玻璃化冷冻操作说明
玻璃化冷冻度
玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。
各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。
人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。
玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。
解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。
C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。
比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。
冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。
这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。
玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。
冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。
玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存技术摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。
关键词：胚胎冷冻保存为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。
这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。
目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
现有的胚胎冷冻保存方法有四种：一、常规冷冻法常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。
将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。
冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。
胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。
或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。
二、一步冷冻法一步冷冻法：也叫一步细管法。
该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。
三、程序冷冻法程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。
主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。
新技术玻璃化冷冻
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➢具体实施案
• 需要特定的冷冻保存剂以及载杆 • 操作者经过相应的培训
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➢国内外应用情况
• 目前国内外较大的生殖中心均有开展 • 北京地区已有多家生殖中心开展该项目，包括协和医院
、北医三院、301医院等
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适应证、禁忌证 及不良反应
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禁忌证及不良反应
在低温保存过程中，剧烈的温度和物理变化容易造成细胞 的损伤和死亡
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技术路线
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胚胎冷冻
冷冻保护剂的配制 胚胎在冷冻保护剂中依次转移，进行脱水 将胚胎置于载杆上，快速浸入液氮
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胚胎解冻
解冻保护剂的配制 将冷冻载杆从外套管中取出，将其前端（装有胚胎）浸于T1
液中，在显微镜下寻找胚胎，胚胎依次转入T2 –T4中 挪入事先准备好的培养滴内清洗后移入培养滴内 行辅助孵化后培养至移植
• 费用两种方法相当，玻璃化的载杆和保护剂成本稍高于程序化冷冻
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新技术申请-胚胎玻璃化冷冻
开展玻璃化冷冻的目的、 意义和实施方案
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➢开展玻璃化冷冻的目的、意义
玻璃化冷冻是目前普遍采用的冷冻方法 此方法避免了细胞外冰晶形成引起的理化损伤和细胞内形成的冰
晶对细胞的机械性损伤，维持了细胞内正常的超微结构 提高冷冻速率，可达到20000 -100000°C/min，使细胞迅速度过
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与传统程序化冷冻法 的比较
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➢风险、疗效、费用、及疗程的比较
• 传统的程序化冷冻需要复杂的冷冻仪，价格昂贵，并且所需冷冻时间比 较长
• 玻璃化冷冻不需要昂贵的程序化降温仪，冷冻时间大大缩短，并且复苏 率普遍高于程序化冷冻法
玻璃化冷冻技术名词解释
玻璃化冷冻技术名词解释
玻璃化冷冻技术是一种用于将食物或其他物品冷冻保存的技术。
它涉及将食物或物品迅速冷冻到极低的温度，以使其成为类似玻璃状的状态，从而防止冰晶的形成和物品的结晶化。
这种技术可以延长食物的保质期，并且可以在冷冻后保持食物原有的质地、口感和营养成分。
玻璃化冷冻技术的原理是在极低温下将物品迅速冷冻，使得其水分在冷冻过程中成为非晶态状态，而不是结晶状态。
这样可以避免冰晶的形成，从而减少对食物细胞结构的破坏，同时也减少了食物在解冻后的水分流失。
此外，玻璃化冷冻技术还可以应用于生物样品的保存和冷冻。
例如，利用这种技术可以有效冷冻保存细胞、组织和生物样品，以便后续的实验和研究。
这种冷冻技术在生物医学研究和医学应用领域具有重要的意义。
玻璃化冷冻法
玻璃化冷冻法
基本原理是将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下凝固，形成不规则
的玻璃化样固体，保存了液态时正常分子和离子分布，因而在细胞内发生
玻璃化时能起到保护作用。
所保存细胞在冷冻保护液中脱水到一定程度后，则引起内源性胞质大分子如蛋白质及渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，从而
使细胞在剧烈的快速降温中得到保护。
人类的配子和胚胎的冷冻保存已经是人工生殖领域中一个必要的部分。
在过去这二十年中，冷冻保存技术的发展亦可反映人工生殖技术的发展程度，现在的冷冻技术已可用在冷冻保存精子、卵子和不同时期的胚胎，尤
其是玻璃化冷冻技术(Vitrification)，其不仅已获得医学界广泛的认可，并渐渐取代传统慢术冷冻法，而成为冷冻技术的最佳选择，甚而将此技术
运用在高难度的卵子、卵巢组织和人类胚胎干细胞的冷冻上。
有别於慢速冷冻法在降温的冷冻过程中会形成冰晶，进而造成胚胎的
伤害，玻璃化冷冻技术的特色就是使细胞本身及冷冻溶液在冷冻时，呈现
黏稠而不产生结晶的玻璃化状态，利用这种不结冰的原理以改善慢速冷冻
之缺点。
换言之，胚胎的冷冻保存与解冻的成败与否，不单是胚胎品质的
好坏，同时必须靠冷冻保存中有无一个完全无结冰生成的冷冻过程。
而玻
璃化冷冻其高浓度冷冻保护剂和细胞间经一定时间平衡後，细胞体积可因
脱水而减少30-50%，然後将之置入冷冻器材，再直接投入液态氮中使细胞
瞬间玻璃化，在无冰晶形成下保存，以减少细胞内结冰造成伤害。
玻璃化冷冻技术通过高浓度的冷冻保护液和最小化的冷冻体积
玻璃化冷冻技术通过高浓度的冷冻保护液和最小化的冷冻体积，大大提高冷却速率，操作相对简单，尤其在囊胚冷冻方面较为成熟，因此很快得到广泛应用，但在卵裂期胚胎方面报道较
少。
玻璃化冷冻是通过高浓度的冷冻液和较快的冷却速率使液
体转变为非晶态的固化过程，优点是避免了冷冻过程中细胞内外冰晶的形成，操作简便快捷，
3.激光法：是采用1480nm的激光瞄准透明带实现瞬间打孔削薄透明带，孔径大小和打孔部位随意设置，透明带在激光作用下气化，不产生有损胚胎的物质，培养2小时后胚胎移植。
激光法的优势是操作时间短，定位准确，胚胎暴露时间短。
辅助孵化的适应症
1.FSH基础水平升高（月经第3天FSH大于15miu/ml）；
2.有IVF治疗失败史，在排除子宫内膜、胚胎质量等明
显因素时；
3.女方年龄大于37岁时；
4.透明带异常如形态不规则、透明带厚、着色深等；
5.冷冻胚胎；
6.胚胎质量差和生长速度缓慢。
辅助孵化是指人工在胚胎透明带上开孔或削薄透明带的厚度，使囊胚从透明带中顺利孵出，以帮助胚胎着床，提高妊娠率。
AH
可克服冻融胚胎透明带变硬造成的孵出障碍；冻融过程中
胚胎部分细胞受损导致活力下降，产生的能量减少不能满
足孵出需要，AH可降低其对能量的需求；AH使较早孵出
的胚胎在种植窗关闭前种植；卵裂球通过AH薄化的孔与
内膜接触释放因子促进胚胎着床。
本研究采用激光法
AH，结果激光AH组的冻融胚胎妊娠率和种植率高于对照
组(P<0．05)，提示激光AH有利于提高冻融胚胎移植周
期妊娠率和种植率，克服可能因冷冻因素导致的透明带变
硬和孵出困难。
玻璃化冷冻
玻璃化冷冻
1、玻璃冷冻原理：采用了更高浓度的冷冻保护剂处理细胞，快速降温使细胞内外液体均达到玻璃化状态。
2、玻璃冷冻分两步骤：将胚胎放入较低浓度冷冻保护剂中平衡，此过程我们可以看到细胞体积先缩小然后又重新扩大的变化。
然后将胚胎置入含较高浓度冷冻保护剂短暂平衡后，投入液氮。
3、冷冻保护剂可分为渗透性保护剂（细胞内冷冻保护剂）和非渗透性保护剂（细胞外冷冻保护剂）。
4、溶质效应：细胞外水溶液渗透压的升高会对细胞造成损伤。
5、渗透性休克：如果将胚胎直接置于相当于人体组织液渗透压的培养液中，细胞外的水分将快速进入细胞，而细胞内冷冻保护剂渗出细胞外的速度远比不上水进入细胞的速度，将造成细胞体积急剧增大甚至破裂，这种损伤称为渗透性休克。
玻璃化冷冻法介绍
慢速冷冻法即玻璃化冷冻来自于自然的启示，科学家发现某些种类的青蛙可在冬季经历零下数十度冷冻，而在春季解冻，且机体没有任何损伤。
研究认识到，这种青蛙冷冻时体内存在丙三醇，代替水作为细胞内溶剂，而在春天苏醒后体内丙三醇消失。
1985年，玻璃化冷冻鼠胚胎首先获得成功。
目前，玻璃化冷冻保存细胞已成功应用于动物卵母细胞、血细胞及胚胎，眼角膜、皮肤、血管等组织中，而人类胚胎中的应用始于1990年，目前已经获得广泛成功。
“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降温达到或低于-100℃~-110℃的温度范围时，形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。
玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态。
玻璃化冷冻技术是快速冷冻与高浓度冷冻保护剂相结合的结果。
快速冷却，低温时形成透明的玻璃状固体，冷却过程中黏度很高，但无冰晶形成，避免冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。
玻璃化冷冻主要操作步骤简单，包括：高浓度的冷冻保护剂置换细胞内外的溶液，快速降温，使溶液黏稠度极度提高并固化，放置液氮保存。
影响玻璃化冷冻效果的因素①冷冻保护剂：同一种组织细胞，冷冻保护剂的浓度和种类是最重要的一个影响因素。
细胞外冷冻保护剂一般采用大分子物质，如多糖类(蔗糖、海藻糖)、聚乙二醇、胎牛血清白蛋白(BSA)和Percoll等；细胞内冷冻保护剂为具有良好穿透性的小分子物质，如二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇。
冷冻保护剂毒性也是人们对玻璃化冷冻担心的主要问题，但迄今大量的临床和动物实验均未发现这些冷冻保存剂对动物和人类胚胎有任何不良影响；②温度下降速度：降温速度越快越好，可直接沁入液氮的方法，降温速度约为2500 ℃/min，而使用玻璃化冷冻仪降温速度可达135000 ℃/min；③胚胎载体：对胚胎载体的要求是胚胎周围的冷冻保存剂体积应尽量小，与液氮间隔尽量少，操作简便且不易丢失胚胎。
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玻璃化冷冻操作说明
1、冷冻载架和载杆做好标记
2、试剂从冰箱内拿出后室温平衡半小时使用。
3、用移液枪加70-100ul BS、ES、VS液体各一滴。
4、吸胚胎与BS中轻轻洗涤3-5次，转移到ES中。
5、胚胎在ES中1-2分钟，让胚胎自由沉到液滴底部。
6、轻轻转移胚胎的位置2次。
7、胚胎在ES中5分钟后，吸胚胎到VS中。
8、胚胎在VS中15-20秒后，吸胚胎轻轻吹吸5次左右，
轻轻的将胚胎放在载杆上，至于液氮中，从胚胎置于
VS的时间到置于液氮中，时间控制在1分钟左右，不超过1分半钟。
玻璃化解冻操作说明
1、解冻1液置于37培养箱中平衡30分钟，解冻
2、
3、4
液室温平衡30分钟。
2、找到解冻胚胎的载杆，甩一下液氮，轻轻但迅速的置于
解冻1液中1分钟。
3、胚胎在解冻2液中3分钟，中间不需要移动胚胎。
4、胚胎在解冻3液中3分钟，中间不需要移动胚胎。
5、胚胎在解冻4也中6分钟，中间轻轻转换位置3次。
6、将胚胎轻轻转移到培养液中。