玻璃化冷冻
玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞透明带超微结构变化及体外受精效果的影响
市 激 素制 品厂 ） １ ０ Ｉ Ｕ ／ 只， ４ ８ ｈ 后 注射 ｈ Ｃ Ｇ（ 宁波 市 激 素制品厂） １ ０ Ｉ Ｕ ／ 只， 于注 射 ｈ Ｃ Ｇ １ ４ ～ １ ６ ｈ 后 取 输 卵 管 膨大部， 收集 卵丘卵 母 细胞 复合 体 （ Ｃ Ｏ Ｃ ｓ ） 。将 Ｃ Ｏ Ｃ ｓ 移 入 含３ ０ ０ Ｉ Ｕ ／ ｍ Ｌ 透 明质 酸酶 的Ｍ２ 溶液 中３ ～ ５ ａ ｒ ｉ ｎ 脱 去 卵丘 颗粒 细 胞 ， 收集 形 态 正常 ， 胞质均匀 ， 有 第 一 极 体排 出的卵母 细胞 供实 验用 。 １ ． ３ 卵母 细胞 玻璃 化冷冻 与解 冻 １ ． ３ ． １ 开放式拉 细麦管（ Ｏ Ｐ Ｓ ） 的制备 将０ ． ２ ５ ｍ Ｌ
鼠（ 军 事 医学科学 院 实验动 物 中心 ） 饲 喂 于控光 条件
下（ 光照１ ４ ｈ ， ０ ５ ： ０ ０ ～１ ９ ： Ｏ ０ ） ， 自由采食饮 水 。 １ ． ２ 卵母 细 胞 的收 集 小 鼠腹 腔注 射 Ｐ ＭＳ Ｇ（ 宁 波
身体 积 大 、表 面 积小 、对 低 温 敏感 性 高 的特 点 ， 至 今 ，卵母 细胞 冷冻 保存 仍 然存 在 着 冷 冻一 解 冻 后 其 受精 率及 胚胎 发育率 低 等 问题 。突 出表 现在 冷冻 会
卵母 细 胞冷 冻 保存 突破 了时 间和 空 间 的 限 制 ，
孔 提高 受精 率 ， 证 实 小 鼠 卵明带 的变化 引起 的 。 但 玻璃 化 冷冻 后
卵 母 细 胞 超微 结构 发 生何 种 程 度 的 变 化会 引 起 受
可实现长期保存 ， 建立“ 卵子 库 ” ， 既 减少 了 因活 体
紫杉醇在猪体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻中的作用探讨
（ Ａｎ ｍａ ｕ ｂ ｎ ｒ ｎ ｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ｉ ｓｉｕ ｅ Ｓ ｉ ｌ ｓ ａ ｄ ｙ ａ ｄ Ｖ ｔ ｒ ｎ ｒ ｓ ａ ｃ ｎ ｔ ｔ ｔ ， ＡＡＳ， ｈ ｎ ｈ ｉ２ １ ０ Ｃｈ ｎ ｈ Ｓ ａ ｇ ａ ０ １ ６， ｉ ａ；
。 ｈ ｎ ｈ ｉ ｙＬ ｂ ｒｔｒ ｆＡｇ ｉ ｅｅｉｓ ｎ ｅｄ ｎ Ｓ ａ ｇ ａ ０ １ ６ Ｃ ｉａ Ｓ ａ ｇ ａ ａ ｏａｏｙｏ ｒ— ｎｔｃ ａ ｄＢｒｅ ｉｇ， ｈ ｎ ｈ ｉ １ ０ ， ｈｎｃ ｎ ｒ ｌｏ ｃ ｔ ｓ ７ ． ２ ａ ｄ ７ ． ７ ） ａ ｄ ｗｈ ｎ ｔ ｅ ｐ ｅ ｒ ａ ｉ ｇ ｔｍｅ ｗａ ０ ｍｉ ｔ ｅ ｈ ｎ ｔ ｏ ｅ ｏ ｏ ｔｏ ｏ ｙ ｅ （ ９ １ ％ ｎ ０ ９ ％ ； ｎ ｅ ｈ ｒ ｔｅ ｔ ｉ ｓ３ ｎ， ｈ ｎ
ｒｓｅ ｔ ｅｙ９ ． ａ ｄ８ ． ． ｏｉ ｗａ ｐ ｒ ｐ ｉｔ ｒｔｅ ｔ ｈ ｏ ｙｅ ｔ ． ｍｏ／ ａ ｏ ｅｐ ｃｉ ｌ ０ ２ ％ ｎ ４ １ ％ Ｓ ｓ ｐｏ ｒ ｅｔ ｐ ｅｒａ ｅｏ ｃ ｔｓ ｈ １ ０ｔ ｌ ｔｘ ｌ ｖ １ ３ ｔ ａ ａ ｏ ｔ ｗｉ ￣ Ｌ
ＷＡＮＧ Ｌ ｉ ， ｅ ’ ＹＡＮＧ Ｓ ａ － ｎ ～， ＡＩ ｉｎｊｎ＇ ， ｈ ｎｔ ｇ’ Ｄ ａ － ｗＵ ａ－ｅ ｇ～， ｉ Ｊ ｕ Ｃ ｉ ｎ ｆ
Ｚ Ｈ Ａ Ｎ Ｇ ｎｇ ｙ ． Ｔｉ — ｕ ＺＨ Ａ Ｎ Ｇ － ｕ ’ Ｄｅ ｆ
牛卵母细胞的玻璃化冷冻研究
・
１ ８・
中国奶牛 －０６年第 １ 期 ２０ １
牛卵母细胞的玻璃化冷冻研究
霍飞 海丽且木 ， ， 一 陈静波 ， 一 杨焰 肖海霞 王玉红 ， ，
（． １ 新疆农业大学动物科学学院， 乌鲁木齐 ８０ ５ ；． ３０ ２ ２ 新疆天康 畜牧生物技术股份有 限公司， 乌鲁木齐 ８ ００ ； ３０ ０ ３新疆畜牧科学院， ． 乌鲁木齐 ８０ ０ ） ３ ００
轻拉至长度为约 ３ ｃ ０ｍ时， 保持拉力数秒以待细管回冷变 硬， 最后从中问用锋利的刀片切断， 将细管的头部切除， 得
到了两根细管。制作好的细管用 ７％ ５ 的酒精浸泡过夜消毒， 自 然千 寺 直径约 ０ ｒ ）玻璃 Ｏ Ｓ 佣（ ．ｍ。 ８ ａ Ｐ 管管径为 ０ ｍ 。 ． ｍ ３
１２ 方 法 ．
１８ 年 Ｒ ｌ和 Ｆｈ 玻璃化 冷冻保存法的发明［不但 ９５ ａ ｌ ａｙ ６ ３ ， 大大地将操作时间缩短到了 ３ｍ ｎ 内， ０ ｉ之 而且方法简易， 设备简单， 容易在生产中推广使用， 并且为卵母细胞的冷 冻保存提供了有效手段， 日益受到人们的重视， 已 因而 并
解冻液
： ０ ５ ｏＬ的蔗糖溶液； ＷＭ 为 ． ｍ ｌ ２ ／ ＷＭ 为
细胞 的一端直接浸入 ＷＭ 中平衡 １ ｉ。 ｍｎ 然后用捡胚针 将卵母细胞移人 ＷＭ 中平衡 ５ ｉ。 ｍｎ 再用成熟培养液洗 ３ ， 遍 然后移人体外受精液中准备进行体外受精。 １ 统计分 析 ． ３
收稿 日期 ：０６ ０— ８ ２０ — ６ ２
维普资讯
１１１ 卵母细胞 ．．
将屠宰场获得的牛卵巢置于 ３ 。 ５Ｃ的取卵巢液 中， 在３ ｈ内带 回实验室 。 用取卵巢液冲洗卵巢 ３ 遍后用一 次性 ｌｍ 注射器采用负压抽取法从卵巢表面 ２ ８ ｍ ＯＬ ｍ 的卵泡 中抽取卵泡液， 注入灭菌捡卵皿中。 在体视镜下 捡出 ｌ 层颗粒细胞 以上 、 透明带完整 、 胞质均匀的卵母 细胞 。将卵母细胞在成熟培养液中洗 ３ 遍后放人培养
玻璃化冷冻法保存关节软骨
玻璃化冷冻法保存关节软骨宋洪强;玄燕华;吴雅迪;亓建洪【摘要】背景：同种异体骨软骨移植技术是治疗关节软骨缺损有效的方法之一，但由于移植物保存方法不理想，明显制约着该技术的临床应用.目的：探讨玻璃化冷冻法保存关节软骨组织的可行性和优越性.方法：切取成年猪骨软骨，制成约5 mm×6 mm(直径×长度)大小的圆柱形骨软骨块.以新鲜软骨组为对照，分别采用0.5 mol/L 甘油、1 mol/L 二甲基亚砜、1 mol/L 玻璃化溶液3种方法预处理软骨块，再行冷冻法保存软骨块8周，采用组织化学染色、免疫荧光染色观察并比较软骨细胞活性的变化.结果与结论：玻璃化溶液预处理组的关节软骨细胞存活率达到74.5%，明显高于甘油和二甲基亚砜预处理组，软骨基质成分仅少量丢失.3种方法相比较，玻璃化溶液预处理后慢速梯度降温冷冻保存法可以明显提高冻存关节软骨组织的活性.%10.3969/j.issn.2095-4344.2012.46.013【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2012(000)046【总页数】5页(P8615-8619)【关键词】玻璃化;梯度降温;关节软骨;冷冻保存;细胞活性【作者】宋洪强;玄燕华;吴雅迪;亓建洪【作者单位】泰山医学院运动医学研究所,山东省泰安市271000;泰山医学院附属医院,山东省泰安市271000;泰山医学院运动医学研究所,山东省泰安市271000;泰山医学院运动医学研究所,山东省泰安市271000【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言同种异体关节软骨移植，能够将完整的正常关节软骨植入缺损处，提供完整而有活性的软骨组织，恢复关节外形，达到修复关节软骨缺损的目的[1-2]，尽管取得了一定的成功，但由于移植物保存方法不理想，明显制约着该技术的应用，如何保存全层软骨组织的细胞高活性，是移植成功的关键。
玻璃化冷冻法已被广泛应用于多种组织、细胞的保存及应用，如胚胎、精子、血管、肾脏、肌腱、气管(纤维软骨)、组织工程骨等[3-9]。
4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化保存效果
㊀㊀基金项目:广东省珠海市医学科研基金资助项目(20191208A010071)作者单位:519100㊀遵义医科大学第五附属(珠海)医院烧伤整形手外科通信作者:陈世玖,电子信箱:csj6916@4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化保存效果李㊀智㊀戴依娜㊀王㊀成㊀陈世玖摘㊀要㊀目的㊀评估二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)㊁甘油㊁丙二醇㊁乙二醇玻璃化法保存人指固有神经中的保护效果,筛选合适的人指固有神经冷冻保护剂㊂方法㊀取截肢手术后患者放弃肢体的指固有神经,分为实验组(30%DMSO 组㊁甘油组㊁乙二醇组㊁丙二醇组)和空白对照组进行玻璃化法于液氮(-196ħ)中保存3周㊂复温后进行光学显微镜观察㊁共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测㊁指固有神经片段的神经生长因子(nerve growth factor,NGF)检测㊂结果㊀光镜观察:空白对照组神经鞘膜结构模糊,神经纤维排列疏松㊁紊乱;实验组神经鞘膜较为完整,神经纤维排列相对整齐㊁紧凑㊂LSCM 结果:采用钙黄绿素-AM (calcein -AM)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色后空白对照组神经纤维绿色荧光强度较弱,红色荧光强度较强㊂实验组绿色荧光较空白对照组均增强,红色荧光强度均减弱㊂ELISA 检测结果:空白对照组12.95ʃ3.03pg /ml㊁乙二醇112.64ʃ3.54pg /ml㊁30%DMSO109.51ʃ9.98pg /ml㊁甘油61.47ʃ3.34pg /ml㊁丙二醇62.53ʃ3.64pg /ml㊂结论4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化法保存均有保护作用,其中乙二醇效果最佳,更适合用于人指固有神经玻璃化保存㊂关键词㊀冷冻保护剂㊀人指固有神经㊀周围神经损伤㊀玻璃化保存中图分类号㊀R658㊀㊀㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀㊀㊀DOI ㊀10.11969/j.issn.1673-548X.2022.07.023Experimental Study on Cryopreservation of Human Proper Digital Nerve by Vitrification with Four Cryoprotective Agents Abstract.LI zhi ,DAI Yina ,WANG Cheng ,et al.Department of Plastic and Hand Surgery ,The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University ,Zhu-hai ,Guangdong 519100,ChinaAbstract ㊀Objective ㊀To evaluate the protective effect of dimethyl sulfoxide (DMSO),glycerol,propylene glycol and ethylene gly-col vitrification in the preservation of human finger proper nerve,and to screen a suitable cryoprotective agent for human finger proper nerve.Methods ㊀The proper digital nerves of the limbs abandoned after amputation were divided into experimetal group (30%DMSO group,glycerol group,ethylene glycol group,propylene glycol group)and blank control group.They were vitrified and stored in liquid ni-trogen (-196ħ)for 3weeks.After rewarming,optical microscope observation,confocal microscope (LSCM )detection and nerve growth factor (NGF)detection of finger intrinsic nerve segments were carried out.Results ㊀Light microscope observation:in the blank control group,the structure of nerve sheath was fuzzy,and the arrangement of nerve fibers was loose and disordered;the nerve sheath in the experimental group was relatively complete,and the nerve fibers were arranged relatively orderly and compact.LSCM results:After calcein AM /PI double staining,the green fluorescence intensity of nerve fibers in the blank control group was weak and the red fluores-cence intensity was strong;the green fluorescence of the experimental group was stronger than that of the blank control group,and the red fluorescence intensity was weaker.ELISA results:In blank control group,the results were 12.95ʃ3.03pg /ml,ethylene glycol 112.64ʃ3.54pg /ml,30%DMSO 109.51ʃ9.98pg /ml,glycerol 61.47ʃ3.34pg /ml,propylene glycol 62.53ʃ3.64pg /ml.Conclusion ㊀The four cryoprotectants have protective effects on the vitrification preservation of human finger proper nerve,and ethylene glycol is the best,which is more suitable for the vitrification preservation of human finger proper nerve.Key words ㊀Cryoprotective agents;Human proper digital nerve;Peripheral nerve injury;Vitreous preservation㊀㊀全球急性手外伤发生率为0.15ɢ~3.15ɢ,手部神经损伤将导致神经传导中断,会导致肌肉萎缩失去功能㊁感觉功能障碍,造成手部功能丧失,严重影响患者生活质量[1]㊂修复手部损伤神经㊁重建手部神经功能意义重大㊂同种异体神经移植是理想的治疗方案㊂本研究以患者放弃肢体的指固有神经作为研究对象,旨在评估甘油㊁二甲基亚砜㊁乙二醇㊁丙二醇4种冷冻保护剂(cryoprotective agents,CAPs)的玻璃化保存效果,为人指固有神经玻璃化法保存提供一定的理论依据㊂对象与方法1.标本来源及处理:取在遵义医科大学第五附属㊃501㊃(珠海)医院因外伤行截肢手术后患者放弃的肢体(共6例上肢,腕部水平离断1例,前臂离断3例,上臂离断1例,肩部离断1例),患者无高血压㊁糖尿病及周围血管神经病变㊂肢体置于无菌操作台,剥离指固有神经至远端指间关节,剪成长度为1cm 的神经片段,共75个片段,随机分为5组(4个实验组分别为30%DMSO 组㊁甘油组㊁乙二醇组㊁丙二醇组和1个空白对照组)㊂2.玻璃化保存:以胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)㊁RPMI1640培养液㊁各组对应种类CAPs,按体积比为1ʒ6ʒ3配置玻璃化冻存液㊂处理分组后的神经片段分别放入装有4ħ预冷的对应组的冷冻保护剂的冻存管中,在4ħ中平衡30min,-20ħ平衡2h,于-80ħ冰箱过夜后投入液氮罐内深低温保存3周㊂3周后取出,直接放入40ħ的水浴中快速复温,复温后加入含有0.5mol /L 的蔗糖溶液中,洗脱10min,0.25mol /L 蔗糖溶液,再次洗脱10min㊂3.HE 染色光学显微镜观察:每组取出5个标本,各截取0.5cm 进行常规脱水固定㊁石蜡包埋㊁切片㊂按试HE 染色剂盒(美国博士德生物公司)说明书进行染色操作,在400倍光学显微镜(日本Olympus 公司)下观察神经组织结构㊂4.玻璃化保存指固有神经的组织结构观察:取0.5cm 长度神经标本,各组5条,按Calcein -AM /PI 活细胞/死细胞双染色试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)说明书进行孵化染色,防荧光淬灭剂封片,TCS -SP2型激光扫描共聚焦显微(德国Leica 公司),分别在490nm㊁545nm 波长下观察荧光强度㊂ 5.神经体外培养:复温后指神经Hankᶄs 液洗涤3次,置于8孔细胞培养板的培养孔中,每孔2.5ml 含有10%胎牛血清,100U /ml 链霉素的H -DMEM 培养基,37ħ㊁5%CO 2培养箱内培养7天,每2天更换培养液1次㊂6.ELISA 法检测玻璃化保存后神经的NGF:取培养后神经用0.01mol /L 的PBS 液冲洗,称取湿重,按200mg 组织加入1ml 三蒸水的比例,进行组织匀浆,2500r /min 离心20min 后,取上清液㊂严格按照人神经生长因子ELISA 试剂盒(美国博士德生物公司)说明书操作,依照试剂盒说明及标准品浓度,建立标准曲线,每组设置3个复孔㊂在波长450nm 酶标仪(美国PerkinElmer 公司)上测定A 值;以A 值为纵坐标,标准品浓度横坐标,建立标准曲线,根据样品A 值找出对应浓度㊂7.统计学方法:采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析,计量资料以均数ʃ标准差(x ʃs )表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD 法,以P <0.05为差异有统计学意义㊂结㊀㊀果1.玻璃化保存指固有神经组织结构:HE 染色后光镜下观察,空白对照组神经鞘膜结构散乱,神经纤维排列疏松㊁紊乱,局部有脱髓鞘改变;甘油组㊁丙二醇组神经鞘膜偶见断裂,神经纤维结构较松散,脱髓鞘改变均较轻;30%DMSO 组间神经鞘膜完整性更好,神经脱髓鞘改变更轻;乙二醇组神经鞘膜最完整,神经纤维排列整齐㊁紧凑,脱髓鞘改变最轻(图1)㊂图1㊀玻璃化保存3周人指固有神经病理切片(HE,ˑ400)A.空白对照组;B.乙二醇组;C.30%DMSO 组;D.甘油组;E.丙二醇组㊀㊀㊀2.玻璃化保存指固有神经生物活性:Calcein -AM /PI 双染色,激光共聚焦显微镜观察,结果显示,空白对照组神经纤维绿色荧光(代表活细胞)轻度较弱,红色荧光(代表死细胞)强度较强,且广泛分布;实验组与空白对照组比较,绿色荧光较强,红色荧光弱;实验组内,甘油组及丙二醇组神经荧光强度相似,绿色荧光强度最弱,红色荧光强度最强;30%DMSO 组于前两组比较绿色荧光较强,红色荧光较弱;乙二醇组绿色荧光最强,红色荧光最弱,分布范围有限(图2)㊂㊃601㊃图2 人指固有神经激光扫描共聚焦显微(Calcein-AM/PI,ˑ400)A.空白对照组;B.乙二醇组;C.30%DMSO组;D.甘油组;E.丙二醇组㊀㊀㊀3.ELISA法检测培养神经的神经生长因子(NGF)水平:人指固有神经玻璃化保存3周后,空白对照组NGF(12.95ʃ3.03pg/ml)水平最低,其次是甘油组(61.47ʃ3.34pg/ml)㊁丙二醇组(62.53ʃ3.64pg/ ml)㊁30%DMSO组(109.51ʃ9.98pg/ml),乙二醇组(112.64ʃ3.54pg/ml)NGF水平最高;空白对照组与4个实验组间比较,差异均有统计学意义(P均< 0.05)㊂实验组间比较,甘油组与丙二醇组比较,差异无统计学意义(P>0.05),其余各实验组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)㊂讨㊀㊀论周围神经损伤是创伤外科较为棘手的问题,自体神经移植作为神经损伤修复金标准[2]㊂受到供区并发症㊁取材长度限制㊁神经直径匹配度低等限制[3~5]㊂同种异体神经具有天然的神经结构,提供适合神经再生的基质及生长因子,其来源广泛㊁匹配度高,在周围神经损伤治疗中具有优势[6~8]㊂深低温保存技术能有效地降低异体移植的免疫原性,延长移植神经的时效性㊂但降温过程对细胞及组织却是致命打击㊂细胞外冰晶形成导致细胞溶质浓度增高,造成细胞脱水㊁细胞膜结构及蛋白功能受损,形成 溶质损伤 ,细胞内冰晶直接导致细胞死亡[9~11]㊂玻璃化保存通过高浓度CAPs及超高的冷却速率,使细胞内外液体形成玻璃态,从而有效避免冰晶形成[12,13]㊂渗透性CAPs通过提升液体玻璃化转换温度及降低溶剂冰点,减少了降温过程中细胞内外冰晶[14]㊂解冻过程中渗透性CAPs 还可以抑制冰晶再形成导致的二次损伤,进一步保护组织复温后的组织结构㊂不同CAPs对组织保护效果存在差异,因其发挥作用的机制不同,DMSO与丙二醇通过改变双分子层的排列进而起到细胞保护作用,甘油与乙二醇则通过与磷脂分子形成氢键发挥保护作用[10,14]㊂周围神经损伤后的再生过程中施万细胞(schwann cells,SCs)发挥积极作用㊂损伤后SCs失去轴突支配,成熟的SCs通过基因调控去分化为具有修复状态的祖细胞,称为修复施万细胞[15]㊂修复施万细胞引起髓鞘自噬,募集巨噬细胞清除损伤神经断端周围的组织碎片,减缓局部炎性反应,为神经轴突再生提供合适环境[16]㊂同时神经断端间由巨噬细胞㊁嗜中性粒细胞㊁成纤维细胞等形成 神经桥 ,SCs 沿着神经桥生长形成中控管道,为轴突再生提供支架㊂SCs生长过程中分泌大量的神经生长因子,营造再生微环境㊂自体神经移植联合SCs移植修复神经损伤能有效修复运动功能与感觉功能[17,18]㊂根据神经营养因子表达差异,SCs可分为运动型施万细胞和感觉型施万细胞,NGF㊁血管内皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1在感觉神经施万细胞中高表达㊂研究发现,感觉型施万细胞对运动神经与感觉神经在再生具有较强的引导作用,这是由于NGF的受体TrkA仅在感觉神经中表达引起,所以NGF的浓度水平可以反映诱导感觉神经再生的能力[19]㊂周围神经损伤发生后神经断端的NGF表达上调后:①促进SCs引起髓鞘自噬,推进髓鞘碎片的清除;②引导SCs沿 神经桥 迁移,协助再生神经支架形成;③为新生轴突提供合适的再生微环境,促进轴突再生;④促进修复施万细胞的再髓鞘化,由此可见, NGF是神经再生微环境中重要的组成部分㊂而微环境中较高浓度的NGF可以维持神经的再生状态[20,21]㊂人造神经支架由于缺少合适的再生微环境,其修复能力弱于自体神经移植,当加入外源性神经生长因子后神经再生速率与准确性得到明显提升[22]㊂研究发现,CAPs可以改变玻璃化冻存的细胞线粒体mRNA的表达,SCs对NGF分泌作用受多种基因信号调控,本实验中,不同组神经组织匀浆中㊃701㊃NGF的含量差别可能与CAPs对SCs活性的保护作用有关,同时不能排除CAPs对SCs内NFG分泌相关基因调控的影响[23,24]㊂综上所述,同种异体神经移植作为理想的修复材料,玻璃化保存可延长使用时限㊂本实验结果证实,4种CAPs对人指固有神经的玻璃化法保存均有保护作用,其中乙二醇效果最佳,更适合用于人指固有神经玻璃化保存㊂本研究旨在为人指固有神经玻璃化保存提供一定的理论基础,希望后续可以找到更加适合人指固有神经的玻璃化保存方法,为周围神经损伤再生修复提供新的治疗手段㊂参考文献1㊀薛刚,蔺亚平.手外伤严重程度评估系统与术后患者手功能相关性研究[J].陕西医学杂志,2020,49(1):83-862㊀李兵仓.周围神经损伤的外科学处理[J].创伤外科杂志,2020, 22(11):864-8693㊀Nadia,Rbia,Alexander,et al.The role of nerve graft substitutes in motor and mixed motor/sensory peripheral nerve injuries[J].Journal of Hand Surgery,2017,42(5):367-3774㊀Silva JB,Marchese GM,Cauduro CG,et al.Nerve conduits for trea-ting peripheral nerve injuries:a systematic literature review[J].Re-tour Au Numéro,2017,36(2):71-855㊀Lovati AB,Dᶄarrigo D,Odella S,et al.Nerve repair using decellu-larized nerve grafts in rat models.a review of the 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胚胎玻璃化冷冻技术治疗不孕症1例
于 ２１ ０ ０年 ９月来南 昌大 学 第一 附属 医 院辅 助 生殖 科 就诊 。患者 平 素 月 经 规 律 ， 生 活 正 常 ； 夫 ３ 性 丈 １
以备 移植 ］ 于 ２ １ ， ０ １年 １月 １ ６日行 第 ２次 胚 胎 移
植。
岁， 精液 检查 多次 提示 无 精 子 ， 睾 丸 穿刺 检 查 示 ： 行
３ 讨 论
玻 璃化 冷冻 技术是 一种 快速 冷冻 细胞或 组织 的 方法 ， 可避 免冻融 过程 中细胞 内冰晶 的形 成 ， 最大 限
亚砜 、． 乙 二 醇 、 ２ ｇ・Ｌ １ 白蛋 白） ， 置 ７５ １ －人 中 放 ５ｍｉ， 察胚胎 一次 皱缩 至扩 张 的过程 。然 后移 至 ｎ观
０ ０ Ｌ １ ． １ｇ・ － 庆大 霉 素 、 ５ 二 甲基 亚 砜 、 ５ 乙二 １ １ 醇 、２ｇ・ 人 白蛋 白、 ． １ Ｌ ０ ６ｍｍｏ 蔗糖 ） ， ９ ｌ 中 在 ０Ｓ 内移至半 封 闭式麦 管 中 ， 即放入 液氮 中保存 。 立
该 患 者 新 鲜 周 期 移 植 后 未 获 得 临 床 妊 娠 ， 求 要
右 附睾 活动 精 子 ０ １ ＨＰ 活 力 ｂ ～ ／ ， —Ｃ级 。夫 妇 双 方要 求行 “ 管婴儿 ” 试 助孕 治疗 。本 病例选 择及 发表 经 医院伦 理委 员会许 可 ， 签署 了患 者知 情 同意书 。 并
１ ２ 方 法 ．
胚胎冻融原理及技术进展
② 预平衡液ES：以BS为基础液配制7.5%DMSO+7.5%EG ③玻璃化冷冻液VS：以BS为基础液配制15%DMSO+15%EG+0.5MSucrose
2.从原核到囊胚阶段胚胎的玻璃化冷冻
预平衡
玻璃化
囊胚冷冻前进行人工皱缩( 对滋养细胞层进行激光穿刺，使囊胚腔内液体流出，囊胚腔 塌陷，再进行冷冻减少冰晶的产生) 后再行冷冻。
Rienzi L, Gracia C, Maggiulli R, et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Hum Reprod Update. 2017 ;23(2):139-155.
保护剂毒性。 开放载体：交叉污染。
对细胞超微结构的影响：玻璃化冷冻时巨大 的渗透压变化及高浓度冷冻保护剂会引起滋 养细胞微绒毛数量的减少，对质膜、线粒体 和粗面内质网等细胞器都可能造成影响。 操作机械性损伤：人为技术熟练程度；激光 辅助也可能会因其热效应而影响胚胎发育。
六、胚胎解冻
4. 囊胚期细胞慢速冷冻流程
脱水程序
• 5%glycerol，10min； • 9%glycerol/0.2mol/L sucrose， 10min； • 装入含0.5ml 9%glycerol 0.2mol/L sucrose冷冻保护溶 液的冷冻管中。 • 上机。
程序化和玻璃化冻融人卵裂期胚胎的临床应用效果比较
2016.08171生殖健康疗效2例，整体治疗有效率为91.37%；顺铂组58例病患的病情情况中，完全缓解的有21例，病情部分缓解的有24例，稳定不变的有8例，稍有进展的疗效5例，整体治疗有效率为77.59%；对照组58例病患的病情情况中，完全缓解的有16例，部分缓解的有21例，稳定不变的有13例，病情稍有进展的疗效8例，整体治疗有效率为63.79%。
三组数据中，奈达铂组和顺铂组的整体治疗有效率明显高于对照组；对比具有显著差异性，满足统计学意义（P<0.05）。
如表1所示。
2.2 整体不良反应发生率根据对比结果显示，整体不良反应发生情况对比方面，奈达铂组58例病患中，无不良反应的有52例，轻度不良反应的有3例，病患可忍受的不良反应的有2例，病患不可忍受的不良反应的的有1例，严重不良反应的有0例病，整体不良反应发生率为10.34%；顺铂组58例病患中，无不良反应的有41例，轻度不良反应的有9例，病患可忍受的不良反应的有4例，病患不可忍受的不良反应的的有3例，严重不良反应的有1例病，整体不良反应发生率为29.31%；对照组58例病患中，无不良反应的34例，轻度不良反应的有11例，病患可忍受的不良反应的有6例，病患不可忍受的不良反应的的有5例，严重不良反应的有2例病，整体不良反应发生率为41.38%。
组数据中，奈达铂组和顺铂组的整体不良反应发生率明显高于对照组；对比具有显著差异性，满足统计学意义（P<0.05）。
如表2所示。
3 讨论综上所述，在展开奈达铂化疗联合同期放疗、顺铂化疗联合同期放疗、单纯放疗治疗中晚期宫颈癌对比中：在整体治疗效果对比方面，奈达铂组58例病患整体治疗有效率为91.37%；顺铂组58例病患整体治疗有效率为77.59%；对照组58例病患整体治疗有效率为63.79%。
在整体不良反应发生情况对比方面，奈达铂组58例病患整体不良反应发生率为10.34%；顺铂组58例病患整体不良反应发生率为29.31%；对照组58例病患整体不良反应发生率为41.38%。
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玻璃化冷冻
1、玻璃冷冻原理：采用了更高浓度的冷冻保护剂处理细胞，快速降温使细胞内外液体均达到玻璃化状态。
2、玻璃冷冻分两步骤：将胚胎放入较低浓度冷冻保护剂中平衡，此过程我们可以看到细胞体积先缩小然后又重新扩大的变化。
然后将胚胎置入含较高浓度冷冻保护剂短暂平衡后，投入液氮。
3、冷冻保护剂可分为渗透性保护剂（细胞内冷冻保护剂）和非渗透性保护剂（细胞外冷冻保护剂）。
4、溶质效应：细胞外水溶液渗透压的升高会对细胞造成损伤。
5、渗透性休克：如果将胚胎直接置于相当于人体组织液渗透压的培养液中，细胞外的水分将快速进入细胞，而细胞内冷冻保护剂渗出细胞外的速度远比不上水进入细胞的速度，将造成细胞体积急剧增大甚至破裂，这种损伤称为渗透性休克。