琼脂糖凝胶电泳常见问题
琼脂糖凝胶电泳常见问题解答
琼脂糖凝胶电泳常见问题解答核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。
琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。
琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。
但操作过程中仍有不少要注意的问题。
1 凝胶制作1．1 凝胶浓度配制凝胶的浓度据实验需要而变，一般在0．8％～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。
粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。
以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。
核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 t*g ／ml；也可在电泳结束后染色。
1、2 梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。
梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。
另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。
当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑L。
琼脂糖凝胶电泳-完整整理
基因组分析
分子诊断
用于分离和鉴定基因组DNA片段，如限制 性片段长度多态性分析、基因突变检测等 。
用于检测和鉴定基因突变、病原微生物DNA 等，如聚合酶链式反应（PCR）产物电泳、 单链构象多态性分析等。
基因克隆
测序
用于分离和纯化目的基模板，如末端测 序、全基因组测序等。
达差异。
04 琼脂糖凝胶电泳实验问题 与解决
常见问题
条带弥散
由于点样量过多或电压过高，导致条带弥散。
条带过宽
由于凝胶浓度不合适或样品浓度过高，导致 条带过宽。
条带拖尾
样品中蛋白质降解或核酸酶污染，导致条带 拖尾。
条带不亮
由于染料浓度过低或曝光时间过短，导致条 带不亮。
问题分析
条带弥散
可能是由于点样量过多或电压过高， 导致DNA在凝胶中扩散。
琼脂糖凝胶电泳-完 整整理
目录
CONTENTS
• 琼脂糖凝胶电泳介绍 • 琼脂糖凝胶电泳实验操作 • 琼脂糖凝胶电泳结果分析 • 琼脂糖凝胶电泳实验问题与解决 •凝胶电泳的定义
01
琼脂糖凝胶电泳是指在琼脂糖凝 胶中进行的电泳技术，主要用于 分离、鉴定和纯化DNA片段。
浓度比较
通过条带亮度，比较不同 样品中目标DNA片段的浓 度。
纯度评估
根据条带的亮度与背景噪 音的比例，评估DNA片段 的纯度。
结果应用
基因克隆
01
通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否被正确克隆到载体中。
突变分析
02
利用电泳结果判断是否存在基因突变或点突变。
基因表达分析
03
通过比较不同组织或细胞系中目的基因的表达水平，分析其表
01
条带分析
琼脂糖凝胶电泳及其影响因素
琼脂糖凝胶电泳及其影响因素琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。
该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。
琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。
琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。
聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。
聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。
目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。
在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、 DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、 DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。
电泳常见问题
Marker参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。
新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。
也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?参考见解：DNA带模糊??：1、DNA降解??避免核酸酶污染。
2、DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。
3、所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
5、有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。
6、DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。
好象没跑出来，是怎么回事？参考见解：1、根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。
2、紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。
3、最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。
4、电泳时间可能过长，一般75v×30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。
怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？参考见解：1、跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。
因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。
2、在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。
琼脂糖电泳电压和电流设置
琼脂糖电泳是一种常用的核酸和蛋白质分离和纯化方法。
通过利用琼脂糖的凝胶特性，将待测样品分子按照大小和电荷进行分离。
在琼脂糖电泳实验中，电压和电流的设置对实验结果有着重要的影响。
下面我将详细介绍琼脂糖电泳电压和电流的设置方法和注意事项。
一、电压的设置1. 琼脂糖电泳实验中，电压的设置应根据待测分子的大小来确定。
较小的DNA片段通常需要较高的电压，而较大的DNA片段则需要较低的电压。
2. 选择合适的电压可以提高分离速度和分辨率。
但是过高的电压会导致琼脂糖凝胶发热、溶胶蒸发和样品失去活性等问题，因此需要谨慎设置。
3. 一般情况下，琼脂糖电泳实验的电压范围为50-150V。
如果待测分子较小，可以选择较高的电压，最大不超过150V。
大片段DNA则应选择较低的电压，最小不低于50V。
二、电流的设置1. 电流是根据电压和电阻来计算得到的，它与琼脂糖凝胶中的离子浓度和凝胶孔隙大小有关。
凝胶浓度越高，孔隙越小，电流就越小。
2. 电流的设置应根据实验室所使用的琼脂糖凝胶和电泳槽的尺寸来确定。
一般情况下，电流范围为10-30mA。
3. 在设置电流时，需要根据具体实验条件进行调整。
如果电流过高，可能会导致凝胶加热、样品失活等问题；而电流过低，则可能导致分离速度缓慢、分辨率下降等。
三、注意事项1. 在进行琼脂糖电泳实验前，要仔细检查电泳槽、电极和电源等设备是否正常工作，以确保实验的顺利进行。
2. 在设置电压和电流之前，需要根据待测样品的大小、琼脂糖凝胶的浓度和孔隙大小等因素进行综合考虑，并进行初步的试验和优化。
3. 在实验过程中，要定期检查电泳槽内的温度和电压情况，确保实验的稳定性和可靠性。
4. 对于不同的琼脂糖电泳实验，根据实际需要可以进行不同的电压和电流设置，以获得最佳的分离效果。
总结起来，琼脂糖电泳电压和电流的设置应根据待测分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度和孔隙大小等因素进行综合考虑。
合理的电压和电流设置可以提高实验的分离速度和分辨率，同时还需要注意避免电泳槽发热、溶胶蒸发和样品失活等问题。
琼脂糖凝胶电泳常见问题
琼脂糖凝胶电泳常见问题
缓冲液稀释DNA出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。
减少dNTP 的浓度。
适当降低 Mg2+浓度。
增加模板量，减少循环次数。
不规则DNA带迁移电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换DNA变性电泳前勿加热，用20mM Nacl 缓冲液稀释DNA带弱或无DNA带DNA上样量不够增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低DNA降解实验过程避免核酸酶污染DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度EB染色的DNA，所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源DNA带缺失DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确凝胶浓度DNA变性电泳前勿加热，用20mM Nacl 缓冲液稀释DNADNA链巨大，常规凝胶电泳不合适在脉冲凝胶电泳上分析电泳时Ladder扭曲配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置同时配置，电泳缓冲液高出液面1-2mm即可电泳时电压过高电泳时电压不应超过20V/CM
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mirna琼脂糖凝胶电泳注意事项
mirna琼脂糖凝胶电泳注意事项引言：mirna琼脂糖凝胶电泳是一种常用的实验方法，用于分离和检测小分子核酸mirna。
在进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验时，需要注意一些事项，以确保实验的准确性和可靠性。
本文将介绍mirna琼脂糖凝胶电泳的注意事项。
一、实验准备在进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验之前，首先需要准备实验所需的试剂和仪器设备。
确保琼脂糖、电泳缓冲液、样品等试剂的质量良好，并按照实验方案准备好所需的浓度和体积。
二、样品处理在进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验之前，需要对样品进行处理。
首先，需要从细胞或组织中提取mirna，并纯化得到纯净的mirna样品。
其次，需要对mirna样品进行定量，以确保加载合适的样品量。
三、样品加载样品加载是mirna琼脂糖凝胶电泳实验中的关键步骤。
在加载样品之前，需要根据实验设计合理地安排样品的顺序，以便于结果的分析和解读。
此外，需要在电泳缓冲液中加入适量的载体RNA，以增加样品的稳定性和可视性。
四、电泳条件在进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验时，需要注意电泳条件的选择。
首先，需要选择合适的电泳缓冲液和电泳温度，以确保样品在电泳过程中能够得到充分的分离。
其次，需要根据样品的大小和预期的分离效果，选择适当的电压和电泳时间。
五、染色和可视化实验完成后，需要对琼脂糖凝胶进行染色和可视化。
常用的染色方法有溴化乙锭染色和银染色。
选择合适的染色方法，并按照说明书的要求进行染色操作。
染色完成后，需要使用适当的仪器设备进行凝胶图像的拍摄和分析。
六、结果分析mirna琼脂糖凝胶电泳实验得到的结果需要进行准确的分析和解读。
首先，需要根据实验设计和样品加载的顺序，确定gel中mirna的迁移方向。
其次，需要根据样品的大小和迁移距离，判断mirna的相对表达水平。
最后，需要将实验结果与其他实验数据进行比较和分析，以获得更准确的结论。
七、实验记录和保存在进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验时，需要及时记录实验过程和结果。
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析DNA凝胶电泳简介一、实验原理DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。
根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。
2、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。
电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。
由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。
二、琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。
琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。
表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。
表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。
随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。
（5）其它类型。
各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。
琼脂糖凝胶电泳及其影响因素
琼脂糖凝胶电泳及其影响因素琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。
该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。
琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。
琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。
聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。
聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。
目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。
在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、 DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、 DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。
mirna琼脂糖凝胶电泳注意事项
mirna琼脂糖凝胶电泳注意事项
进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验时，需要注意以下事项：
1. 准备样品：将样品提取并纯化，保证样品的质量和纯度。
2. 准备琼脂糖凝胶：根据实验需要选择合适的琼脂糖浓度和凝胶百分比，并根据凝胶大小决定所需的凝胶缓冲液量。
3. 加载样品：将样品与加载缓冲液混合，并将混合物小心地加入琼脂糖凝胶槽中。
注意不要产生气泡。
4. 设置电泳条件：根据实验需要设置合适的电流、电压和电泳时间。
适当的条件可以获得更好的电泳结果。
5. 预处理凝胶：在电泳之前，将凝胶浸泡在凝胶缓冲液中预处理一段时间，以确保凝胶与缓冲液充分交换。
6. 安全使用电源：在使用电源之前，确保电源连接正确，并按照安全操作规程操作，以避免电击或火灾等意外。
7. 注意数据分析：电泳完成后，将凝胶拍照或进行图像扫描，并进行数据分析。
确保准确测量和比较样品之间的迁移距离和强度。
8. 实验后处理：实验结束后，处理琼脂糖凝胶和化学品废弃物时，要按照相关的安全规定和环保要求进行处理。
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不规则DNA带迁移
电泳条件不合适
电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换
DNA变性
电泳前勿加热，用20mM Nacl缓冲液稀释DNA
DNA上样量过多
减少凝胶中DNA上样量
DNA含盐过高
电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分
有蛋白污染
电泳前酚抽提去除蛋白
DNA变性
电泳前勿加热，用20mM Nacl缓冲液稀释DNA
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
分子大小相近的DNA带不易分辨
增加电泳时间，核准正确凝胶浓度
DNA变性
电泳前勿加热，用20mM Nacl缓冲液稀释DNA
DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适
在脉冲凝胶电泳上分析
电泳时Ladder扭曲
配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置
同时配置，电泳缓冲液高出液面1-2mm即可
电泳ห้องสมุดไป่ตู้电压过高
电泳时电压不应超过20V/CM
带弱或无DNA带
DNA上样量不够
增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低
DNA降解
实验过程避免核酸酶污染
DNA跑出凝胶
缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
EB染色的DNA，所用光源不合适
应用短波长（254nm）的紫外光源
DNA带缺失
DNA跑出凝胶
缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
琼脂糖凝胶电泳常见问题
常见问题
原因
对策
DNA条带模糊
DNA降解
实验过程避免核酸酶污染
电泳缓冲液陈旧
电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。TBE建议使用10次就更换缓冲液
所用电泳条件不合适
电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换