新技术玻璃化冷冻
玻璃化冷冻度
玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。
各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。
人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。
玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。
解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。
C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。
比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。
冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。
这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。
玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。
冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。
玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存技术摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。
关键词：胚胎冷冻保存为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。
这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。
目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
现有的胚胎冷冻保存方法有四种：一、常规冷冻法常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。
将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。
冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。
胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。
或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。
二、一步冷冻法一步冷冻法：也叫一步细管法。
该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。
三、程序冷冻法程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。
主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。
玻璃化在食品加工中的应用
玻璃化在食品加工中的应用1. 玻璃化技术简介玻璃化是将物料在高温下加热至熔点以上并迅速冷却，以产生具有玻璃状态特征的过程。
这种技术经常用于食品加工上，可改善食品的保质期、口感、颜色、味道等方面。
2. 玻璃化在冷藏冷冻食品中的应用冷藏冷冻食品的保质期较短，使用玻璃化可以将食品中的水分迅速冷凝成微小颗粒，使得其不能转化为冰晶，从而避免食品冻结所带来的负面效应。
使用这种技术可以延长冷藏冷冻食品的保质期并保持其质量。
3. 玻璃化在干果和坚果中的应用干果和坚果中含有许多油脂，而油脂在加热后容易氧化并变质。
使用玻璃化技术可以将水分和油脂分离，从而避免松脆度下降和口感变质。
这种技术能够使得干果和坚果保持其优质口感并延长其保质期。
4. 玻璃化在肉类和海鲜中的应用肉类和海鲜中含有大量水分，容易导致营养成分流失，并且容易腐败。
使用玻璃化技术可以将水分转化为微小颗粒，避免水分的流失和导致腐败。
同时，这种技术还可以改善食品的口感和质地，使得食品更加美味。
5. 玻璃化在糕点和糖果中的应用糕点和糖果中往往含有大量的糖分，这些糖分容易受潮而导致粘连。
使用玻璃化技术可以将水分转化为微小颗粒，避免糖分的潮湿和降低其黏性。
同时，这种技术还可以改善糕点和糖果的外观和口感，使其更加美味。
6. 总结玻璃化技术在食品加工中具有重要的应用价值。
通过玻璃化技术，可以改善食品的口感、质感、颜色和保质期等方面，从而提高食品的品质和市场竞争力。
未来，玻璃化技术将进一步推广和应用于食品加工行业，为消费者提供更加高品质的食品。
一种玻璃化冷冻装置及使用方法[发明专利]
![一种玻璃化冷冻装置及使用方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a72e21e0763231126fdb11cd.png)
专利名称：一种玻璃化冷冻装置及使用方法专利类型：发明专利
发明人：饶金鹏,金敏,金帆,赵青威,张富
申请号：CN201910608969.X
申请日：20190708
公开号：CN110521719A
公开日：
20191203
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种玻璃化冷冻装置及使用方法，涉及辅助生殖技术领域，所述装置包括若干个沿第一方向依次设置的腔室，相邻两个腔室之间通过通道连通，且通道上设有可控制通道的通断的开关部；腔室的腔底包括沿第一方向依次设置的第一底面和第二底面，第一底面是沿第一方向倾斜下降的斜坡面，第二底面是平面，第一底面和第二底面连接，且第二底面低于第一底面。
本发明解决了现有技术中由于保护剂浓度的剧烈变化，造成体外操作的卵母细胞/胚胎产生不利的应激性影响的问题，使得冷冻时细胞内外液置换过程更加柔和、安全，从而有效提高了冷冻效果，有利于最终的临床妊娠。
申请人：浙江大学
地址：310013 浙江省杭州市西湖区浙大路38号
国籍：CN
代理机构：浙江千克知识产权代理有限公司
代理人：冷红梅
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玻璃化冷冻技术的研究进展
玻璃化冷冻技术的研究进展
丛晶;吴效科
【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》
【年(卷),期】2008(27)3
【摘要】玻璃化冷冻技术是一种快速冷冻细胞或组织的方法,随着辅助生殖技术的发展而受到广泛关注.该项技术具有冷冻速度快、冻融损伤小,操作简单等优点,能够提高冷冻复苏后的存活率和妊娠成功率.玻璃化冷冻技术在临床应用中主要受到冷冻保护剂的类型和浓度、冷冻温度、冷冻速度及冷冻承载工具等一系列因素的影响.由于冷冻对象的不同,所实施的具体方法也不尽相同.该技术目前尚未成熟,如何优化人卵母细胞、胚胎及卵巢组织的玻璃化冷冻方案仍需要进行深入的研究.
【总页数】4页(P151-154)
【作者】丛晶;吴效科
【作者单位】黑龙江中医药大学附属第一医院妇产科,150040;黑龙江中医药大学附属第一医院妇产科,150040
【正文语种】中文
【中图分类】R71
【相关文献】
1.人卵巢组织玻璃化冷冻技术研究进展
2.玻璃化冷冻技术与程序化冷冻技术在人类辅助生殖技术中的地位
3.牛胚胎玻璃化冷冻技术研究进展
4.玻璃化冷冻技术积累卵母细胞在卵巢低反应患者中的应用分析
5.玻璃化冷冻技术的应用及研究进展
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玻璃化冷冻技术名词解释
玻璃化冷冻技术名词解释
玻璃化冷冻技术是一种用于将食物或其他物品冷冻保存的技术。
它涉及将食物或物品迅速冷冻到极低的温度，以使其成为类似玻璃状的状态，从而防止冰晶的形成和物品的结晶化。
这种技术可以延长食物的保质期，并且可以在冷冻后保持食物原有的质地、口感和营养成分。
玻璃化冷冻技术的原理是在极低温下将物品迅速冷冻，使得其水分在冷冻过程中成为非晶态状态，而不是结晶状态。
这样可以避免冰晶的形成，从而减少对食物细胞结构的破坏，同时也减少了食物在解冻后的水分流失。
此外，玻璃化冷冻技术还可以应用于生物样品的保存和冷冻。
例如，利用这种技术可以有效冷冻保存细胞、组织和生物样品，以便后续的实验和研究。
这种冷冻技术在生物医学研究和医学应用领域具有重要的意义。
人类卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展
人类卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展在过去的几十年里，人类卵母细胞的玻璃化冷冻（vitrification）技术一直是生殖医学领域的一个研究热点。
玻璃化冷冻是一种冷冻技术，通过迅速降低温度并添加特殊冷冻剂，将细胞内的水分转化为无结晶的玻璃态，从而避免了冷冻过程中因冰晶形成而对细胞结构和功能造成的损伤。
人类卵母细胞是女性生育力的关键组成部分，但由于其细胞壁的特殊结构和一些衰老因素的影响，卵母细胞的冷冻保存一直是一个具有挑战性的任务。
然而，玻璃化冷冻技术的广泛应用为保存和储存卵母细胞提供了一种有效的方法。
近年来，许多研究致力于改善人类卵母细胞的玻璃化冷冻技术。
首先是冷冻剂的选择。
传统的冷冻剂通常包括甘露醇和丙二醇等，它们可以降低细胞内水分的冻结点，减少冷冻过程中对细胞的损伤。
然而，这些常规冷冻剂的使用还是会引发一定的细胞损伤，因此需要寻找更适合的替代品。
最近有研究发现，抗冻裂脱水剂（cryoprotectants）能够更有效地保护卵母细胞，如聚胺基酸和聚糖等。
其次是玻璃化冷冻的整个过程中对卵母细胞的处理。
近年来，研究者们发现，在卵母细胞冷冻之前，对细胞进行一定时间的预处理，能够减少其在冷冻过程中的受损程度。
例如，细胞的快速预冷冻过程能够减少其在冷冻时所受到的冷冻损伤。
此外，对卵母细胞进行精心设计的膜处理和包覆技术，也能显著提高细胞的冷冻保存率。
创新的玻璃化冷冻设备和技术也对人类卵母细胞的冷冻保存起到了积极的促进作用。
人类卵母细胞是非常敏感的细胞，需要在非常短的时间内完成冷冻，避免冷冻过程中对细胞的额外损伤。
因此，一些新型的冷冻设备，如快速冷冻器和微流控器，能够在非常短的时间内将细胞迅速冷冻，从而避免了细胞因长时间接触冷冻剂而产生的冷冻损伤。
此外，越来越多的研究关注卵母细胞冷冻后的质量评估。
传统的评估方法主要依靠检测冷冻后的细胞形态和一些形态学指标，但这种方法对早期胚胎的质量评估并不准确。
近年来，一些新兴的技术，如单细胞转录组测序和代谢组学分析，能够更准确地评估冷冻后卵母细胞的质量和其潜在的发育能力。
玻璃化冷冻法
玻璃化冷冻法
基本原理是将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下凝固，形成不规则
的玻璃化样固体，保存了液态时正常分子和离子分布，因而在细胞内发生
玻璃化时能起到保护作用。
所保存细胞在冷冻保护液中脱水到一定程度后，则引起内源性胞质大分子如蛋白质及渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，从而
使细胞在剧烈的快速降温中得到保护。
人类的配子和胚胎的冷冻保存已经是人工生殖领域中一个必要的部分。
在过去这二十年中，冷冻保存技术的发展亦可反映人工生殖技术的发展程度，现在的冷冻技术已可用在冷冻保存精子、卵子和不同时期的胚胎，尤
其是玻璃化冷冻技术(Vitrification)，其不仅已获得医学界广泛的认可，并渐渐取代传统慢术冷冻法，而成为冷冻技术的最佳选择，甚而将此技术
运用在高难度的卵子、卵巢组织和人类胚胎干细胞的冷冻上。
有别於慢速冷冻法在降温的冷冻过程中会形成冰晶，进而造成胚胎的
伤害，玻璃化冷冻技术的特色就是使细胞本身及冷冻溶液在冷冻时，呈现
黏稠而不产生结晶的玻璃化状态，利用这种不结冰的原理以改善慢速冷冻
之缺点。
换言之，胚胎的冷冻保存与解冻的成败与否，不单是胚胎品质的
好坏，同时必须靠冷冻保存中有无一个完全无结冰生成的冷冻过程。
而玻
璃化冷冻其高浓度冷冻保护剂和细胞间经一定时间平衡後，细胞体积可因
脱水而减少30-50%，然後将之置入冷冻器材，再直接投入液态氮中使细胞
瞬间玻璃化，在无冰晶形成下保存，以减少细胞内结冰造成伤害。
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➢具体实施案
• 需要特定的冷冻保存剂以及载杆 • 操作者经过相应的培训
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➢国内外应用情况
• 目前国内外较大的生殖中心均有开展 • 北京地区已有多家生殖中心开展该项目，包括协和医院
、北医三院、301医院等
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适应证、禁忌证 及不良反应
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禁忌证及不良反应
在低温保存过程中，剧烈的温度和物理变化容易造成细胞 的损伤和死亡
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技术路线
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胚胎冷冻
冷冻保护剂的配制 胚胎在冷冻保护剂中依次转移，进行脱水 将胚胎置于载杆上，快速浸入液氮
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胚胎解冻
解冻保护剂的配制 将冷冻载杆从外套管中取出，将其前端（装有胚胎）浸于T1
液中，在显微镜下寻找胚胎，胚胎依次转入T2 –T4中 挪入事先准备好的培养滴内清洗后移入培养滴内 行辅助孵化后培养至移植
• 费用两种方法相当，玻璃化的载杆和保护剂成本稍高于程序化冷冻
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新技术申请-胚胎玻璃化冷冻
开展玻璃化冷冻的目的、 意义和实施方案
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➢开展玻璃化冷冻的目的、意义
玻璃化冷冻是目前普遍采用的冷冻方法 此方法避免了细胞外冰晶形成引起的理化损伤和细胞内形成的冰
晶对细胞的机械性损伤，维持了细胞内正常的超微结构 提高冷冻速率，可达到20000 -100000°C/min，使细胞迅速度过
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与传统程序化冷冻法 的比较
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➢风险、疗效、费用、及疗程的比较
• 传统的程序化冷冻需要复杂的冷冻仪，价格昂贵，并且所需冷冻时间比 较长
• 玻璃化冷冻不需要昂贵的程序化降温仪，冷冻时间大大缩短，并且复苏 率普遍高于程序化冷冻法
• 但玻璃化高浓度的冷冻液具有一定的毒性，对后代的安全性需要长期随 访观察
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适应证
体外受精—胚胎移植之后，还有质量较好的剩余胚胎 由于某种病理原因不能接受新鲜周期移植的病人，如：卵
巢过度刺激综合征（OHSS）；子宫内膜状况不良；不明 原因的阴道出血；明显身体不适等 由于某种非医学原因不能接受新鲜胚胎植入的病人，如： 突如其来的某种家庭或个人意外事件发生；病人情绪因某 种原因不能稳定等