应的有2例，病患不可忍受的不良反应的的有1例，严重不良反应的有0例病，整体不良反应发生率为10.34%；顺铂组58例病患中，无不良反应的有41例，轻度不良反应的有9例，病患可忍受的不良反应的有4例，病患不可忍受的不良反应的的有3例，严重不良反应的有1例病，整体不良反应发生率为29.31%；对照组58例病患中，无不良反应的34例，轻度不良反应的有11例，病患可忍受的不良反应的有6例，病患不可忍受的不良反应的的有5例，严重不良反应的有2例病，整体不良反应发生率为41.38%。
组数据中，奈达铂组和顺铂组的整体不良反应发生率明显高于对照组；对比具有显著差异性，满足统计学意义（P<0.05）。
如表2所示。
3 讨论综上所述，在展开奈达铂化疗联合同期放疗、顺铂化疗联合同期放疗、单纯放疗治疗中晚期宫颈癌对比中：在整体治疗效果对比方面，奈达铂组58例病患整体治疗有效率为91.37%；顺铂组58例病患整体治疗有效率为77.59%；对照组58例病患整体治疗有效率为63.79%。
在整体不良反应发生情况对比方面，奈达铂组58例病患整体不良反应发生率为10.34%；顺铂组58例病患整体不良反应发生率为29.31%；对照组58例病患整体不良反应发生率为41.38%。
OPS法玻璃化冷冻山羊卵母细胞的研究
用 手 术 刀 片 划 破 卵 巢 表 面 ２ 卵 泡 ， ５号 针 管 抽 取 ３ ～６ｍｍ 用 ９℃ 的 Ｐ Ｓ冲洗 划破 的 卵 泡 ， 集 冲 卵 液 ， 实 体 显 微 镜 下 镜 检 ， Ｂ 汇 在 挑
用 Ｏ Ｓ法冷冻山羊卵母细胞的报道却很少 ， Ｐ 仅见刘 海 军… 等的
报道 。为 了验证该方法 在 山羊卵母 细胞冷 冻 的效果 ， 本实 验以 两种不 同的冷 冻保护 液冷冻不 同期 的山羊 卵母细胞 ， 旨在 获得
维普资讯
中国草食 动 物
２０ ０ ６年
ＯＰ Ｓ法玻 璃 化 冷 冻 山羊 卵母 细 胞 的研 究
周俊 波 ，戴 荣 亮 ，王 杏龙 （ 州 大学 动 物科学 与技 术 学 院 ， ２ ５ ０ ） 扬 ２ ０ ９
摘要 ： 采用两种不同的冷冻保护液 Ｖ Ｅ Ｓ Ｉ（Ｇ＋Ｄ Ｓ ） Ｖ ｌ Ｐ Ｏ Ｍ Ｏ 和 ＳＩ（ Ｒ Ｈ＋Ｄ Ｏ ， Ｐ ＭＳ ）用Ｏ Ｓ法对不同期的卵母细胞进行冷
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ＨＥ Ｅ Ｐ Ｓ缓 冲液 。
胎 的 主效 基 因 。新 疆 多 浪 羊具 有 常 年 发 情 、 殖 率 高 的 特 点 ， 繁 因
［ ］ 陈晓军 ， ．多浪羊 Ｂ Ｒ Ｉ ３ 等 ＭＰ — Ｂ基因多态性的初步研究［］ 新疆农 Ｊ．
冻 。结 果 表 明 ： 种 冷 冻 液 ＶＳＩ和 ＶＳⅡ的冷 冻 效 果 差 异 不 显 著 （ ＞ Ｏ ０ ）但 从 数 据 看 。 ＳＩ要 优 于 ＶＳＩ； 不 同期 的 两 Ｐ ．５ ， Ｖ ｌ 而
玻璃化与程序化两种不同胚胎冻融方法的临床应用效果比较
与 程序 化 冷 冻 法 比较 ， 胚胎 复 苏 率 （ ４７ ％ ，４ １％ ） 解 冻 移 植 率 （７ ９ ％ ，７９ ％ ） 种 植 率 （８ ８ ％ ， 其 ９ ．５ ７ ． ３ 、 ９ ．４ ８ ． ８ 、 ２ ．８
ｌ．４ ） ６ ９ ％ 和临床妊娠率 （２ ８ ％ ，０ ７ ％） 差畀 均有统计 学意义（ ４ ．６ ３． ５ ， Ｐ＜０ ０ ） ．５ 。结论 玻璃化冷 冻法 比程序
ｂ ｔ ｅ ｎ ｔ ｏ ｍｅｈ ｄ ．Ｒｅ ｕ ｔ Ｔ ｅ ｅ ｒ ｏ ｕ ｖｖ ｌｒ ｔ ，ｔａ ｓ ｒ ｒ ｔ ，ｉ ｌｎ ａｉ ｎ ｒ ｔ ｔ ｌ ｉａ ｒ ｇ ａ ｃ ｄｗ ｅ ｗ ｔ ｏ ｓ ｓｌ ｓ ｈ ｍｂ ｙ ｓ ｓ ｒ ｉａ ａｅ ｒｎ ｆ ａｅ ｍｐａ ｔｔ ａｅ ａｔ ｃｉ ｃ ｌ ｐ ｅ ｎ ｎ ｙ ｅ ｏ ｄ ｎ
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哺乳动物胚胎玻璃化冷冻研究进展
近 年来 ，一系列 高 效 的玻 璃化 冷冻 方案 相继 诞
生 ，根据 冷冻过 程 中的胚胎 冷冻 主体 承载 工具 的不 同 ， 体可 以分 为细 管法 ＿ 微 滴法 ｌ 电子显微 镜 铜 具 ］ １ 、 ６ １ 、 网 法ｆ、 放式 拉 长 塑料 细 管 法 ＿ 玻璃 微 细 管 法Ｉ、 开 ７ ｌ ８ ＿ 、 ９ Ｊ
关 键 词 ： 璃 化 冷 冻 ； 胎 ； 乳 动 物 玻 胚 哺
中图分类 号 ：￥ １ ． ８ ４６
文献 标识码 ： Ａ
文章 编号 ：２ ８ ７ ３ （ ０ ０ ０ — ０ ９ ０ ０ ５— ０ ３ ２ １ ）７ ０ ６ — ４
Ｗｈ ｔ ｇａ 等 【 次 对小 鼠胚 胎进 行 慢 速 冷冻 ｉｉ ｈｍ ｔｎ 】 首 保存 。Ｗｉａｓｎ等 ［ ｌｄｅ ｌ ２ ｊ 述方 法进行 了改进 ， 明了 对上 发 快速 冷冻 法 ，将 绵羊胚 胎 于抗冻保 护 剂溶 液 中处理
冷 冻 液 装 入 管 内 ， 后 直 接 投 入 液 氮 保 存 。解 冻 然
程 序 是 将 Ｏ Ｓ细 端 浸 入 一 定 温 度 解 冻 液 中 ，～ Ｐ １ ２ｓ
基金项 目： 等学 校博士学科点专项科 研基金 （０ ６ ０ ９ ３ ） 高 ２ ０ ０ １０ １ 作者简介 ： 周光斌 （ ９４ ）男 ， １ ７一 ， 湖南人 ， 博士
半 细 管法 【、 闭式拉 长 塑料 细 管法 【 、 ｌ封 ０ ］ “ 固体表 面玻 １ 璃 化法 ｌ和冷冻 环法 【等 。 ｌ ２ ］ ｌ ３ ］
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胚胎 冷冻保 存并获得成 功 。 Ｐ Ｏ Ｓ由 ０２ Ｌ细管加 热 ．５ ｍ
抗冻蛋白对猪精液保存影响的应用
抗冻蛋白对猪精液保存影响的应用艾子凯1，何仁伟1，黄涛1，2 *（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 232003；2.新疆生猪种业工程技术研究中心，新疆昌吉 831199）目前新疆生猪养殖行业中，其核心养殖场的首要问题为种公猪精液利用率不足，大多数猪场人工授精所用精液多数来自当天采集，或来自17℃存储1～2 d的精液；市场上中效、中长效和长效等猪鲜精稀释粉大部分被养猪发达国家所垄断，价格较高，给生猪养殖业带来较大经济压力，增加了企业生产成本。
随着养猪业养殖水平的逐步提高以及人工授精技术在集约化养猪场的推广应用，精液保存技术已变得重要，并日益显示出减少生猪养殖数量和成本、加快猪品种改良、减少疾病传播等方面的优势。
由于引进优良的种公猪精液可以取缔引进活体种猪，从而降低繁殖成本，因此提高优秀种公猪精液高效保存与利用技术在生猪养殖中尤为重要。
相关研究表明抗冻蛋白对生活在冰冷海水中的过冷鱼类的生存至关重要，可以抑制冰晶的生长，并且可以保护一些动植物免受低温冻伤。
但在精液保存中的应用还不多见。
1 抗冻蛋白的分类抗冻蛋白是一类特殊的蛋白质，根据其来源和性质的不同，可以将其分为：生物源抗冻蛋白、合成抗冻蛋白、糖蛋白类抗冻蛋白、多肽类抗冻蛋白。
生物源抗冻蛋白主要来源于极地生物，例如南极的鱿鱼、甲壳类动物等。
这些生物之所以在极端低温环境下能够存活和繁殖，是因为抗冻蛋白起到了非常重要的保护作用。
合成抗冻蛋白是通过基因工程技术合成的，具有较高的抗冻能力。
目前已有许多研究对该类抗冻蛋白进行了合成和应用研究。
糖蛋白类抗冻蛋白结构中包含有较多的糖类，能够在极低的温度下保护细胞膜的完整性，从而有效地保护细胞免受冻害。
多肽类抗冻蛋白通常由氨基酸组成，能够有效地保护细胞膜的完整性，从而发挥抗冻的作用。
1.1 海源性抗冻蛋白已知的海源性抗冻蛋白主要存在于极地鱼类和冷水鱼体内，包括antifreeze protein （AFP）、antifreeze glycoprotein（AFGP）和ice-binding protein （IBP）等。
OPS法玻璃化冷冻兔胚胎的研究
１ ． 基础 液 ．１ ２
基础操作 液 （ 培养液 ， Ｍ） ２ ％新 Ｈ 含 ０
生 牛血清 （ ｓ ｃ ）的 Ｔ Ｍ１９ Ｈ Ｐ Ｓ缓 冲液 ；蔗糖 液 Ｃ ９一 Ｅ Ｅ （Ｍ） ｍ ｌ ｓ １ ｏＬ的 蔗 糖 溶 于 Ｔ Ｍ１９ Ｈ Ｐ Ｓ ／ Ｃ ９ 一 Ｅ Ｅ ，再 加 入
２ ％的 Ｃ 。 ０ Ｓ
椹胚 ４ ５枚移植到 ２ １ ９只受体母 兔体 内， 总妊娠率为 ５ ， １／ ９， １ ％（５２ ）产仔 率为 ３ ．％（１１７。ＶＳＩ ７ ４５ ６ ／７） 妊娠率为 ５ ． ８ ３３ ／ ％（
１）产仔 率为 ３ ． ３／ ５； Ｓ ５， ６ ％（５９ ）Ｖ Ⅱ妊娠 率为 ５ ． ７ １）产 仔率为 ３ ． ２ ／２。无论妊 娠 率还是产仔 率 ， ＳＩ都 高 ８ ００ ／４， ％（ １７ ６８） ％（ Ｖ 于 ｖ Ⅱ， 差异不显著 （ ｓ 但 Ｐ＞００） ． 。 ５ 关键词 ： 畜牧学 ； Ｓ 胚胎冷冻 ； ＯＰ ； 兔 中图分类号 ：８９１３ ￥２ ．０ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：２ ８ ７ ３ （０６１— ０２ ０ ０ ５ — ０３２ ０ ）９ ０ １ — ３
ＥＧ ＋２ ％ ＤＭ Ｓ ０ Ｏ。
壁冷冻细管利用毛细现象将极微量冷冻液滴 （￣ Ｌ １２ ） 连 同胚胎一起吸入细管 内后 ，直接投入液氮冷冻保存 。 目前 ，Ｐ 已成功冷冻 了牛回 山羊１ Ｏ Ｓ法 、 ３ １ 等多种动物 的胚 胎， 并且解冻后的山羊囊胚移植 已取得成功 。国内尚未 见 ＯＳ Ｐ 法冷 冻兔胚胎方面 的研究报道 ，为 了验证该方 法在试验动物兔 上的冷冻效果， 本研究 以 ２种不 同浓度 的冷冻液冷冻兔胚胎 ， 旨在获得一种高效 、 、 稳定 又简单
胚胎冷冻技术经历 了由繁到简 的过程 ，主要 围绕
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玻璃化冷冻法
慢速冷冻法即玻璃化冷冻来自于自然的启示，科学家发现某些种类的青蛙可在冬季经历零下数十度冷冻，而在春季解冻，且机体没有任何损伤。
研究认识到，这种青蛙冷冻时体内存在丙三醇，代替水作为细胞内溶剂，而在春天苏醒后体内丙三醇消失。
“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降温达到或低于-100℃~-110℃的温度范围时，形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。
玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态。
1985年，玻璃化冷冻鼠胚胎首先获得成功。
目前，玻璃化冷冻保存细胞已成功应用于动物卵母细胞、血细胞及胚胎，眼角膜、皮肤、血管等组织中，而人类胚胎中的应用始于1990年，目前已经获得广泛成功。
玻璃化冷冻技术是快速冷冻与高浓度冷冻保护剂相结合的结果。
快速冷却，低温时形成透明的玻璃状固体，冷却过程中黏度很高，但无冰晶形成，避免冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。
玻璃化冷冻主要操作步骤简单，包括：高浓度的冷冻保护剂置换细胞内外的溶液，快速降温，使溶液黏稠度极度提高并固化，放置液氮保存。
影响玻璃化冷冻效果的因素主要包括：①冷冻保护剂。
同一种组织细胞，冷冻保护剂的浓度和种类是最重要的一个影响因素。
细胞外冷冻保护剂一般采用大分子物质，如多糖类(蔗糖、海藻糖)、聚乙二醇、胎牛血清白蛋白(BSA)和Percoll 等；细胞内冷冻保护剂为具有良好穿透性的小分子物质，如二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇。
冷冻保护剂毒性也是人们对玻璃化冷冻担心的主要问题，但迄今大量的临床和动物实验均未发现这些冷冻保存剂对动物和人类胚胎有任何不良影响；
②温度下降速度。
降温速度越快越好，可直接沁入液氮的方法，降温速度约为2500 ℃/min，而使用玻璃化冷冻仪降温速度可达135000 ℃/min；③胚胎载体。
对胚胎载体的要求是胚胎周围的冷冻保存剂体积应尽量小，与液氮间隔尽量少，操作简便且不易丢失胚胎，目前常用的有：拉细的麦管、Cryotop、Cryotip、Cryoleaf、直接微滴法、电镜网和Cryoloop。
目前已有很多文献表明，玻璃化胚胎冷冻技术可明显提高胚胎的复苏率和移植后患者的临床妊娠率，是一种很有前途的方法。