氨基酸分析
关于氨基酸的定量分析
• 再在冰浴中冷却3 min 以上,加碘化钾5mL , 立即用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定至淡 黄色,加入淀粉溶液2 mL ,继续滴定至蓝色 消失为终点,同时做空白试验。
x(v1 v2)c0.02403100 m 25 100
有吸收的衍生试剂。该方法的基本原理是 经阳离子交换柱分离出的氨基酸与茚三酮 混合,经加热反应后,一级胺与之生成蓝紫 色化合物,二级胺与之生成黄色化合物。两 种衍生物使用双通道紫外检测器同步检测, 检测波长分别为570nm 和436nm。
C OH
C
C
OH
O
茚三酮
O
C OH
C
C
OH
O
COOH
H 3N
C
关于氨基酸的定量分析
氨基酸的分析方法
化学分析法——甲醛滴定法 甲醛滴定法用于氨基氮的
测定, 可以测出样品中总氨基酸 的含量,其原理是在中性或弱碱 性水溶液中,氨基酸的α—氨基与醛类反应生成
Schiff碱:α—氨基酸与甲醛反应生成亚 甲基亚氨基衍生物
H
R C C O O
N H 3
H C H O
O H
H
பைடு நூலகம்
R
O
C OH
C
C
H
NH3
CO2
O
O
C OH C
C OH
O
O C
C C O
O
C
NC
H
C
O
紫色化合物
RCHO
H
O C
CN C O
亮黄色化合物
18种氨基酸分析方法
1) 天平一台（精度0.1mg）2) 恒温水浴锅一台3) 容量瓶4) 试管（1.5×15cm或1.5×10cm）5) 微量进样器（5μL或10μL）一支6) 微量可调移液枪（1000μL，200μL）一支、吸头多个。
7) 旋涡混匀器一台8) HPLC系统及氨基酸分析专用柱（4.6×250mm 5μm）一. 仪器及试剂二. 流动相的配制三. 衍生化反应1. 对照品溶液浓度值18种氨基酸分析方法仪 器：流动相 A：0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93.0：7.0流动相 B：水：乙腈＝20.0：80.0配制方法：准确量取水200mL和乙腈800mL，混合均匀，抽滤过0.22µm滤膜1) 超纯水（≥18MΩ·cm）2) 乙腈（HPLC级）3) 三水合醋酸钠（分析纯）4) 冰醋酸（分析纯）5) 衍生试剂A和衍生试剂B溶液，至于冰箱保存（衍生试剂包对身体有害，用时请做好防护措施）6) 正己烷（HPLC级）7) 0.1mol/L盐酸溶液：量取9.0mL浓盐酸，加去离子水稀释至1000mL。
8) 正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸约10mg，加0.1mol/L 盐酸溶液 10mL溶解，混匀。
试 剂：配制方法：准确称取三水合醋酸钠13.6g于1000mL水中，搅拌均匀，使之溶解，用冰醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.50；准确量取配制好的三 水合醋酸钠溶液930mL和乙腈70mL，混合均匀，抽滤过0.22µm滤膜。
月旭科技（上海）股份有限公司公司官网：服务热线：400-808-67602. 注意事项：1）进样分析：先进对照品溶液，后进供试品溶液；2）缓冲溶液，隔天需重新配制；3）防止缓冲盐析出。
5）运行一次空白梯度； 6）进样分析；7) 分析完成后：I）用乙腈：水＝20：80代替流动相A ，进水样（清洗自动进样器）， 进行梯度洗脱；II）换90％乙腈冲洗色谱柱40min以上。
生物化学第3章 氨基酸分析
180多种天然氨基酸； 20种蛋白质氨基酸
二、氨基酸的分类、性质
各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同 20种蛋白质氨基酸按R的极性可分为非极性氨基酸、不带电荷极性氨基酸、 带正电R基氨基酸和带负电R基氨基酸
按R基的结构可分为脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸及杂环氨基酸3大类
脂肪族氨基酸：一氨基一羧基（中性氨基酸）:含有硫
Cysteine Methionine (Cys，C) (Met，M)
(1) 两个半胱氨酸的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸，Cys-S-SCys
(2) 蛋氨酸的甲硫基的硫原子有亲核性，容易发生极化，在生物合成
中是重要的甲基供体
脂肪族氨基酸：一氨基二羧基（酸性氨基酸）
水中心）
极性氨基酸侧链能与水形成氢键，易溶于水 带电荷和极性氨基酸一般位于蛋白表面 蛋白的活性中心：His，Ser，Cys
2.3氨基酸的分类——不常见蛋白质氨基酸
2.4氨基酸的分类——非蛋白质氨基酸
150 多种，不是蛋白质组成，但是有特定生理功能
（1）大多是L型α氨基酸衍生物
（2）有D型氨基酸 （3）还有β-、γ-、δ-氨基酸
四、氨基酸的化学反应
ɑ-氨基参与的反应: 亚硝酸、酰化试剂、烃基、 醛基氧化酶 氨基酸的 化学反应
茚三酮、肽键形成!
ɑ-羧基参与的反应： 成盐、成酯、成酰氯、脱 羧、叠氮
侧链R基参与的反应： 取决于R侧链的官能团
ɑ-氨基参与的反应:
与亚硝酸反应：
通过测定N2的量而计算氨基酸的量，可衡量蛋白质的水解程度 与酰化试剂反应： X=Cl, OH, -OCOR; 可多肽合成中保护氨基；丹磺酰氯可以与肽的N-端氨基 酸反应，生成丹磺酰-肽，水解得到有强烈荧光的丹磺酰-氨基酸，用电泳法 或层析法分析即可得知N-端是何种氨基酸，被广泛用于蛋白质N端测定。 烃基化反应：
氨基酸分析
1．试剂：
（1）衍生液：
异硫氰酸苯：甲醇：三乙胺：水（V/V）=1：7：1：1
（2）正己烷
（3）氨基酸标样
（4）乙腈、乙酸、乙酸钠
以上试剂中乙腈为色谱醇，水为二次蒸馏水，其它为分析醇。
2．柱前衍生步骤：
（1）将200ul衍生液加入200ul氨基酸标样或样品中，震荡使混合均匀，室温放置1小时。
（2）反应液中加入400ul正己烷，充分震荡后放置使分层。
（3）取下层溶液用一次性滤膜过滤器（0.45ul）过滤。
（4）取滤液5ul注入HPLC。
3．分离条件：
（1）色谱柱：Shim-pack VP-ODS 4.6mm x 15cm
保护柱：Shim-pack GVP-ODS4.6 mm x 1cm
（2）流动相：
A液：0.1M乙酸钠pH6.50（用乙酸调整，500ml乙酸钠中约加2滴乙酸）。
B液：乙腈/水=4/1
（3）流量：1ml/min
（5）柱温：36C
（6）检测波长：254nm
（7）梯度洗脱程序：
进样量可在pmol级别。
为取得较高的重现性，建议在nmol级别进样，由于氨基酸分子量在130左右，故通常进样浓度为100-1000ppm，对几个umol/ml的样品可直接进行柱前衍生，太高浓度的样品最好稀释10-100倍再分析。
有机化学氨基酸分析
有机化学氨基酸分析氨基酸是生物体中重要的有机化合物之一，它具有结构多样性和功能多样性，广泛参与生物体内的代谢过程和各种生物学功能。
因此，研究和分析氨基酸在生物体内的存在和含量是生物化学和生物医学领域的重要课题之一氨基酸普遍具有两个基团：氨基基团和羧基基团。
氨基基团(-NH2)能够与酸性物质发生酸碱反应，而羧基基团(-COOH)可以与碱性物质反应。
因此，氨基酸可以在不同的pH环境下呈现出不同的离子化状态。
氨基酸分析的方法有很多种，其中最常用的方法是色谱法。
色谱法是基于物质在固定相和流动相之间相互分配过程的一种分离和测定方法。
氨基酸分析常用的色谱法有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。
气相色谱法是通过将氨基酸样品蒸发成气体态后，通过柱子分离各个氨基酸，并通过检测器进行定量测定。
GC法的优点是分离效果好、分析速度快，但需要样品具有较好的挥发性。
对于挥发性较低的氨基酸，通常需要先进行酸水解或酶解处理。
高效液相色谱法是通过将氨基酸溶解在流动相中，通过柱子分离各个氨基酸，并通过检测器进行定量测定。
HPLC法与GC法相比，对样品要求较低，适用范围更广。
HPLC法可以在较低的温度下进行分析，避免了氨基酸的热解和挥发损失。
除了色谱法外，还可以使用质谱法进行氨基酸分析。
质谱法是通过将氨基酸样品蒸发成气体态后，通过质谱仪进行分析。
质谱法的优点是分辨率高、灵敏度高，可以分析低浓度的氨基酸。
质谱法可以通过离子反应进行定量测定。
此外，还可以使用光谱法进行氨基酸分析。
光谱法是利用物质吸收、发射或散射光的特性进行分析的一种方法。
氨基酸中苯环的吸收或蛋白质中色氨酸的荧光可以用于氨基酸的分析。
在氨基酸分析中，常常需要先进行衍生化反应，将氨基酸转化为稳定的衍生物，提高其检测灵敏度和分离效果。
常用的衍生反应有酸衍生、酯化、取代反应等。
总结起来，氨基酸的分析方法有色谱法、质谱法和光谱法等。
这些方法各有特点，可以选择合适的方法根据不同的需要进行分析。
氨基酸的分析方法
氨基酸的分析方法
氨基酸的分析方法主要有以下几种：
1. 比色法：利用氨基酸中的吸收光谱特性进行定量分析。
对于有色氨基酸，可以直接用此方法进行分析，如色氨酸、酪氨酸等。
对于无色氨基酸，需事先进行衍生化反应，如二羧基二氨基联苯胺(DTNB)法，测定半胱氨酸含量。
2. 氨基酸自动分析仪：常用的分析方法是自动氨基酸分析仪，其原理是利用离子交换色谱技术对氨基酸进行分离和检测。
该方法操作简便，自动化程度高，可同时分析多种氨基酸，用于生化实验和质量检测。
3. 氨基酸序列测定法：利用氨基酸测定仪测定氨基酸的相对分子质量，进而测定氨基酸的分子序列，通常用于蛋白质结构分析和生物活性研究。
4. 纸层析法：利用氨基酸的亲水性和疏水性差异进行分离，通常用于初步鉴定氨基酸的含量和组成。
该方法简便易行，但准确性较低，仅可作为定性或半定量分析方法。
5. 高效液相色谱法：利用高效液相色谱技术对氨基酸进行分离和检测。
该方法灵敏度高、重复性好、分辨率高，可用于生化分析和质量检测。
有机化学氨基酸分析
有机化学氨基酸分析1.色谱法色谱法是一种广泛使用的氨基酸分析方法，主要包括气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。
气相色谱法：气相色谱法主要适用于描绘和鉴定原料氨基酸的种类、含量和结构等信息。
在该方法中，氨基酸样品首先通过酸水解生成对应的酸，然后酸再经甲醇酯化生成甲酯化酸。
最后通过气相色谱分离并检测酸甲酯化物。
液相色谱法：液相色谱法主要适用于定量分析氨基酸含量。
液相色谱法将氨基酸样品进行衍生化反应，如酰氯化反应或酸酐酯化反应，生成稳定的色氨酸酰胺衍生物，然后分离并检测各个衍生物。
2.光谱法主要包括紫外-可见吸收光谱法、红外光谱法和核磁共振光谱法等。
这些方法可以用于研究和确定氨基酸的结构和功能。
紫外-可见吸收光谱法：氨基酸溶液在特定波长范围内对紫外或可见光的吸收程度可以用来定量分析氨基酸的含量。
红外光谱法：红外光谱法可以用来研究氨基酸分子中的官能团和结构信息。
核磁共振光谱法：核磁共振光谱法可以提供关于氨基酸分子中原子的化学位移和耦合常数等信息。
3.电化学法电化学法主要包括电位滴定法和电化学发光法。
电位滴定法：通过测定氨基酸溶液的电化学行为，如氧化还原电位的变化，可以定量分析氨基酸的含量和测定其在酸碱条件下的酸解离常数。
电化学发光法：氨基酸在特定条件下通过电化学反应发光，凭借发光的强度可以定量分析氨基酸的浓度。
4.质谱法质谱法主要包括质子化时间飞行质谱法（PIT-TOFMS）和质子化辅助激光解吸电离质谱法（PALDIMS）等。
质子化时间飞行质谱法：PIT-TOFMS可以在非常短的时间内通过氨基酸分析样品中的氨基酸类型和含量。
该方法的优势在于可以同时测定样品中的多种氨基酸。
质子化辅助激光解吸电离质谱法：PALDIMS利用激光对氨基酸样品进行解离和电离，然后通过质谱仪进行质量分析。
该方法可以提供对氨基酸的结构、组成和含量等信息。
综上所述，有机化学氨基酸分析方法包括色谱法、光谱法、电化学法和质谱法等。
这些方法可以用于氨基酸的种类、含量、结构和功能的研究和分析。
氨基酸分析
2.2.56氨基酸分析（1）（见注解）氨基酸分析是指利用方法对蛋白质，多肽和其他药物制剂进行氨基酸组成或含量的分析。
蛋白质和多肽一般是氨基酸残基以共价键的形式组成的线性大分子。
蛋白质或多肽中氨基酸的序列决定了其分子的性质。
蛋白质普遍是由大分子以折叠的方式形成的特定构象，而多肽则比较小，可能只有几个氨基酸组成。
氨基酸分析方法可以用于对蛋白质和多肽的量化，基于氨基酸的组成来确定蛋白质或多肽的类型，支撑蛋白质和多肽的结构分析，评估碎片肽段，并检测可能存在于蛋白质或多肽中的不规则氨基酸。
并且在氨基酸分析之前必须进行将蛋白质或多肽水解为个别氨基酸。
伴随着蛋白质或多肽的水解，氨基酸分析的过程和其他药物制剂中氨基酸的游离是一致的。
通常我们采用易于分析的方法来测定样品中的氨基酸成分。
设备用于氨基酸分析方法通常是基于色谱分离氨基酸的方法设定的。
当前的方法是利用自动化色谱仪进行分析。
氨基酸分析仪通常是一个能够产生梯度的低压或高压的液相色谱仪，并在色谱柱上分离氨基酸。
除非样品在柱前进行了衍生化，否则这些仪器必须具备柱后衍生化的能力。
检测器使用的是紫外可见光检测器或荧光检测器。
此外，还需具有一个记录仪器（例如，积分仪），用于转化检测到的信号及用于定量测定。
而且，这些仪器是专门用于氨基酸分析使用的。
一般预防策施在氨基酸分析中，分析师关注的一个重点是背景的污染。
高纯度的试剂是必要的（例如，低纯度的盐酸的使用在分析中会产生甘氨酸污染）。
分析试剂通常是每隔几周更换一次，并且仅使用HPLC级别的溶剂。
所用试剂使用之前必须用过滤器将溶剂中可能潜在的微生物和外来材料污染过滤除去，保持溶剂贮存器出于密封状态，并且不可将氨基酸分析仪放置于光照条件下。
实验室的操作规范决定了氨基酸分析的质量。
仪器应放置在实验室的空旷区域。
保持实验室的卫生干净。
根据维修计划，及时清洁和校准移液管，将移液吸头放置在相应的盒子中，分析师不得用手处理移液管。
分析师需要穿戴一次性的乳胶手套或同等质量的其他手套。
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2.分析方法：
毛细管 GC 可用一个色谱柱
其他常规GC,需用两个色谱柱，可分离常见AAs
检测器：电子捕获检测器
火焰离子化检测器，使用较多（通用型检测器）
四、高效液相色谱法
分离分析法
色谱分离 检测
柱前衍生化 柱后衍生化
1.检测问题
HPLC检测器：紫外、荧光、电化学
一种重要荧光衍生化反应
OPA+AAs→→→ 产物
λex=340nm
λem=455nm
4. 与醛反应，形成西佛碱:
R-CHO+NH2-RCH-COOH→R-CH=N-RCH-COOH+H2O
固定化酶，或标记Ag Ab时所用的方法
5.脱氨基反应——酶催化反应
AAs氧化酶
AAs + O2→→→→→→→Oxoacid酮酸+ H2O2+ NH3
产物——有UV吸收
——有荧光λex=340nm
λem=455nm
3.烃基化反应
2，4二硝基氟苯FDNB+AAs→→→→DNP-氨基酸(黄色)
Sanger反应,用于鉴定氨基酸方程式
荧光胺（Fluorescamine）+AAs→→→产物λex=390nm
λem=475nm
邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)反应
NH CH2
HCCH24-羟脯氨酸Hydroxyproline(Hyp)
COOH
④丹酰氯
(1)一般柱前衍生。但试剂产物对色谱柱寿命有影响
条件：60℃10min
(2)可紫外 可荧光，pmol(10-12)水平灵敏度
⑤FITC异硫氰酸荧光素
⑴过程：
FITC+丙酮+AAs+pH9.2混合，避光放置过夜
⑵特点
3.分析方法：
——一维电泳
——二维电泳－色谱分离
三、气相色谱法 （Gas Liquid Chromatography）
1.试样的衍生化
——问题提出：GC要求 样品可气化，AAs难气化
——衍生化方法：
·试剂：常用三甲基硅烷(Trimethylsilyl TMS对AAs衍生
·方法：
N.O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA)
---CH2---C====CH组氨酸Histidine (His)
NHN
CH2
不常见氨基酸
CH2—OH
NH CH2
HCCH24-羟脯氨酸Hydroxyproline(Hyp)
COOH
NH2
HCCH2CH2CH(OH)CH2NH2
COOH
5-羟赖氨酸Hydroxylysine (Hyl)
三、立体异构体
⑶按衍生操作
在线衍生on－line可用于柱前或柱后衍生
脱线衍生off－line多用于柱前衍生
介绍具体衍生化方法及特点
② 茚三酮(ninhydrin)最成熟的方法
(1)过程
茚三酮 汇合 加热100℃570nm测A
(2)特点
成熟常用
可见检测，紫外也可
只能柱后衍生
灵敏度10-9mol 10uL10-4mol/L
茚三酮邻苯二甲醛opafmdc按分离前后顺序柱前衍生precolumn柱后衍生postcolumn20按衍生操作在线衍生online可用于柱前或柱后衍生脱线衍生offline多用于柱前衍生介绍具体衍生化方法及特点茚三酮ninhydrin最成熟的方法1过程茚三酮汇合加热100570nm测a2特点灵敏度109mol10ul104mollopa1过程opaaasph910快速反应12min荧光产物340455nm2特点可柱前衍生可柱后衍生产物不稳定12min后降解只能在线衍生21灵敏度高pmol1012fmol1015只有伯氨氨基酸可衍生羟脯氨酸不可ch2ohnhch2hcch24羟脯氨酸hydroxyprolinehyp1一般柱前衍生
L-丙氨酸D-丙氨酸
3.分布
——蛋白质经温和水解后，其中α-氨基酸都是L型氨基酸
——虽然自然界中，存在有D型氨基酸
——人工合成氨基酸 DL消旋体racemate（DL等mol混合物）
四、氨基酸的酸碱性质
1.基本性质:
——酸-COOH失H＋
——碱-NH2得H+， 形成两性离子，两性电解质
两性解离
2.氨基酸得解离过程
以丙氨酸为例，以NaOH的滴定：
PI——iso-ionic pH (PI)
等离子点pH
在某pH,每个氨基酸分子带正负电荷相等，分子表观净电荷为0。
PI——iso-electric point
等电点
在某pH，每个分子呈电中性，在电场中无电泳迁移
五、反应
UV Vis——20种α氨基酸
——可见区 无吸收
——<220nm，有紫外吸收
③OPA
(1)过程
OPA+AAs→pH9-10快速反应1－2min荧光产物 340
455nm
(2)特点
可柱前衍生 可柱后衍生
产物不稳定，1－2min后降解，只能在线衍生
需自动反应装置，否则重现性不好
灵敏度高pmol(10-12)-fmol(10-15)
只有伯氨氨基酸可衍生，（羟）脯氨酸不可
CH2—OH
——流动相
1.固定相
纸色谱－滤纸
薄层色谱－硅胶、氧化铝、纤维素粉——铺板，制板
2.流动相
多元流动相：水、丁醇、HAc，丙酮、酚，NH3……
根据不同要求：流动相具有不同组成，不同配比
3.分析方法
①试样预处理
采用阳离子交换柱、萃取、渗析——沉淀蛋白
去除干扰物：蛋白、盐、碳氢化合物
2选择溶剂系统
多种组合配比
R——不带电荷的极性基团
-H甘氨酸Glycine(Gly)
-CH2OH丝氨酸Serine(Ser)
-CH(OH)CH3苏氨酸Threonine(Thr)
-CH2SH半胱氨酸Cysteine(Cys)
-CH2--OH酪氨酸Tyrosine(Tyr)
-CH2CONH2天冬酰胺Asparagine(Asn)
α-羧基参与的反应,分析化学中应用不多
（二）α-氨基与α-羧基共同参与的反应
1.与茚三酮反应(Ninhydrin)
分析化学最常用氨基酸衍生方法
水合茚三酮+ AAs→→ 还原茚三酮+AAs被分解→→
兰紫色产物 570nm测A.
有紫外吸收
2.成肽反应Peptide
以后详细讲
第二节 氨基酸分析
氨基酸分析――分离分析方法
→ □-SO3AAH++Na+
逐渐提高pH和Na.不同AAH+洗脱下来,梯度洗脱
由此原理生产氨基酸分析仪
检测
采用在线柱后衍生化方法,主要有两种:
⑴茚三酮p374结果见p378
⑵OPA
②分离AAs衍生物,如OPA,
提前衍生,反应1分钟r+甲醇,四氢呋喃,梯度洗脱.
只能柱前脱线衍生
灵敏度较高，比OPA高，激光荧光,amol10-18mol
毛细管电泳中常用
2.色谱分离
按柱前衍生柱后衍生
分离AAs衍生物分离AAs
分离对象不同
1分离AAs
色谱柱－离子交换色谱柱－填充阳离子交换树脂
强酸型－SO3H
洗脱剂－缓冲液+盐(柠檬酸钠)
原理－
□－SO3H→ 碱处理→ □-SO3Na+AAH+pH=2-3
1.α-氨基酸
NH2
HCR
COOH
αC除甘氨酸外，其中αC上四个取代基不同，为手性C，手性异构体（isomers）Stereo立体，
enantiomers对映体
2.氨基酸立体异构体分类
——按绝对构型（absolute configuration）
左旋L型，右旋D型，
与标准物——甘油醛比较而定
L-甘油醛glyceraldehydeD-甘油醛
——原因：氨基酸种类多
结构较相似
不经分离，难以直接分析，
现有直接分析方法，如酶、免疫分析法测定氨基酸选择性不够
——分离方法——高分辨分离技术：色谱、电泳
按分离方法，分为四部分：
——纸、薄层色谱
——电泳
——气相色谱
——高效液相色谱
一、纸色谱，薄层色谱法
色谱——固定相：纸色谱
薄层色谱——平面（板）液相色谱
都是α-氨基酸，除了:
脯氨酸羟脯氨酸
其中20种常见氨基酸，几种不常见氨基酸
二、分类
α-氨基酸通式：–COOH、-NH2在同一个C上。不同氨基酸在于R不同
NH2
HCR
COOH
R——非极性基团
—CH3甲基丙氨酸Alanine (Ala)
—CH2(CH3)2异丙基缬氨酸Valine(Val)
—CH2CH(CH3)2异丁基亮氨酸Leucine (Leu)
其它：
Sanger反应
2，4二硝基氟苯FDNB+AAs→→→→DNP-氨基酸(黄色)
丹酰氯AAs——有荧光λex=340nm
λem=455nm常用于分离前衍生化
⑤应用
定性：利用RF，在三个不同的溶剂系统下，确证
半定量：重现性不好
定量：扫描 挖点
二、电泳法
1.支持物：纸、纤维素膜、硅胶
2.缓冲液体系：常见pH2.0 pH5.3
—CH(CH2CH3)CH3丁基异亮氨酸Isoleucine(Ile)
CH2
NH CH2
HCCH2脯氨酸Proline (Pro)
COOH
—CH2—苯丙氨酸Phenylalanine(Phe)