免疫学试验课沉淀反应
医学免疫学 沉淀反应
成对孔
Ag
Ab A B C D E F
应用
定性：沉淀线的有无
相对浓度：沉淀线的位置（靠近浓度小的一侧） 相对扩散率：沉淀线的形状（弯向扩散慢的一侧）
三角形孔
Ab Ag1 Ab Ag1 Ab
Ag1
Ag2
Ag2
Ag2
沉淀线吻合：两种 抗原完全相同
沉淀线相交：两种 抗原完全不同
沉淀线相切：两种抗 原之间部分相同
凝胶的制备
• 原料 – 固体粉末（琼脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺） – 电解质液 • 过程 按要求把一定比例（1%）的固体粉末与电解质液混 合，加热助溶，冷却，形成具有三维空间网孔的半固体结构 • 性质 – 实为流动的液相 – 网孔的大小与凝胶的浓度成反比 – 小分子的颗粒在凝胶中自由运动，动力来源于物质的浓 度差，而大分子物质的运动则受到网孔的限制
沉淀反应
基本概念
• 沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体在适当条件下反应生成沉 淀物 • 特点 – 反应物可溶（溶液） – 生成物为沉淀（抗原抗体均为多价，相互结合，形成空 间网格，体积变大而从溶液中析出） – 抗原抗体的比例对试验现象的影响明显 • 类型
液相沉淀试验
反应场所 检测方法
凝胶扩散试验 凝胶免疫电泳试验
单向琼脂扩散试验
• 原理
Байду номын сангаас
待测抗原在含在一定量的抗体中自由扩散 在抗原抗体比例合适处形成大分子的抗原抗体复合物而 被限制在网孔中，形成肉眼可见的沉淀环 待测抗原与沉淀环的直径成正比
方法评价
定量检测物质、方法稳定、简便、无需特殊仪器 灵敏度稍差
Ab
双向琼脂扩散试验
• 原理 – 抗原抗体在凝胶中自由扩散，发生相遇 – 在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线 • 类型 – 成对孔、三角形孔、梅花形孔
免疫学和免疫学检验：沉淀反应.
免疫学和免疫学检验：沉淀反应沉淀反应（precipetaiton）是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反。
早在1897年Kraus就发现，细菌培养液与相应抗血清混合时可发生沉淀反应（precipetaiton）是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反。
早在1897年Kraus就发现，细菌培养液与相应抗血清混合时可发生沉淀反应。
1905年Bechhold把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行。
Oudin（1946）报告了试管免疫扩散技术，Mancini（1965）提出单向免疫扩散技术，使定性免疫试验向定量化发展。
另一方面，免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微量、自动化的新阶段。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段发生抗原抗体特异性结合，第二阶段形成可见的免疫复合物（参见第九章）。
经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等来判定结果，称为终点法；而快速免疫浊度法则在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法。
现代免疫技术（如各种标记免疫技术）多是在沉淀反应的基础上建立起来的，因此沉淀反应是免疫学方法的核心技术。
第一节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验絮状沉淀试验为历史较久，又较有用的方法。
该法要点是：将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合，形成絮状沉淀物。
这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响，因而产生了两种最适比例的基本测定方法。
（一）抗原稀释法抗原稀释法（Dean-Webb法）是将可溶性抗原作一系列稀释，与恒定浓度的抗血清等量混合，置室温或37℃反应后，产生的沉淀物随抗原的变化而不同。
表12-1系以牛血清白蛋白为例的实验结果。
表12-1Dean-Webb定量沉淀试验管号抗原抗体总沉淀量反应过剩物抗原沉淀量抗体沉淀量沉淀中Ab/Ag1 0.003 0.68 0.093 Ab 0.003 0.090 30.02 0.005 0.68 0.145 Ab 0.005 0.140 28.03 0.011 0.68 0.249 Ab 0.011 0.238 21.74 0.021 0.68 0.422 Ab 0.021 0.401 19.15 0.032 0.68 0.571 Ab 0.032 0.539 16.86 0.043 0.68 0.734 － 0.043 0.691 16.17 0.064 0.68 0.720 Ab －－－8 0.085 0.68 0.601 Ag －－－9 0.171 0.68 0.464 Ag －－－10 0.341 0.68 0.368 Ag －－－单位：mmol/L 从表12-1可以看出，1～5管为抗体过剩管，7～10管为抗原过剩管，唯第6管沉淀物最多，两者之比为16:1，即最适比。
5章 沉淀反应(免疫学)
3.方法评价
操作简便。 灵敏度较高，比双扩高约10倍。 分辨率低于双扩。
4. 临床应用
常用于抗原或抗体的定性分析、效价测定和纯度鉴 定等
(二) 火箭免疫电泳
火箭免疫电泳 是将单向免疫扩散和电泳相结合，在电场中
加速定向扩散的单向免疫扩散技术，由于其沉淀形
似火箭，故称为火箭电泳。
1. 基本原理
一、透射免疫比浊法
（transmission turbidimetry）
(一) 基本原理
抗原抗体结合后形成的CIC引起液体介质出 现浊度改变，光线的透过量减少，被吸收 光线量与CIC形成量呈正相关，依所测吸光 度值推算待测抗原的量 。
二、散射免疫比浊法
（nephelometry）
1967年， Ritchie等
方法稳定、简便的方法，不需特别仪器设 备，重复性好，但灵敏度稍差(1.25mg/L)。
（四）临床应用
1．血清学诊断:出现沉淀线，表明存在相应的Ag或Ab.
2.
免疫化学分析:浓度、分子量、纯度、反应性 沉淀线靠近抗原孔，提示抗体含量高；反之则反
出现多条沉淀线，则说明抗原和抗体皆不是单 一成分。可用于鉴定抗原或抗体的纯度。
三、速率抑制免疫比浊法
(rate inhibition immunoturbidimetry)
是一种竞争性结合试验，主要用于测定半抗原和 药物等小分子物质。
试验时先将一定量的已知半抗原-载体（大分子） 与限量的特异性抗体发生反应，生成的免疫复合 物可形成一定的速率散射峰值。
待测抗原与抗体竞争结合，速率散射峰值降低， 降低程度与标本中的待测半抗原成正比。
第5章 沉淀反应 Precipitation
医学免疫学沉淀反应实验报告
医学免疫学沉淀反应实验报告一、实验目的1、掌握沉淀反应的基本原理和操作方法。
2、熟悉琼脂扩散试验和免疫比浊法的应用。
3、观察沉淀反应的结果，理解抗原抗体反应的特异性和定量关系。
二、实验原理沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下结合，形成肉眼可见的沉淀物的反应。
根据反应介质和检测方法的不同，沉淀反应可分为液相沉淀反应和凝胶内沉淀反应。
液相沉淀反应包括絮状沉淀试验和免疫浊度测定。
絮状沉淀试验是将抗原和抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成絮状沉淀物。
免疫浊度测定则是通过测量溶液中抗原抗体复合物形成导致的浊度变化，来定量检测抗原或抗体的含量。
凝胶内沉淀反应常用的是琼脂扩散试验，包括单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。
单向琼脂扩散试验是将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，制成琼脂板，然后在板上打孔，加入抗原，抗原在凝胶中向四周扩散，与抗体形成沉淀环。
沉淀环的直径与抗原浓度成正比，可通过测量沉淀环的直径来计算抗原的含量。
双向琼脂扩散试验是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶的不同孔中，两者在凝胶中扩散，形成沉淀线，用于检测抗原和抗体的特异性以及它们之间的相对分子量。
三、实验材料1、试剂抗原：人血清白蛋白（HSA）、羊抗人血清白蛋白抗体（抗HSA）。
生理盐水。
琼脂糖。
巴比妥缓冲液。
2、器材载玻片。
打孔器。
移液器。
分光光度计。
四、实验步骤（一）絮状沉淀试验1、取两支试管，分别标记为“抗原管”和“对照管”。
2、在“抗原管”中加入 05ml 抗原溶液（HSA），在“对照管”中加入05ml 生理盐水。
3、向两支试管中分别加入05ml 抗体溶液（抗HSA），轻轻摇匀。
4、室温放置 10-20 分钟，观察两支试管中溶液的变化。
（二）单向琼脂扩散试验1、制备琼脂板：称取一定量的琼脂糖，加入巴比妥缓冲液，加热溶解，制成 1%的琼脂糖溶液。
将溶液倒入载玻片上，使其均匀铺开，形成厚度约 2-3mm 的琼脂板，待琼脂凝固后打孔。
沉淀反应(免疫学检验课件)
沉淀反应
沉淀反应
(precipitation)
可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的 浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异 结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的 沉淀现象。
反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen） 可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素 （precipitin）。
❖ (3)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果 数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。
❖ (4)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测需抗原－ 抗体温育反应时间，检测时间较长。
❖ (5)检测用的抗体一般应选择亲和力较高的抗体，且在 检测中应保证抗体过量。
退。实际上在电泳的过程中受
负电荷多
－
电泳力 ＞
电渗力
抗体 负电荷少
电泳力 ﹤ 电渗力
+
步骤：
制板
3－4ml琼脂
打孔
孔间距3mm
加样
约7ul
抗体
抗原
电泳
总电流＝4mA x 1cm/板宽 x N(板数） 20—30分钟
三、免疫电泳技术
免疫电泳技术的用途
是散射比浊法的改良。一般在30～120min内比 浊
用于免疫沉淀反应的缺陷
(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测 样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确
(2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快 速检测。
(3) 终点法存在反应本底（空白管），测定样本的含量 越低，本底比例越大，故在微量测定时，本底的干 扰是影响准确测定的重要因素。
（4）若反应时间过长，IC聚合形成沉淀则导致散射值 偏低。故需掌握最适时间比浊。
沉淀反应临床免疫学和免疫检验
沉淀反应沉淀反应蛋白质、多糖、毒素等可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合，出现的沉淀现象，称为沉淀反应。
沉淀反应的特点液体内沉淀试验凝胶内沉淀试验免疫电泳技术沉淀反应的特点差异凝集反应沉淀反应抗原性质颗粒性抗原可溶性抗原反应时间数分钟数小时反应产物凝集物沉淀物敏感性高低液体内沉淀试验受抗原抗体比例的影响非常明显，常用作测定抗原抗体的最适比例。
有抗原稀释法、抗体稀释法和棋盘滴定法。
免疫浊度测定应用抗原、抗体在液相中反应后形成的免疫复合物微粒对光线的干扰，利用仪器进行定量检测的一种方法。
在一定范围内，吸光度与免疫复合物的量呈正相关。
免疫浊度测定的影响因素1.抗原抗体比例当反应液中抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
2.抗体的质量要求：抗体的特异性强、效价高、亲和力强。
R型＞H型。
3.抗原抗体反应的溶液pH6.5～8.5，磷酸盐缓冲液。
4.增浊剂聚乙二醇（PEG）、吐温-20，可消除抗原或抗体分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。
免疫比浊方法分类透射和散射免疫比浊法免疫胶乳比浊法凝胶内沉淀试验单向免疫扩散试验Mancini曲线：适用大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果；公式：c／d2＝k。
Fahey曲线：适用于小分子抗原和较短时间（＜24h）扩散的结果处理，用半对数纸画线。
公式：logc／d＝k。
双向免疫扩散试验免疫电泳技术免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。
1.加快了反应速度2.集中了扩散方向3.分开了不同的蛋白火箭免疫电泳免疫电泳免疫固定电泳免疫固定电流模式图沉淀反应在医学检验中的应用方法评价应用经典沉淀反应操作繁琐、敏感度低、精密度差、时间长和难以自动化逐渐减少【习题】下列哪项不是沉淀反应的特点A.其特性与经典抗原抗体反应相同B.抗原是可溶性抗原C.反应可分为两个阶段D.抗体是McAbE.需一定电解质『正确答案』D『答案解析』沉淀反应抗体不是单克隆抗体。
医学免疫学实验指导：沉淀反应
医学免疫学实验指导：沉淀反应【内容】六、环状沉淀试验七、单向免疫扩散试验八、双向免疫扩散试验九、对流免疫电泳试验十、火箭免疫电泳试验十一、免疫电泳试验可溶性抗原（如毒素、血清蛋白、细胞碎片）与相应抗体特异性结合，在两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
可溶性抗原与相应抗体相比，抗原分子小，故抗原的反应面积大，为使抗原抗体比例适当，一般应稀释抗原。
试验、环状沉淀试验（Ring precipitation test）将高浓度的抗血清置于直径较小的环状沉淀管中，再缓缓加入血清，使二者间有一清晰界面。
如抗原抗体相对应，一段时间后，在液面交界处可形成白色沉淀环。
此试验常用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、鉴定血迹、测定媒介昆虫的嗜血习性等。
【材料】1、兔抗人血清、人血清、牛血清、生理盐水。
2、毛细吸管、环状沉淀管及环状沉淀管架。
【方法】1、取环状沉淀管三支置于环状沉淀管架上，做好标记。
用毛细吸管加入兔抗人血清各0.2ml于管底。
2、用毛细吸管分别吸取人血清、牛血清、生理盐水0.2ml，沿试管壁缓缓加入三支沉淀管，使两层液体之间有一明显的交界面。
3、室温下静置10~20分钟，观察结果。
【结果】观察各管两层液体交界面有无白色沉淀环出现，有白色沉淀环的为阳性。
（图4—5）【注意事项】加下层兔抗人血清时应注意将毛细吸管管口置于沉淀管底，避免气泡产生；加上层液体时毛细吸管不能接触到下层液体，吸管口靠在沉淀管壁上缓缓加入，否则不能形成清晰界面。
试验、单向免疫扩散试验（Single immunodiffusion test）此试验属定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。
试验中先将某种已知抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，将需检测的一定量的抗原加入孔中。
在反应过程中，抗体已经均匀分布在琼脂板中，只有抗原向四周呈辐射状扩散，故称为单向免疫扩散试验。
临床免疫学与检验课件：沉淀反应
火箭免疫電泳
影響因素
1.瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規 則。 2.電泳終點時間的確定。 3.標本數量多時應先通電後加樣,防止寬底峰形. 4.IgG定量時，可用甲醛與IgG上的氨基結合（甲 醯化），抵消了電滲作用。
火箭免疫電泳示意圖
+
-
火箭免疫電泳圖 ①②③④為標準抗原；⑤⑥為標本
三、免疫電泳
電泳時凝膠中抗體不移動，樣品孔中的 抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減 少，抗原泳動的基底區越來越窄，抗原 抗體分子複合物形成的沉澱線逐漸變窄， 形成一個形狀如火箭的不溶性複合物沉 澱峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗 原量呈正相關。
火箭免疫電泳
技術要點
1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗 血清，混勻後制板，打孔，孔內加待測樣 品，樣品孔放負極側， 6h後觀察瓊脂板 上沉澱峰，繪製標準曲線，求出待測樣品 濃度。
單向擴散試驗（平板法）
傾注平板 打孔 加樣 放置37℃ 24～48h觀察沉澱環
單向擴散試驗 （平板法）
沉澱環的直徑與待測標本含量兩種計算方法
Mancini曲線： 大分子抗原（IgM）
時間擴散＞48h， 常數K＝C∕d2 普通座標紙曲線
Fahey曲線： 小分子抗原（IgG,IgA）
擴散時間24h 常數K＝logC∕d 半對數座標紙曲線
單克隆抗體；多克隆抗體； 可出現假性降低與增高
• 雙環現象
不同擴散率抗原性相同的兩個 組分
單向擴散試驗 上排為5個不同濃度的參考品； 下排為患者血清，下排右2為異常病 理血清
二、雙向擴散試驗 （平板法）
鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一
原理：將抗原抗體 分別加在瓊脂糖 不同的對應孔中， 兩者在凝膠中自 由擴散，在比例 合適處形成白色 沉澱線。