SERS标记的金纳米棒探针用于免疫检测

2009年第67卷化学学报V ol. 67, 2009第14期, 1603～1608 ACTA CHIMICA SINICA No. 14, 1603～1608* E-mail: jwhu@Received March 2, 2009; revised April 5, 2009; accepted May 7, 2009.1604化学学报V ol. 67, 2009荧光谱峰较宽, 信号的选择性相对较差; 若用荧光分子标记, 还存在光解和光致褪色现象, 因而荧光标记技术亦有其局限性. 基于表面增强拉曼散射(SERS)的SERS 标记技术是一种光谱标记技术, 始建立于20世纪80年代末[8]. 它利用金或银等贵金属纳米颗粒来增强/放大表面吸附的拉曼活性分子的拉曼信号(即SERS), 以拉曼活性分子的SERS信号作为读出示踪信号. 近年来随着纳米科技的快速发展, SERS标记技术已引起了国内外科学家的广泛关注[9,10]. 首先, 拉曼光谱具有高度的分子特征性, 且谱峰窄, 能减小不同分子间的谱峰重叠. 其次, 在多元检测中一种波长的激发光就能激发出不同的拉曼活性分子的谱峰. 第三, SERS信号很少受光漂白的影响, 可在一定程度上为获得较好的SERS信号而延长积分时间. 第四, SERS信号不象荧光分子那样易发生自淬灭现象, 可通过增加拉曼活性分子数目来提高信号强度, 从而提高免疫检测的灵敏度.目前, SERS免疫检测呈现几个基本的发展趋势[11]. 第一, 如何解决SERS标记免疫探针在固体基底上非特异性吸附造成的“假阳性”问题. SERS免疫检测的基本方法是标记抗体, 待测抗原和俘获抗体之间形成“三明治”夹心结构. 理想情况下, 探针上的抗体通过抗体和抗原之间的特异性免疫反应连接到俘获抗体上. 除此以外的吸附为非特异性吸附, 由此造成假阳性和背景信号升高等. 通常可利用牛血清白蛋白来封闭固体基底上的空位以减少非特异性吸附. 第二, 实现从单组分到多组分检测. Ni等[12]最早尝试了双组分检测. 国内顾仁敖课题组[13]也成功地进行了二组分检测, 并初步进行了三组分检测的尝试[11]. 第三, SERS探针的表面修饰. SERS 纳米探针的表面修饰可以减少标记分子从纳米颗粒表面脱落, 提高信号的稳定性, 并能有效减少探针的非特异性吸附问题. 除此以外, 探针还应具备水溶性、抗团聚和生物亲和性的特点. 目前, 表面修饰的发展趋势是从第一代裸纳米颗粒探针[12～15]到第二代的SiO2修饰的探针[10], 再到第三代高分子包覆的纳米探针[16]. 我们在前期的工作中已明确: 可将胶体的空间稳定理论作为设计制备各类纳米探针的理论依据[17], 即将生物亲和性高分子吸附在纳米颗粒/探针上, 以其提供的空间稳定来取代探针原来的电荷稳定机制. 由于稳定机制不同, 高分子稳定的纳米探针可以耐受高浓度盐等苛性条件而不团聚, 还可提供水溶性和生物亲和性等诸多优异的性能. 第四, 提高免疫检测的灵敏度. 由前述SERS免疫检测的基本方法可知, 提高免疫检测灵敏度实际上就是要提高SERS信号强度. 因此通常选择具有较大拉曼散射截面的分子作为标记分子. 除此以外, 另一个方案是全面借鉴SERS领域的研究成果, 采用具有较强增强能力的纳米颗粒来制备探针. 如Porter等[18]采用60 nm 的金颗粒来制备SERS免疫探针. Cao等[19]和徐等[20,21]则利用银染色技术来提高SERS信号. Cui等[22]采用表面具有孔洞的银核金壳颗纳米粒子来制备探针. Ji等[23]则采用金核银壳纳米颗粒来制备探针, 可通过改变Au/Ag 核与壳的厚度从而获得强的SERS信号. Sanles-Sobrido 等[24]采用颗粒聚集体来制备探针.金纳米棒有着独特的光学性质, 并且在医学、传感和化学分离等方面有很好的应用前景, 近年来已成为人们研究的热点[25]. 金纳米棒有两个等离子体共振(SPR)吸收带: 横向SPR吸收峰和纵向SPR吸收峰, 其中纵向等离子体吸收峰的位置可以随其长径比的增大而逐渐红移[25]. 金纳米棒SPR的这种可调性使其能作为很好的SERS基底. 因为按照SERS的电磁场增强机制, 当激发光和SPR共振时, 可以最大程度提高单个纳米颗粒的增强能力[26]. 我们最近的实验和理论计算也证实: 当金纳米棒纵向SPR与632.8 nm的激发光耦合时, 其增强能力确实比耦合程度小或没有耦合时强[27]. 因而, 我们制备了长径比为2.5的金纳米棒, 使其纵向SPR和632.8 nm的激发光耦合. 并以此金纳米棒来制备SERS纳米探针, 进行SERS免疫检测研究.1 实验部分1.1 实验试剂氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、硼氢化钠、硝酸银、抗坏血酸(AA)均为分析纯, 购自上海国药集团化学试剂有限公司. N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)为分析纯, 购自上海共价化学科技有限公司. 对巯基苯甲酸(MBA)、3,3'-二硫代二丙酸(99%)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)购自Aldrich公司. 羊抗鼠IgG、小鼠IgG、牛血清蛋白(BSA), PBS缓冲液(pH＝7.2)购自北京鼎国生物技术有限责任公司. α-甲氧基-ω-巯基聚乙二醇(mPEG-SH, M W＝5000)由北京建凯科技有限公司特定合成. 四氢呋喃(THF)、丙酮、正己烷购自天津大茂化学试剂有限公司. 玻璃镀金基底由中国科学院安徽光学精密机械研究所提供. 先在清洗干净的玻璃片基底上真空镀上Ni-Cr层, 其上再镀上金. 实验用水为Mini-Q超纯水, 电阻率大于18.0 MΩ•cm－1.1.2 3,3'-二硫代二丙酸丁二酰亚胺酯(DSP)的制备0.4836 g 3,3'-二硫代二丙酸(2.3 mmol)溶于50 mL THF中, 向其中加入0.575 g (5 mmol) NHS, 在0 ℃下再加入1.03 g DCC (5 mmol), 在冰浴条件下搅拌反应36 h. 过滤除去副产物N,N'-二环己基脲(DCU), 将滤液旋转蒸发除去THF. 用丙酮/正己烷重结晶两次后得到白色固No. 14 郭红燕等：SERS标记的金纳米棒探针用于免疫检测1605体DSP.1.3 金纳米棒的制备实验所用的金纳米棒溶胶采用种子生长法合成[28]. 第一步种子的制备: 向7.5 mL 0.05 mol•L－1 CTAB中加入0.12 mL 2.037×10－2 mol•L－1 HAuCl4溶液, 轻轻摇匀. 迅速向其中加入0.6 mL 0.01 mol•L－1冰浴冷却的NaBH4溶液, 剧烈振荡 2 min. 然后将制得的金纳米种子在40 ℃的水浴中静置老化2 h后使用. 第二步金纳米棒的生长: 向30 mL 0.05 mol•L－1 CTAB中加入40 μL 0.01 mol•L－1的AgNO3溶液, 振荡1 min. 再向其中加入0.74 mL 2.037×10－2 mol•L－1的HAuCl4溶液, 轻轻摇匀. 然后再迅速加入0.24 mL 0.1 mol•L－1的AA溶液, 剧烈振荡至溶液变为无色. 最后加入0.3 mL上述金种子, 轻轻振荡2 min后, 静置3 h, 让金种子生长成金纳米棒. 离心(10000 r•min－1, 12 min)洗涤金纳米棒两次后, 将纯化后的金纳米棒分散在超纯水中备用.1.4 免疫金纳米棒探针的制备向以上合成的1 mL 金纳米棒溶胶中加入10 μL 1.0×10－3 mol•L－1 MBA, 反应4 h, 让拉曼活性分子MBA 充分吸附到金纳米棒上. 在这一步中要仔细控制加入MBA的量, 使之只部分占据金纳米棒表面(约占据1/2), 为后续抗体吸附预留足够的空位. 然后向吸附MBA分子的金纳米棒溶胶中加入过量羊抗鼠IgG(2 mg•mL－1, 分散于0.01 mol•L－1, pH＝7.2的PBS缓冲溶液中), 室温下反应1 h. 再向其中加入6 μL 3.425×10－4 mol•L－1的mPEG-SH 来封闭金纳米棒表面剩余空位. 为防止游离的MBA、羊抗鼠IgG和mPEG-SH的干扰, 将制备好的免疫金纳米棒探针从溶液中离心分离出来, 再重新分散在超纯水中备用.1.5 SERS标记抗体-待测抗原-俘获抗体“三明治”结构的组装玻璃镀金基底在使用前依次在超纯水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇和超纯水中超声洗涤5 min, 烘干后放入1×10－4 mol•L－1的DSP乙醇溶液中, 室温下浸泡12 h. 用乙醇洗去基底表面未吸附的DSP后, 氮气吹干. 将DSP修饰的镀金片放入0.05 mg•mL－1羊抗鼠IgG PBS缓冲溶液中, 于4 ℃下放置12 h. 用PBS缓冲液冲洗基底, 除去未吸附的抗体. 再将其浸入2%的BSA溶液中, 4 ℃下放置1 h, 封闭表面剩余空位, 以减少非特异性吸附. 用大量PBS缓冲液清洗基片, 然后保存在4 ℃下的PBS缓冲溶液中.将基片氮气吹干后放在200 μL不同浓度的小鼠IgG PBS缓冲溶液(0.01 mol•L－1, pH＝7.2)中振荡2～4 h. 取出后先用大量的PBS缓冲溶液充分冲洗基底, 再用超纯水冲洗, 并用氮气吹干. 将小鼠IgG修饰的基底浸入标记免疫金纳米棒溶胶中, 室温下放置 6 h. 取出基底, 用超纯水充分冲洗后用氮气吹干, 形成“三明治”夹心结构备用.1.6 测试仪器金纳米棒粒子的形貌表征在JEM-1230型(JEOL公司)透射电镜(TEM)上进行. 紫外-可见光谱在UV2300型(上海天美科学仪器有限公司)光谱仪上进行. 基底表面形貌在JSM-6700F 扫描电子显微镜(SEM)上进行. 水力半径在Zetasizer 3000HS型(英国Malvern公司)Zeta 电位粒度仪上测定. SERS光谱在共焦显微拉曼光谱仪LabRAM HR(法国Jobin Yvon公司)上进行. 激发波长为632.8 nm, 所有光谱均为一次10 s积分时间采集.2 结果与讨论2.1 免疫金纳米棒探针的制备和表征图1a为按种子生长法[28]合成的金纳米粒子的TEM 图. 由图可见, 除少数近似为球形的粒子难以从溶胶中离心分离以外, 绝大多数金纳米粒子为棒状. 统计约150 个纳米棒, 计算出其平均长径比(棒长轴与短轴之比)约为2.5. 通过电感耦合等离子体(ICP)可以测出金纳米棒溶胶中金元素的含量. 再根据TEM图, 把纳米棒看成一个两端分别为半球状的圆柱体. 从而计算出溶液中金纳米棒的粒子数密度为 1.12×1012个/mL. 单个标记分子MBA所占据的面积约为20 Å2[29]. 据此可估算出所需加入MBA的量, 使其约占据金纳米棒表面积的1/2, 以便留出足够的空位来吸附抗体. 图1b为依次吸附MBA和抗体后的金纳米棒的TEM图, 和图1a相比, 金纳米棒之间的距离增大, 溶胶的分散性有了明显改善. 这是由于大分子蛋白质体积较大, 当它通过静电/化学键吸附到金纳米棒上时, 可能会通过空间位阻阻碍棒与棒之间进一步接近. 图1c为依次吸附MBA和抗体, 表面空位再用mPEG-SH封闭后的金纳米棒探针的形态. 由图可看出其分散性有了进一步改善. 在制备探针时, 通常也是采用BSA来封闭探针颗粒表面的空位, 以减少探针与固体基底表面的非特异性吸附[18]. 由于PEG 链节是不带电的中性基团, 对蛋白有很强的抗吸附能力[30]. 如Kim等[31]将PEG接枝到生物素修饰的聚赖氨酸上, 有效抑制了聚赖氨酸对蛋白的非特异性作用. 其次, mPEG-SH比BSA体积小, 能更有效地封闭空位. 故我们采用mPEG-SH来封闭空位, 以降低探针的非特异性吸附. mPEG-SH以巯基基团吸附到金纳米颗粒表面, 其直链PEG链节则向外伸展到溶液中. 显然, 如果PEG链的长度比探针上吸附的抗体的直径大, 则会干扰1606化 学 学 报 V ol. 67, 2009抗体与待测抗原的结合. 为此, 我们采用mPEG-SH 和抗体分别单独修饰70 nm 金溶胶, 并测量其水力半径. 结果显示PEG 修饰的金纳米粒子水力半径增大了约9 nm, 而抗体修饰的金纳米粒子则增大了50～200 nm 以上. 说明用mPEG-SH 封闭空位不会干扰探针上的抗体与溶液中待测抗原的结合.图1 纯态金纳米棒(a)、MBA 和羊抗鼠IgG 修饰的金纳米棒(b)和MBA, 羊抗鼠IgG 和mPEG-SH 修饰的金纳米棒(c)的TEM 图Figure 1 TEM images of pure gold nanorods (a), MBA and goat anti-mouse IgG modified gold nanorods (b), and MBA, goat anti-mouse IgG, and mPEG-SH modified gold nanorods (c)由于SERS 免疫检测的基本方法是将SERS 免疫探针与俘获抗体通过待测抗原组装成“三明治”式的夹心结构, 探针SERS 信号的强弱反映待测抗原浓度的高低. 因而, 探针在制备过程中和在“三明治”夹心结构中应保持分散态, 避免团聚. 如果探针纳米颗粒团聚, 则探针之间的耦合会进一步提高SERS 信号强度[26], 造成“假阳性”, 即待测抗原浓度出现正偏差.图2曲线a 为纯态金纳米棒溶胶的紫外-可见吸收光谱. 金纳米棒的紫外-可见吸收谱有两个SPR 共振吸收带: 位于低波数段的横向SPR 吸收峰和位于长波数处的纵向SPR 吸收峰[25]. 通过增大长径比, 可将金纳米棒纵向SPR 峰位置从可见光区调至近红外光区. 我们在以前的工作中证实: 纵向SPR 与632.8 nm 的激发光耦合程度越大, SERS 信号越强[27]. 本实验中就选用长径比为2.5的金纳米棒, 通过其SPR 和拉曼光谱仪632.8 nm 的激光耦合来提高SERS 信号. 图2b, 2c 和2d 显示, 金纳米棒上依次吸附MBA 、抗体和mPEG-SH 后, 其纵向峰SPR 峰位置稍红移. 但在长波数方向没有出现新的聚集体的吸收峰, 说明无团聚现象. 图2e 是离心清洗后的免疫探针(除去未吸附的杂质)的紫外-可见光谱. 离心后弃去上层清液会损失一部分金纳米棒, 导致纵向SPR 吸收峰的强度降低. 同时纵向和横向SPR 吸收峰强度的比例比离心前有所下降, 其原因尚不清楚. 若免疫探针发生团聚, 则在纵向SPR 长波数方向出现明显的新吸收峰, 因而从图2e 可判断免疫探针没有团聚. 我们在实验中仔细控制探针的制备条件, 并采用紫外-可见光谱监测, 选用非团聚的探针用于后面的免疫检测.图2 纯态金纳米棒(a), MBA 修饰的金纳米棒(b), MBA 和羊抗鼠IgG 修饰的金纳米棒(c), MBA, 羊抗鼠IgG 和mPEG-SH 修饰的金纳米棒(d)和(d)中的金纳米棒经离心清洗后重新分散在超纯水中(e)的紫外-可见光谱Figure 2 UV-vis spectra of pure gold nanorods (a), MBA modified gold nanorods (b), MBA and goat anti-mouse IgG modified gold nanorods (c), MBA, goat anti-mouse IgG, and mPEG-SH modified gold nanorods (d) and the gold nanorods that were centrifugation-purified from (d) and then redispersed in ultrapure water (e)2.2 “三明治”结构的表面状态表征和SERS 免疫检测我们采用DSP 来修饰镀金基底. 它通过二硫键断裂, 形成Au-S 键组装在金基底上. 其活性酯键则可以和抗体上的NH 2反应, 从而将抗体组装在金基底上. 用No. 14 郭红燕等：SERS标记的金纳米棒探针用于免疫检测1607DSP处理的基底有利于抗体在基底表面的直立排列, 从而更好地捕捉待测抗原. 图3a是抗体修饰后的金基底, 图中插图是未经任何修饰的空白基底. 图3b是俘获抗图3 DSP-抗体修饰的金基底(图中插图是空白的金基底)(a), DSP-抗体-抗原修饰的基底(b), 抗原浓度为１×10－4 mg•mL－1时“三明治”结构(图中插图是抗原浓度为0时的情况) (c)和抗原浓度为1×10 mg•mL－1时“三明治”结构的SEM图(d) Figure 3 SEM images of (a) DSP-goat anti-mouse IgG modified gold substrate (the inset is the SEM image of bare Au substrate without any modification), (b) DSP-goat anti-mouse IgG-mouse IgG modified gold substrate, (c) sandwich structure assembled at mouse IgG concentration of 1×10－4 mg•mL－1 (the inset shows the SEM image for the case without addition of mouse IgG), and (d) sandwich structure assembled at mouse IgG concentration of 1×10 mg•mL－1体(即修饰在金基底上的抗体)和抗原反应后基底的SEM图. 由图可见, 抗原在金基底上呈岛状分布. 图3c 和3d 是经免疫反应组装出的“三明治”夹心结构的SEM 图. 当无抗原时, 金基底上几乎看不到金纳米棒探针(图3c中插图), 说明非特异性吸附不明显. 随着抗原浓度的增加, 金基底上开始出现金纳米棒探针(图3c). 在高浓度抗原条件下, 探针在基底上的数目较多, 分布比较均匀、分散, 较大程度上减少了棒与棒之间的聚集/耦合(图3d).图4是镀金基底上组装的SERS标记抗体-待测抗原-俘获抗体“三明治”夹心结构的SERS光谱图. 实验中采用一系列不同浓度的待测抗原来组装“三明治”夹心结构. 从图中可看出, 随着抗原浓度的增大, MBA的SERS信号逐渐增强. 因而, SERS信号变化说明抗原-抗体的结合属于特异性吸附. 与SEM观察一致, 当抗原浓度为0, 图中的SERS信号很弱. 说明用mPEG-SH封闭探针表面剩余空位, 确实可以有效抑制非特异性吸附. 在同样的实验条件下, 当用BSA封闭空位的探针做检测时, 其非特异性吸附要强一些. 这可能是由于BSA表面有大量的官能团可与基底作用. 图5是SERS峰1073 cm－1的积分面积与抗原浓度的关系图. 由图可见, 能检出的抗原浓度范围高于1×10－8 mg•mL－1.图4 不同浓度小鼠IgG组装出的“三明治”结构的SERS光谱Figure 4SERS spectra of the sandwich structures assembled at varying mouse IgG concentrations3 结论我们以具有较大拉曼散射截面的对巯基苯甲酸作为SERS标记分子, 以金纳米棒来制备免疫探针, 制得了SERS标记抗体-待测抗原-俘获抗体的“三明治”夹1608化学学报V ol. 67, 2009图5 SERS信号强度与抗原浓度的关系图Figure 5 Integrated SERS intensity of the peak at 1073 cm－1 as a function of mouse IgG concentration心结构. 通过金纳米棒的SPR和激发光的耦合来优化SERS信号, 单组分抗原的SERS免疫检测浓度范围高于1×10−8 mg/mL.References1 Diamandis, E. 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