玻璃化冷冻分析
4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化保存效果
㊀㊀基金项目:广东省珠海市医学科研基金资助项目(20191208A010071)作者单位:519100㊀遵义医科大学第五附属(珠海)医院烧伤整形手外科通信作者:陈世玖,电子信箱:csj6916@4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化保存效果李㊀智㊀戴依娜㊀王㊀成㊀陈世玖摘㊀要㊀目的㊀评估二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)㊁甘油㊁丙二醇㊁乙二醇玻璃化法保存人指固有神经中的保护效果,筛选合适的人指固有神经冷冻保护剂㊂方法㊀取截肢手术后患者放弃肢体的指固有神经,分为实验组(30%DMSO 组㊁甘油组㊁乙二醇组㊁丙二醇组)和空白对照组进行玻璃化法于液氮(-196ħ)中保存3周㊂复温后进行光学显微镜观察㊁共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测㊁指固有神经片段的神经生长因子(nerve growth factor,NGF)检测㊂结果㊀光镜观察:空白对照组神经鞘膜结构模糊,神经纤维排列疏松㊁紊乱;实验组神经鞘膜较为完整,神经纤维排列相对整齐㊁紧凑㊂LSCM 结果:采用钙黄绿素-AM (calcein -AM)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色后空白对照组神经纤维绿色荧光强度较弱,红色荧光强度较强㊂实验组绿色荧光较空白对照组均增强,红色荧光强度均减弱㊂ELISA 检测结果:空白对照组12.95ʃ3.03pg /ml㊁乙二醇112.64ʃ3.54pg /ml㊁30%DMSO109.51ʃ9.98pg /ml㊁甘油61.47ʃ3.34pg /ml㊁丙二醇62.53ʃ3.64pg /ml㊂结论4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化法保存均有保护作用,其中乙二醇效果最佳,更适合用于人指固有神经玻璃化保存㊂关键词㊀冷冻保护剂㊀人指固有神经㊀周围神经损伤㊀玻璃化保存中图分类号㊀R658㊀㊀㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀㊀㊀DOI ㊀10.11969/j.issn.1673-548X.2022.07.023Experimental Study on Cryopreservation of Human Proper Digital Nerve by Vitrification with Four Cryoprotective Agents Abstract.LI zhi ,DAI Yina ,WANG Cheng ,et al.Department of Plastic and Hand Surgery ,The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University ,Zhu-hai ,Guangdong 519100,ChinaAbstract ㊀Objective ㊀To evaluate the protective effect of dimethyl sulfoxide (DMSO),glycerol,propylene glycol and ethylene gly-col vitrification in the preservation of human finger proper nerve,and to screen a suitable cryoprotective agent for human finger proper nerve.Methods ㊀The proper digital nerves of the limbs abandoned after amputation were divided into experimetal group (30%DMSO group,glycerol group,ethylene glycol group,propylene glycol group)and blank control group.They were vitrified and stored in liquid ni-trogen (-196ħ)for 3weeks.After rewarming,optical microscope observation,confocal microscope (LSCM )detection and nerve growth factor (NGF)detection of finger intrinsic nerve segments were carried out.Results ㊀Light microscope observation:in the blank control group,the structure of nerve sheath was fuzzy,and the arrangement of nerve fibers was loose and disordered;the nerve sheath in the experimental group was relatively complete,and the nerve fibers were arranged relatively orderly and compact.LSCM results:After calcein AM /PI double staining,the green fluorescence intensity of nerve fibers in the blank control group was weak and the red fluores-cence intensity was strong;the green fluorescence of the experimental group was stronger than that of the blank control group,and the red fluorescence intensity was weaker.ELISA results:In blank control group,the results were 12.95ʃ3.03pg /ml,ethylene glycol 112.64ʃ3.54pg /ml,30%DMSO 109.51ʃ9.98pg /ml,glycerol 61.47ʃ3.34pg /ml,propylene glycol 62.53ʃ3.64pg /ml.Conclusion ㊀The four cryoprotectants have protective effects on the vitrification preservation of human finger proper nerve,and ethylene glycol is the best,which is more suitable for the vitrification preservation of human finger proper nerve.Key words ㊀Cryoprotective agents;Human proper digital nerve;Peripheral nerve injury;Vitreous preservation㊀㊀全球急性手外伤发生率为0.15ɢ~3.15ɢ,手部神经损伤将导致神经传导中断,会导致肌肉萎缩失去功能㊁感觉功能障碍,造成手部功能丧失,严重影响患者生活质量[1]㊂修复手部损伤神经㊁重建手部神经功能意义重大㊂同种异体神经移植是理想的治疗方案㊂本研究以患者放弃肢体的指固有神经作为研究对象,旨在评估甘油㊁二甲基亚砜㊁乙二醇㊁丙二醇4种冷冻保护剂(cryoprotective agents,CAPs)的玻璃化保存效果,为人指固有神经玻璃化法保存提供一定的理论依据㊂对象与方法1.标本来源及处理:取在遵义医科大学第五附属㊃501㊃(珠海)医院因外伤行截肢手术后患者放弃的肢体(共6例上肢,腕部水平离断1例,前臂离断3例,上臂离断1例,肩部离断1例),患者无高血压㊁糖尿病及周围血管神经病变㊂肢体置于无菌操作台,剥离指固有神经至远端指间关节,剪成长度为1cm 的神经片段,共75个片段,随机分为5组(4个实验组分别为30%DMSO 组㊁甘油组㊁乙二醇组㊁丙二醇组和1个空白对照组)㊂2.玻璃化保存:以胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)㊁RPMI1640培养液㊁各组对应种类CAPs,按体积比为1ʒ6ʒ3配置玻璃化冻存液㊂处理分组后的神经片段分别放入装有4ħ预冷的对应组的冷冻保护剂的冻存管中,在4ħ中平衡30min,-20ħ平衡2h,于-80ħ冰箱过夜后投入液氮罐内深低温保存3周㊂3周后取出,直接放入40ħ的水浴中快速复温,复温后加入含有0.5mol /L 的蔗糖溶液中,洗脱10min,0.25mol /L 蔗糖溶液,再次洗脱10min㊂3.HE 染色光学显微镜观察:每组取出5个标本,各截取0.5cm 进行常规脱水固定㊁石蜡包埋㊁切片㊂按试HE 染色剂盒(美国博士德生物公司)说明书进行染色操作,在400倍光学显微镜(日本Olympus 公司)下观察神经组织结构㊂4.玻璃化保存指固有神经的组织结构观察:取0.5cm 长度神经标本,各组5条,按Calcein -AM /PI 活细胞/死细胞双染色试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)说明书进行孵化染色,防荧光淬灭剂封片,TCS -SP2型激光扫描共聚焦显微(德国Leica 公司),分别在490nm㊁545nm 波长下观察荧光强度㊂ 5.神经体外培养:复温后指神经Hankᶄs 液洗涤3次,置于8孔细胞培养板的培养孔中,每孔2.5ml 含有10%胎牛血清,100U /ml 链霉素的H -DMEM 培养基,37ħ㊁5%CO 2培养箱内培养7天,每2天更换培养液1次㊂6.ELISA 法检测玻璃化保存后神经的NGF:取培养后神经用0.01mol /L 的PBS 液冲洗,称取湿重,按200mg 组织加入1ml 三蒸水的比例,进行组织匀浆,2500r /min 离心20min 后,取上清液㊂严格按照人神经生长因子ELISA 试剂盒(美国博士德生物公司)说明书操作,依照试剂盒说明及标准品浓度,建立标准曲线,每组设置3个复孔㊂在波长450nm 酶标仪(美国PerkinElmer 公司)上测定A 值;以A 值为纵坐标,标准品浓度横坐标,建立标准曲线,根据样品A 值找出对应浓度㊂7.统计学方法:采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析,计量资料以均数ʃ标准差(x ʃs )表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD 法,以P <0.05为差异有统计学意义㊂结㊀㊀果1.玻璃化保存指固有神经组织结构:HE 染色后光镜下观察,空白对照组神经鞘膜结构散乱,神经纤维排列疏松㊁紊乱,局部有脱髓鞘改变;甘油组㊁丙二醇组神经鞘膜偶见断裂,神经纤维结构较松散,脱髓鞘改变均较轻;30%DMSO 组间神经鞘膜完整性更好,神经脱髓鞘改变更轻;乙二醇组神经鞘膜最完整,神经纤维排列整齐㊁紧凑,脱髓鞘改变最轻(图1)㊂图1㊀玻璃化保存3周人指固有神经病理切片(HE,ˑ400)A.空白对照组;B.乙二醇组;C.30%DMSO 组;D.甘油组;E.丙二醇组㊀㊀㊀2.玻璃化保存指固有神经生物活性:Calcein -AM /PI 双染色,激光共聚焦显微镜观察,结果显示,空白对照组神经纤维绿色荧光(代表活细胞)轻度较弱,红色荧光(代表死细胞)强度较强,且广泛分布;实验组与空白对照组比较,绿色荧光较强,红色荧光弱;实验组内,甘油组及丙二醇组神经荧光强度相似,绿色荧光强度最弱,红色荧光强度最强;30%DMSO 组于前两组比较绿色荧光较强,红色荧光较弱;乙二醇组绿色荧光最强,红色荧光最弱,分布范围有限(图2)㊂㊃601㊃图2 人指固有神经激光扫描共聚焦显微(Calcein-AM/PI,ˑ400)A.空白对照组;B.乙二醇组;C.30%DMSO组;D.甘油组;E.丙二醇组㊀㊀㊀3.ELISA法检测培养神经的神经生长因子(NGF)水平:人指固有神经玻璃化保存3周后,空白对照组NGF(12.95ʃ3.03pg/ml)水平最低,其次是甘油组(61.47ʃ3.34pg/ml)㊁丙二醇组(62.53ʃ3.64pg/ ml)㊁30%DMSO组(109.51ʃ9.98pg/ml),乙二醇组(112.64ʃ3.54pg/ml)NGF水平最高;空白对照组与4个实验组间比较,差异均有统计学意义(P均< 0.05)㊂实验组间比较,甘油组与丙二醇组比较,差异无统计学意义(P>0.05),其余各实验组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)㊂讨㊀㊀论周围神经损伤是创伤外科较为棘手的问题,自体神经移植作为神经损伤修复金标准[2]㊂受到供区并发症㊁取材长度限制㊁神经直径匹配度低等限制[3~5]㊂同种异体神经具有天然的神经结构,提供适合神经再生的基质及生长因子,其来源广泛㊁匹配度高,在周围神经损伤治疗中具有优势[6~8]㊂深低温保存技术能有效地降低异体移植的免疫原性,延长移植神经的时效性㊂但降温过程对细胞及组织却是致命打击㊂细胞外冰晶形成导致细胞溶质浓度增高,造成细胞脱水㊁细胞膜结构及蛋白功能受损,形成 溶质损伤 ,细胞内冰晶直接导致细胞死亡[9~11]㊂玻璃化保存通过高浓度CAPs及超高的冷却速率,使细胞内外液体形成玻璃态,从而有效避免冰晶形成[12,13]㊂渗透性CAPs通过提升液体玻璃化转换温度及降低溶剂冰点,减少了降温过程中细胞内外冰晶[14]㊂解冻过程中渗透性CAPs 还可以抑制冰晶再形成导致的二次损伤,进一步保护组织复温后的组织结构㊂不同CAPs对组织保护效果存在差异,因其发挥作用的机制不同,DMSO与丙二醇通过改变双分子层的排列进而起到细胞保护作用,甘油与乙二醇则通过与磷脂分子形成氢键发挥保护作用[10,14]㊂周围神经损伤后的再生过程中施万细胞(schwann cells,SCs)发挥积极作用㊂损伤后SCs失去轴突支配,成熟的SCs通过基因调控去分化为具有修复状态的祖细胞,称为修复施万细胞[15]㊂修复施万细胞引起髓鞘自噬,募集巨噬细胞清除损伤神经断端周围的组织碎片,减缓局部炎性反应,为神经轴突再生提供合适环境[16]㊂同时神经断端间由巨噬细胞㊁嗜中性粒细胞㊁成纤维细胞等形成 神经桥 ,SCs 沿着神经桥生长形成中控管道,为轴突再生提供支架㊂SCs生长过程中分泌大量的神经生长因子,营造再生微环境㊂自体神经移植联合SCs移植修复神经损伤能有效修复运动功能与感觉功能[17,18]㊂根据神经营养因子表达差异,SCs可分为运动型施万细胞和感觉型施万细胞,NGF㊁血管内皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1在感觉神经施万细胞中高表达㊂研究发现,感觉型施万细胞对运动神经与感觉神经在再生具有较强的引导作用,这是由于NGF的受体TrkA仅在感觉神经中表达引起,所以NGF的浓度水平可以反映诱导感觉神经再生的能力[19]㊂周围神经损伤发生后神经断端的NGF表达上调后:①促进SCs引起髓鞘自噬,推进髓鞘碎片的清除;②引导SCs沿 神经桥 迁移,协助再生神经支架形成;③为新生轴突提供合适的再生微环境,促进轴突再生;④促进修复施万细胞的再髓鞘化,由此可见, NGF是神经再生微环境中重要的组成部分㊂而微环境中较高浓度的NGF可以维持神经的再生状态[20,21]㊂人造神经支架由于缺少合适的再生微环境,其修复能力弱于自体神经移植,当加入外源性神经生长因子后神经再生速率与准确性得到明显提升[22]㊂研究发现,CAPs可以改变玻璃化冻存的细胞线粒体mRNA的表达,SCs对NGF分泌作用受多种基因信号调控,本实验中,不同组神经组织匀浆中㊃701㊃NGF的含量差别可能与CAPs对SCs活性的保护作用有关,同时不能排除CAPs对SCs内NFG分泌相关基因调控的影响[23,24]㊂综上所述,同种异体神经移植作为理想的修复材料,玻璃化保存可延长使用时限㊂本实验结果证实,4种CAPs对人指固有神经的玻璃化法保存均有保护作用,其中乙二醇效果最佳,更适合用于人指固有神经玻璃化保存㊂本研究旨在为人指固有神经玻璃化保存提供一定的理论基础,希望后续可以找到更加适合人指固有神经的玻璃化保存方法,为周围神经损伤再生修复提供新的治疗手段㊂参考文献1㊀薛刚,蔺亚平.手外伤严重程度评估系统与术后患者手功能相关性研究[J].陕西医学杂志,2020,49(1):83-862㊀李兵仓.周围神经损伤的外科学处理[J].创伤外科杂志,2020, 22(11):864-8693㊀Nadia,Rbia,Alexander,et al.The role of nerve graft substitutes in motor and mixed motor/sensory peripheral nerve injuries[J].Journal of Hand Surgery,2017,42(5):367-3774㊀Silva JB,Marchese GM,Cauduro CG,et al.Nerve conduits for trea-ting peripheral nerve injuries:a systematic literature review[J].Re-tour Au Numéro,2017,36(2):71-855㊀Lovati AB,Dᶄarrigo D,Odella S,et al.Nerve repair using decellu-larized nerve grafts in rat models.a review of the 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百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系建立及遗传稳定性分析
百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系建立及遗传稳定性分析陈冠群;李晓丹;申晓辉【摘要】采用单因素随机区组试验及多因素、多水平正交试验方案建立了百子莲胚性愈伤组织(embryogenic callus,ECs)玻璃化法超低温保存体系.将由花梗诱导的胚性愈伤组织接种至预培养基(MS+0.5 mol/L蔗糖+1％琼脂)上,在4℃下预培养2d后,在室温下加入装载液(MS+0.4mol/L蔗糖+2 mol/L丙三醇+10 mmol/L KNO3)处理60 min;利用改良后的PVS 2玻璃化溶液(MS+0.4 mol/L蔗糖+30％丙三醇+15％乙二醇+15％ DMSO)在0℃下处理40 min,将含有ECs的冻存管投入液氮中冻存1h;在40℃水浴中快速解冻90 s;用洗涤液(MS+1.2 mol/L蔗糖+ 10 mmol/L KNO3)处理30 min,每10 min换1次新鲜的洗涤液;洗涤后,接种到胚性愈伤组织增殖培养基上恢复培养24 h后,相对成活率分别达56.9％(TTC法)和43.3％(Evans blue法).恢复培养55 d的百子莲胚性愈伤组织经过AFLP多态性检测后未发现基因组变异,证明该方法可用于百子莲种质资源的超低温保存.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2014(032)005【总页数】9页(P76-83,94)【关键词】百子莲;胚性愈伤组织;玻璃化法超低温保存;遗传稳定性;AFLP【作者】陈冠群;李晓丹;申晓辉【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海市崇明县新海镇农技中心,上海202150;上海交通大学农业与生物学院,上海200240【正文语种】中文【中图分类】S682.32百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis)又称蓝百合,为百子莲科(Agapanthaceae)百子莲属(Agapanthus)多年生草本花卉,原产于非洲南部的亚热带地区。
玻璃化法冷冻保存对人胚胰岛的影响
玻璃化法冷冻保存对人胚胰岛的影响赵松;付英梅;刘连新;迟月明;李秀芬【期刊名称】《世界华人消化杂志》【年(卷),期】2006(14)10【摘要】目的:观察玻璃化法对人胚胰岛冻存复苏后形态功能的影响.方法:取胎龄18-28wk中期水囊引产死胎,用胶原酶分离胰岛后,分别采用传统微机程控缓慢降温和玻璃化超快速降温方法冷冻保存胰岛,复苏后,从胰岛形态、超微结构、胰岛素分泌功能方面比较两种冻存方法的效果.结果:两种方法冷冻保存的胰岛,复苏后形态保持完整,电镜下胰岛B细胞分泌颗粒和线粒体丰富,线粒体嵴规整,胰岛素释放试验中,二者的胰岛素水平与冻存前无明显差异(P>0.05),胰岛素基因表达水平与冻存前相似.结论:玻璃化法冷冻保存胰岛能够维持细胞的正常结构和功能,其冷冻效果与微机程控缓慢降温相比无明显差别.【总页数】5页(P958-962)【关键词】胰岛;玻璃化;冷冻保存【作者】赵松;付英梅;刘连新;迟月明;李秀芬【作者单位】哈尔滨医科大学第一临床医学院普通外科;哈尔滨医科大学微生物教研室;哈尔滨医科大学电镜中心;黑龙江省电力医院【正文语种】中文【中图分类】R587.1;R318.52【相关文献】1.小鼠早期桑椹胚和致密桑椹胚玻璃化冷冻保存试验 [J], 努尔江;史洪才2.麦管玻璃化法冷冻保存人诱导多能干细胞 [J], 蒋春艳;董娟;廖婷婷;宁松;范国平;曾桥;薛志刚;刘嘉茵3.大鼠胚脑细胞玻璃化冷冻保存研究 [J], 胡军祥;赵玉勤4.鸡胚19期原始生殖细胞慢速冷冻和玻璃化冷冻保存的研究 [J], 韩威;李碧春;朱云芬;秦洁;周冠月;陈国宏;张学余5.EFS20/40和GP25玻璃化法冷冻保存小鼠体外受精2细胞期胚的效果 [J], 朴香丽;杜文敬;王春生;尹洪哲;朴善花因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
程序化和玻璃化冻融人卵裂期胚胎的临床应用效果比较
2016.08171生殖健康疗效2例，整体治疗有效率为91.37%；顺铂组58例病患的病情情况中，完全缓解的有21例，病情部分缓解的有24例，稳定不变的有8例，稍有进展的疗效5例，整体治疗有效率为77.59%；对照组58例病患的病情情况中，完全缓解的有16例，部分缓解的有21例，稳定不变的有13例，病情稍有进展的疗效8例，整体治疗有效率为63.79%。
三组数据中，奈达铂组和顺铂组的整体治疗有效率明显高于对照组；对比具有显著差异性，满足统计学意义（P<0.05）。
如表1所示。
2.2 整体不良反应发生率根据对比结果显示，整体不良反应发生情况对比方面，奈达铂组58例病患中，无不良反应的有52例，轻度不良反应的有3例，病患可忍受的不良反应的有2例，病患不可忍受的不良反应的的有1例，严重不良反应的有0例病，整体不良反应发生率为10.34%；顺铂组58例病患中，无不良反应的有41例，轻度不良反应的有9例，病患可忍受的不良反应的有4例，病患不可忍受的不良反应的的有3例，严重不良反应的有1例病，整体不良反应发生率为29.31%；对照组58例病患中，无不良反应的34例，轻度不良反应的有11例，病患可忍受的不良反应的有6例，病患不可忍受的不良反应的的有5例，严重不良反应的有2例病，整体不良反应发生率为41.38%。
组数据中，奈达铂组和顺铂组的整体不良反应发生率明显高于对照组；对比具有显著差异性，满足统计学意义（P<0.05）。
如表2所示。
3 讨论综上所述，在展开奈达铂化疗联合同期放疗、顺铂化疗联合同期放疗、单纯放疗治疗中晚期宫颈癌对比中：在整体治疗效果对比方面，奈达铂组58例病患整体治疗有效率为91.37%；顺铂组58例病患整体治疗有效率为77.59%；对照组58例病患整体治疗有效率为63.79%。
在整体不良反应发生情况对比方面，奈达铂组58例病患整体不良反应发生率为10.34%；顺铂组58例病患整体不良反应发生率为29.31%；对照组58例病患整体不良反应发生率为41.38%。
食品冷冻新技术
• 玻璃态的一个判断标志：η﹥l014Pa·s，
对应η=l014Pa·s的温度称为玻璃化温度Tg (glass transition temperature)。
玻璃态：基质在小于玻璃化转变温度时所处的状态，T﹤Tg ； 橡胶态：基质在大于玻璃化转变温度时所处的状态，T>Tg 。
TD和TF分别为食品的冻结点及其冻结终了温度
（二） 冻结曲线
冻结曲线表示了冻结过程中温度随时间 的变化。 过冷临界温度 液态物质在降温过程中，开始形成稳定 晶核时的温度
低共熔点（共晶点）
在降温过程中，食品 组织内溶液的浓度增加 到一个恒定值，溶质和 水分同时结晶固化时的 温度
图中多条曲线表示食品不同深度处温度随冻结时 间的变化。在任一时刻食品表面的温度始终最低， 越接近中心层温度越高。
身的重力而成沸腾状态，并向前流动的操作方式。
2.2· 振动流态化 振动流态化：利用机械振动原理使食品在带孔的
槽体上按一定振幅和频率呈跳跃式抛物线型向前运 动，并辅以自下而上的冷风，造成食品层沸腾而成 流态化，从而实现单体快速冻结的方法。 振动流态化有两种方式：往复式振动和直线振动。
ZLG系列振动流化床
粘结现象：表面潮湿的食品颗粒在低温状态下相互冻
粘或冻粘在筛网上的现象。这种粘结现象使食品层变 成了固定床层，从而不能形成流态化。
夹带现象：在流化床中，如果气
流速度V大于降落速度Vg则食品颗粒 以V-Vg的净速度向上运动，被气流带 走，飞出流化床，这种现象称之夹带 现象。
四、流化速冻中的流态化操作及装置
食品流态化速冻的前提：一是作为冷却介质的冷空气在
流经被冻结食品时必须具有足够的流速，并且必须是自下而 上通过食品；二是单个食品的体积不能太大。
繁殖新技术
母畜发情鉴定技术的目的：判断发情阶段，预测排卵时间，确定适宜配种期，提高受胎率。
依据：外部表现和内部表现。
发情本质：卵巢上卵泡发育的变化。
发情鉴定方法：常用外部观察法、试情法、直肠检查法，还有生殖激素测定、仿生学、电测发、ph值等方法。
啮齿动物采用抹片法，发情期只有4天，1天1期。
牛发情持续期18-24h。
各种动物的发情鉴定：牛为直肠检查法，初产牛比多次产的牛容易鉴定，生牛越多，鉴定准确度越低；猪为外部观察法和压背法，外阴红肿，闹圈，食欲下降；山羊为举尾鸣叫，路出外阴户，绵羊采用试情法。
发情控制技术：采用某些激素、药物、饲养管理措施，人工控制母畜个体或群体发情并排卵的技术，主要包括诱导发情、同期发情、抄数排卵。
诱导发情estrus induction同期发情rstrus synchronization超数排卵superovulation诱导发情基本原理：利用外援激素或饲养管理因素对卵巢技能直接或间接作用，诱导乏情母畜卵泡发育、成熟、排卵。
激素制剂:FSH\LH\ECG\HCG\GNRH等饲养管理措施;早期断奶（猪），控制光照（羊）牛的诱导发情方法：1，初情期后长时间不发情的青年母牛：孕激素P:抑制性腺发育猪的诱导发情：1仔猪早期断奶2激素处理3公畜刺激处理方法：给药方式：口服法；注射法；阴道全塞法（P）；皮下埋植法同期发情：利用某些激素制剂人为控制同一群雌性动物发青同期的过程，使之在预定的时间集中发情，便于组织配种优缺点：集中劳动力，有计划合理组织；激素浪费，外源激素使用同期发情机理:1发情周期二分法：卵泡期和黄体期2借助外源激素作用于卵巢，使其按照预定要求变化时卵巢生理机能处于相同阶段方法：缩短黄体期：打PGF2a（前列腺素），溶黄延长黄体期：打P,使动物均进入黄体期，再打PGF2a结论：PGF2a单独使用可以达到同期发情，而P不能单独使用，只能达到同步，不能达到发情，需与PGF2a或GnRH一起使用孕激素阴道内T形硅胶全（CIDR）：由于孕酮作用时间10d时间过长，而发明的一种缓慢释放P的方法，成年牛埋植6天阴道埋植法和口服法不同：1药理结构不同2处理时间不同，撤全2天即可再次发情猪的同期发情：早期断奶；激素采用PMSGPMSG特点：半衰期很长，长达72-120h，长时间使用会卵泡囊肿，牛羊不用，但对猪很好母畜的排卵控制技术:在母畜发情的适当时期，用促性腺激素进行处理，分为排卵时间和排卵数两个方面。
食品冷冻冷藏论文
食品冷冻冷藏原理及设备摘要:对食品的冷冻、冷藏可实现食品的低成本、长时间、高品质的保存，是目前最普遍采用的食品贮藏方法。
通过抑制微生物及酶类的活动和降低食品基质中的活性，来防止食品腐败变质，保持食品的新鲜度和营养价值。
目前对市场食品冷冻冷藏的场所多为大型冷藏库、冷冻库，一般家庭用多为冰箱，实现市场与用户的高效、高品质的联系有赖于冷藏链的建设。
关键词：食品冷冻、冷藏，冷藏库，冷藏技术，玻璃化保藏，冷藏链中图分类号:TS205文献标识码：A0 引言近年来,随着人们对生活水平质量要求的提高,冷冻冷藏食品在食品市场中所占有的比例越来越大。
虽然冷冻冷藏是保持食品品质较好的方法之一,但冷藏冷冻方法选用不当就达不到我们要求的食品保存时间和品质保证，这就要求我们对食品冷冻原理及各种冷冻冷藏技术有所了解。
1 食品冷冻冷藏库的分类及特点食品冷藏库可分为以下几种类型：L级保鲜库主要用于储藏果蔬、蛋类、药材、保鲜干燥等；D级冷藏库主要用于储藏肉类、水产品及适合该温度范围的产品；J级低温库主要用于储藏雪糕、冰淇淋、低温食品及医疗用品等速冻库主要用于速冻食品及工业等特殊用途。
1.1 保鲜库保鲜库的温度一般在（+2 ℃～+5 ℃）,主要用于果蔬、乳品、鲜蛋、鲜肉等的保鲜，使食品保持较低的温度，而温度一般又不低于0℃。
食品低温贮藏并非温度越低越好，也并非任意低温条件下所有食品都能取得良好的贮藏效果。
食品在保鲜库内贮存一般不影响其内部组织，保鲜能使食品保持原有的风味和新鲜程度，同时大家也不应追求过低的贮藏温度，温度的降低将直接带来设备初投资和运行费用的增加。
保鲜贮藏是抑制微生物和酶的活性，延长水果蔬菜长存期的一种贮藏方式。
保鲜是现代水果蔬菜低温保鲜的主要方式。
水果蔬菜的保鲜温度范围为0℃～15℃，保鲜贮藏可以降低病源菌的发生率和果实的腐烂率，还可以减缓果品的呼吸代谢过程,从而达到阻止衰败，延长贮藏期的目的。
保鲜库特点：1、完美的原装制冷机组，高效节能、品质卓越；2、高效的吊顶蒸发器；3、先进的微电脑控制系统和先进的控制方法（负压停车）；4、优质的双面彩钢聚苯冷库板，占地面积小、保温性能好。
三种冷冻方法对人卵巢组织卵泡形态和凋亡的影响
三种冷冻方法对人卵巢组织卵泡形态和凋亡的影响赵淑芹;仇雪梅;丁晨;王磊;黄淑娟;马兆文【摘要】目的：探讨两步法冷冻、玻璃化冷冻和程序化冷冻法冻融人类卵巢组织的冷冻效果，以期探索更优的卵巢组织冷冻方案。
方法收集6例人卵巢组织，每例修剪成4块，分别随机分配到两步法冷冻组（A 组）、玻璃化冷冻组（B 组）、程序化冷冻组（C 组）和新鲜对照组（D 组），组织学分析4组卵泡形态学变化，并通过 TUNEL 法评估卵泡的凋亡情况。
结果两步法冷冻组始基卵泡和初级卵泡的异常形态卵泡率比玻璃化冷冻组和程序化冷冻组明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。
玻璃化冷冻组始基卵泡异常形态率低于程序化冷冻组（P ＜0.05），初级卵泡异常形态率两组差异无统计学意义（P ＞0.05）。
各冷冻组卵巢皮质中始基卵泡的凋亡差异均无统计学意义（P ＞0.05）。
卵巢间质细胞中，两步法冷冻组间质细胞凋亡率较玻璃化冷冻组和程序化冷冻组明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.05），玻璃化冷冻组和程序化冷冻组差异无统计学意义。
结论人体卵巢组织冻融后大部分卵泡形态保持正常，两步法冻存效果优于玻璃化冷冻法和程序化冷冻。
%Objective:To compare the cryopreservation effect of two-step freezing,vitrification and slow programmed cooling in order to explore a more effective method for human ovarian tissue cryopreservation. Methods:6 samples of adult ovarian tissue were collected and divided into 4 groups randomly:the two-step freezing group,the vitrification group,the slow programmed cryopreservation group and the fresh group. Stromal cells and follicles in ovarian cortical tissues were ana-lyzed by histological analysis. Follicles apoptosis were analyzed by TUNEL assay. Results:Thetwo-step freezing group showed a significant lower percentage ofabnormal morphology of follicles(Primordial and Primary)than the vitrification group and slow programmed cryopreservation group. In the percentage of abnormal morphology of primary follicles,the vitri-fication group showed no significant differences with the slow programmed cryopreservation group,and showed a significant lower percentage of abnormal morphology of primordial follicles than the slow programmed cryopreservation group. In the percentage of apoptotic follicles,there was no significant difference among three cryopreservation groups(P > 0. 05). In o-varian stroma cells,the two-step freezing group showed a significant lower apoptotic percentage than the vitrification group and slow programmed cryopreservation group,and there was no significant difference between the vitrification group and the slow programmed cryopreservation group. Conclusion:Morphology of most follicles can remain normal after human ovarian tissues are frozen and thawed,and the two-step freezing method is better than vitrification and slow programmed cooling.【期刊名称】《泰山医学院学报》【年(卷),期】2016(037)003【总页数】4页(P241-244)【关键词】卵巢组织;玻璃化冷冻;两步法冷冻;程序化冷冻;人【作者】赵淑芹;仇雪梅;丁晨;王磊;黄淑娟;马兆文【作者单位】枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄 277100;枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄 277100;枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄 277100;枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄 277100;枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄 277100;枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄277100【正文语种】中文【中图分类】R711卵巢组织的冷冻保存为肿瘤患者，或患有卵巢早衰等其他疾病的患者提供了保存自身生殖内分泌功能及生育能力的可能性。